CN101010424A

CN101010424A - 生产异源蛋白酶的改进方法

Info

Publication number: CN101010424A
Application number: CNA2005800282859A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂恩·T·乔根森; 尼尔斯·班克; 莫根斯·沃普尔曼
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2004-06-21
Filing date: 2005-06-20
Publication date: 2007-08-01
Also published as: EP1766000A1; US20070259404A1; WO2005123914A1

Abstract

本发明提供在革兰氏阳性表达宿主细胞中生产S2A(或S1E)蛋白酶的改进方法，该方法包括以下步骤：(a)以补料分批发酵将包含至少一种编码异源S2A/S1E蛋白酶的多核苷酸的革兰氏阳性细胞在有益于生产蛋白酶的条件下进行培养，其中所述培养过程的至少20％发生在36.5℃以下的温度下；和(b)回收所述蛋白酶。

Description

生产异源蛋白酶的改进方法

发明领域

许多微生物来源的相关蛋白酶特别难于以工业相关的产量进行生产，它们可能倾向于各种类型的降解和/或不稳定性。本发明提供了在革兰氏阳性表达宿主细胞中生产S2A(或S1E)蛋白酶的改进方法。

背景

具有蛋白酶活性的多肽，或蛋白酶，有时也称作肽酶，蛋白质酶，肽水解酶，或蛋白水解酶。蛋白酶可以是外切型的，其在肽的两端上起始水解肽，或是内切型的，其在多肽链中内部起作用(内肽酶)。内肽酶显示对于N-和C-末端封闭的肽底物的活性，所述底物对于所研究蛋白酶的特异性相关。

蛋白酶是水解肽键的酶。它包括属于EC3.4酶族的任何酶(包括其十三种亚类中的每一种)。EC编号指来自NC-IUBMB的酶命名法(EnzymeNomenclature)1992，Academic Press，San Diego，California，Eur.J.Biochem.1994，223，1-5的公开出版的增刊1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650。该命名法有规律地进行补充和升级；见例如国际互联网于 http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html上。

基于它们的催化机制将蛋白酶分入下列各组：丝氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬蛋白酶(A)，金属蛋白酶(M)，和未知的，或尚未分类的蛋白酶(U)，见Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(eds)，Academic Press(1998)，特别是在综合介绍部分。

丝氨酸蛋白酶是普遍存在的，发现于病毒，细菌和真核生物中；它们包括外肽酶，内肽酶，寡肽酶和omega-肽酶活性。已经鉴定了超过20个家族(表示为S1-S27)的丝氨酸蛋白酶，基于结构相似性和功能证据，这些分成6个集群，表示为SA，SB，SC，SE，SF，和SG(Barrett等人1998.Handbook ofproteolytic enzymes)。对于至少四种所述集群来说结构是已知的(SA，SB，SC和SE)，这些看起来完全不相关，提示丝氨酸肽酶的至少四种进化起源。α-裂解性内肽酶属于胰凝乳蛋白酶(chymotrypisin)(SA)集群(clan)，其中它们被指定为S2家族(S2A)的A亚族。

蛋白水解酶的另一种分类系统是基于序列信息，并且因此在分子生物学领域更加常用；它在Rawlings，N.D.等人，2002，MEROPS：蛋白酶数据库.Nucleic Acids Res.30：343-346中得以描述。MEROPS数据库可以在http://www.merops.ac.uk上通过电子手段自由获得。根据MEROPS系统，在′The Handbook of Proteolytic Enzymes′中分类为S2A的蛋白水解酶，在MEROPS中被分类为′S1E′蛋白酶(Rawlings ND，Barrett AJ.(1993)Evolutionary families of peptidases，Biochem.J.290：205-218)。

许多源自各种拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)物种的工业上感兴趣的S2A/S1E蛋白酶难以在优选的工业化革兰氏阳性表达宿主细胞中通过重组生产进行大量生产。对于酶工业来说甚至这种蛋白质生产产量的递增的改善也是令人高度感兴趣的。本发明提供了在革兰氏阳性宿主细胞中生产S2A/S1E蛋白酶的改进方法，其带来较高的产量。

发明概述

本发明人发现降低发酵温度，对于发酵整个过程(时间(duration))或在发酵的部分中，低于革兰氏阳性微生物工业发酵通常所采用的37℃，导致显著的产量提高。

因此，在第一方面，本发明涉及在革兰氏阳性宿主细胞中生产异源S2A/S1E蛋白酶的方法，该方法包括以下步骤：

(a)以补料分批发酵将包含至少一个编码异源S2A/S1E蛋白酶的多核苷酸的革兰氏阳性细胞在有益于生产蛋白酶的条件下进行培养，其中所述培养过程的至少20％发生在低于36.5℃的温度下；和

(b)回收所述蛋白酶。

定义

根据本发明可以采用本领域技能之内的常规分子生物学，微生物，和重组DNA技术。这些技术在文献中得以充分解释。见，例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(herein“Sambrook等人，1989”)DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes Iand II/D.N.Glover ed.1985)；OligoNucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；核酸杂交(B.D.Hames & S.J.Higgins eds(1985))；Transcription AndTranslation(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.(1984))；AnimalCell Culture(R.I.Freshney，ed.(1986))；Immobilized Cell And Enzymes(IRL Press，(1986))；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)。

“多肽”是从5’向3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源，在体外合成，或由天然和合成性分子的组合而制备。

“核酸分子”或“核苷酸序列”指单链形式，或双链螺旋的核糖核苷(腺嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷，尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺嘌呤核苷，脱氧鸟嘌呤核苷，脱氧胸腺嘧啶核苷或脱氧胞嘧啶核苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式。双链DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅仅指分子的一级和二级结构，并不将它限制到任何特定的三级或四级形式。因而，这一术语包括特别是在线性或环状DNA分子(例如，限制性片段)，质粒，和染色体中发现的双链DNA等。在讨论特定双链DNA分子的结构时，本文可以根据正常的惯例，即只给出DNA非转录链5’到3’方向上的序列(即，具有与mRNA同源的序列的链)。“重组DNA分子”是已经进行过分子生物学操作的DNA分子。

当核酸分子的单链形式能够在合适的温度和溶液离子强度条件下退火到其它核酸分子上时，核酸分子与另一个核酸分子“可杂交”(hybridizable)，如cDNA，基因组DNA，或RNA(见Sambrook等人，同上)。温度和溶液离子强度条件决定了杂交的“严格性”。

为了本发明的目的，杂交表示核苷酸序列在极低到极高严格性条件下杂交到标记的多核苷酸探针上，所述探针与SEQ ID NO’s：3，5，9，13，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，或39中显示的核苷酸序列杂交。在这些条件下多核苷酸探针杂交的分子可以通过X线胶片或通过本领域已知的任何其它方法来检测。不论何时在本文中使用术语“多核苷酸探针”要理解这种探针包含至少15个核苷酸。

在一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO’s：3，5，9，13，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，或39其中之一的至少15个核苷酸的片段的互补链。在另一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是编码SEQ ID NO’s：2，12，14，16，18，20，22，24，或26的多肽的任何核苷酸序列的互补链的至少15个核苷酸的片段。在另一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO’s：3，5，9，13，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，或39的互补链。在又一个令人感兴趣的实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO’s：3，5，9，13，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，或39的成熟多肽编码区的互补链。

对于至少100个核苷酸长的长探针，极低到极高严格性的条件被定义为按照标准的Southern印迹操作，在42℃于5X SSPE，1.0％SDS，5XDenhardt’s溶液，100微克/ml经剪切和变性的鲑鱼精DNA中预杂交和杂交。优选地，至少100个核苷酸的长探针并不包含大于1000个核苷酸。对于至少100个核苷酸长的长探针，最后用2×SSC，0.1％SDS于42℃(极低严格性)将载体材料洗涤三次每次15分钟，优选用0.5×SSC，0.1％SDS于42℃(低严格性)将载体材料洗涤三次每次15分钟，更加优选用0.2×SSC，0.1％SDS于42℃(中等严格性)洗涤三次每次15分钟，还要更加优选用0.2×SSC，0.1％SDS于55℃(中等-高度严格性)洗涤三次每次15分钟，最优选用0.1×SSC，0.1％SDS于60℃(高度严格性)洗涤三次每次15分钟，特别是用0.1×SSC，0.1％SDS于68℃(极高度严格性)洗涤三次每次15分钟。

尽管并不特别优选，预期还可以使用较短的探针，例如长度为从大约15到99个核苷酸的探针，如从大约15到大约70个核苷酸。对于这些短探针，严格性条件被定义为按照标准的DNA印迹操作，在低于利用Bolton andMcCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA48：1390)的计算而计算出的Tm5℃到10℃的温度下于0.9M NaCl，0.09MTris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP，和0.2mg酶母RNA/ml中进行预杂交，杂交，和杂交后洗涤。

对于长度为大约15个核苷酸到99个核苷酸的短探针，在6X SCC加0.1％SDS中将载体材料洗涤一次15分钟并且利用6X SSC在低于计算的Tm5℃到10℃的温度下洗涤两次每次15分钟。

DNA“编码序列”或“开放阅读框(ORF)”是双链DNA序列，当被置于合适的调控序列下时，其在细胞中体外或体内被转录并被翻译为多肽。通过在5’(氨基)末端的起始密码子和在3’(羧基)末端上的翻译终止密码子来确定编码序列的边界。编码序列可以包括，但不限于，原核生物序列，来自真核生物mRNA的cDNA，来自真核生物(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，甚至是合成性的DNA序列。如果欲将编码序列用于在真核细胞中表达，通常会将多腺苷信号和转录终止序列定位于编码序列的3’。

“表达载体”是线性或环状的DNA分子，其包含编码目标多肽的片段，所述片段可操作性地连接到提供其转录的其它片段上。这种其它的片段可以包括启动子和终止子序列，和任选的一个或多个复制起点，一个或多个可选择的标记，增强子，多腺苷化信号，等等。表达载体一般源自质粒或病毒DNA，或可以包含二者的元件。

转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子，增强子，终止子，等等，其提供宿主细胞中编码序列的表达。在真核细胞中，多腺苷化信号是控制序列。

“分泌信号序列”是编码多肽(“分泌性肽”)的DNA序列，其作为较大多肽的组分，导引较大多肽通过合成它的细胞的分泌途径。在通过分泌途径转运的过程中较大的多肽通常被切割以去除所述分泌性肽。对于本发明的目的来说优选的分泌信号是SEQ ID NO：2中所示的信号序列。

术语“启动子”对于其技术领域认可的意义是用来表示包含DNA序列的基因的部分，所述DNA序列提供RNA聚合酶的结合和转录的起始。启动子序列一般，但不总是在基因的5’非编码区中发现。

如果基因编码的多肽不再能够以功能性形式表达则染色体基因成为非功能性的。这种基因的非功能性可以由本领域已知的许多遗传操作进行诱导，其中一些在Sambrook等人(见上)中得以描述。如突变一样，在基因的ORF内的部分缺失经常将会致使基因成为非功能性的。

“可操作性连接的”，当提到DNA片段时，表示所述片段是这样排列的，即使得它们对于其所希望的目的而一致地起作用，例如转录在启动子中起始并穿过编码片段继续进行到终止子。

当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时编码序列在细胞中的转录和翻译控制序列“控制之下”，其随后被trans-RNA剪切并翻译成由编码序列编码的蛋白质。

“异源”DNA指并非天然定位于细胞中，或在细胞染色体位点中的DNA。优选地，异源DNA包括所述细胞外来的基因。

本文所用的术语“核酸构建体”意欲表示cDNA，基因组DNA，合成性DNA或RNA起源的任何核酸分子。术语″构建体″意欲表示可以是单链或双链的核酸片段，并且其可以基于完全或部分天然发生的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码目标多肽。所述构建体可以任选地包含其它核酸片段。

编码本发明的多肽的本发明的核酸构建体可以适当地为基因组或cDNA起源的，例如通过制备基因组或cDNA文库和筛选编码多肽的全部或部分的DNA获得的核苷酸构建体，所述筛选是通过根据标准技术利用合成性寡核苷酸探针的杂交进行的(cf.Sambrook等人，同上)。

编码本发明的多肽的本发明的核酸构建体可以适当地为基因组或cDNA起源的，例如通过制备基因组或cDNA文库并且通过杂交筛选编码全部或部分多肽的DNA序列而获得，所述杂交是按照标准技术(参见Sambrook等，同上)利用合成性寡核苷酸探针进行的。

编码本发明的多肽的本发明的核酸构建体还可以通过确立的标准方法，例如由Beaucage and Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1869所述的phosphoamidite方法，或由Matthes等人，EMBO Journal 3(1984)，801-805所述的方法而合成性地进行制备。根据phosphoamidite方法，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，进行纯化，退火，连接并克隆在合适的载体中。

另外，核酸构建体可以是根据标准技术，通过连接合成性，基因组或cDNA起源(根据合适的)的片段而制备的混合的合成性和基因组，混合的合成性和cDNA或混合的基因组和cDNA起源的，所述片段对应于完整核酸构建体的各部分。还可以通过例如在US 4,683,202或Saiki等人，Science239(1988)，487-491中所述的利用特异性引物进行的聚合酶链式反应而制备的核酸构建体。

当核酸构建体包含本发明的编码序列表达所必需的控制序列时，术语核酸构建体可以与术语“表达盒”同义。

术语“控制序列”在这里被定义为包括对于核酸序列的编码序列的表达所必需或有益的所有组分。每种控制序列都可以是对于编码多肽的核酸序列天然的或外来的。这些控制序列包括，但不限于，前导序列，多腺苷化序列，前肽序列，启动子，信号序列，和转录终止子。至少，所述控制序列包括启动子，和转录和翻译终止信号。为了导入有助于控制序列与编码多肽的核酸序列编码区的连接的特异性限制位点的目的，可以用接头来提供控制序列。

控制序列可以是合适的启动子序列，即被宿主细胞识别的核酸序列，以便核酸序列的表达。启动子序列包含介导多肽表达的转录和翻译控制序列。启动子可以是在选定宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列并且可以获自编码对于宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

控制序列还可以是合适的转录终止子序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列可操作性地连接到编码多肽的核酸序列的3’末端。在选定宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明。

控制序列还可以是多腺苷化序列，即可操作性地连接到核酸序列的3’末端的序列，并且当其转录时，被宿主细胞作为信号识别以便向转录的mRNA中添加多腺苷残基。在选定宿主细胞中起作用的任何多腺苷化序列都可以用于本发明。

控制序列还可以是信号肽编码区，其编码连接到多肽氨基末端上的氨基酸序列，它能够导引表达的多肽进入宿主细胞的细胞分泌途径。核酸序列的编码序列的5’端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码区片段天然相连接的信号肽编码区，所述编码区编码分泌的多肽。或者，编码序列的5’端可以包含信号肽编码区，所述信号肽编码区对于编码分泌多肽的编码序列部分来说是外源的。当编码序列未正常地包含信号肽编码区时，外源的信号肽编码区可能是必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地替换天然信号肽编码区以便相对于正常情况下与编码序列关联的天然信号肽编码区而获得增强的外蛋白(exo protein)的分泌。信号肽编码区可以获自来自曲霉属(Aspergillus)物种的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，来自根毛霉属(Rhizomucor)物种的脂酶或蛋白质酶基因，来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的α-因子基因，来自芽孢杆菌属(Bacillus)物种的淀粉酶或蛋白酶基因，或小牛前凝乳酶原(preprochymosin)基因。不过，任何能够将表达多肽导引入选定宿主细胞的分泌途径中的信号肽编码区都可以用于本发明中。

控制序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端上的氨基酸序列。得到的多肽称为前酶或前多肽(或在一些情况中称为酶原)。前多肽一般是无活性的并且能够由前多肽上进行前肽的催化或自身催化剪切而转变成成熟活性多肽。前肽编码区可以获自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因(aprE)，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT)，酿酒酵母α-因子基因，或Myceliophthora thermophilum漆酶基因(WO 95/33836)。

可能还需要添加调控序列，其允许相对于宿主细胞的生长调控多肽的表达。调控系统的例子是引起基因表达反应于化学或物理刺激而开启或闭合的那些，所述刺激包括调控性化合物的存在。在原核系统中的调控系统将包括lac，tac，和trp操纵基因系统。

用于指导本发明的特别是在细菌性宿主细胞中的基因转录的合适启动子的例子，是获自大肠杆菌(E.coli)lac操纵子，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因(dagA)，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖(maltogenic)淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)，解淀粉芽孢杆菌BAN淀粉酶基因，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，和原核性β-内酰胺酶基因的启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80：21-25)。其它的启动子描述在″Useful proteins fromrecombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94；和在Sambrook等人，1989，同上中。

对于细菌性宿主细胞有效的信号肽编码区是获自来自芽孢杆菌属NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶基因，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因，地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因，地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因，嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)，和枯草芽孢杆菌PrsA基因的信号肽编码区。其它信号肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews 57：109-137所描述。

本发明还涉及包含本发明的核酸序列，启动子，转录和翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和控制序列连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个便利的限制性位点以便允许在这些位点上插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含所述序列的核酸构建体插入到合适的表达载体中来表达本发明的核酸序列。在生成表达载体的过程中，将编码序列定位于载体中从而使得编码序列与合适的控制序列可操作性地连接以便进行表达，和可能性的分泌。

重组表达载体可以是任何能够便利地进行重组DNA操作并且能够带来核酸序列的表达的载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择一般将依赖于载体与载体要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。载体可以是自主复制性载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制独立于染色体复制，例如，质粒，染色体外元件，小染色体，或人工染色体。载体可以包含确保自身复制的任何手段。或者，载体可以是当导入宿主细胞中时整合到基因组中并与其整合入的染色体一起复制的载体。载体系统可以是单载体或质粒或两个或多个载体或质粒，其在一起包含要导入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。

本发明的载体优选包含一种或多种可选择的标记，其使得可以轻易选择转化的细胞。可选择的标记是这样一种基因，其产物提供了杀虫剂或病毒抗性，对于重金属的抗性，对于营养缺陷型的原养型，等等。

抗生素可选择标记赋予对于诸如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素，四环素，新霉素，潮霉素或氨甲蝶呤的抗生素的抗性。对于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。

本发明的载体优选地包含允许载体，或载体的较小部分稳定整合入宿主细胞基因组中，或载体在细胞中独立于细胞基因组的自主复制的元件。

当导入宿主细胞中时，载体，或载体的较小部分如本发明的扩增单位，可以整合入宿主细胞基因组中。对于染色体整合来说，载体可以依赖于编码多肽的核酸序列或任何其它载体元件，以便通过同源或异源重组将载体稳定整合入基因组中。

或者，载体可以包含其它核酸序列用于通过同源重组入宿主细胞的基因组中来指导整合。所述其它核酸序列能够使得载体在染色体中的准确位置上整合入宿主细胞基因组中。为了提高在准确位置上整合的可能性，整合元件应当优选地包含足够数目的核酸，如100到1,500个碱基对，优选400到1,500个碱基对，最优选800到1,500个碱基对，其与对应的靶序列高度同源以便提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中靶序列同源的任何序列。而且，整合元件可以是非编码性或编码性核酸序列；适于通过同源重组的位点特异性整合的具体例子在WO 02/00907(Novozymes，丹麦)中给出，特此将其全部并入作为参考。

另一方面，可以通过非同源性重组将载体整合入宿主细胞的基因组中。这些核酸序列可以是与宿主细胞的基因组中靶序列同源的任何序列，而且，可以是非编码性或编码性序列。载体，表达盒，扩增单位，基因或事实上任何定义的核苷酸序列的拷贝数是在任何时间存在于宿主细胞中的相同拷贝的数目。基因或另一个定义的染色体核苷酸序列可以一个，两个，或多个拷贝存在于染色体上。自主复制性载体可以一个，或几百个拷贝/宿主细胞存在。

本发明的扩增单位是能够整合入宿主细胞染色体中的核苷酸序列，其后它可以通过多次复制而增加染色体整合拷贝数目。该单位包含本文所定义的表达盒，其包含至少一个拷贝的目标基因和如本文所定义的宿主细胞的染色体基因的可表达拷贝。当扩增单位整合入宿主细胞的染色体中时，它被定义为染色体的特定区域，其倾向于在DNA的两个直接重复区域之间通过同源重组进行复制。因而对扩增单位相对于侧翼DNA的精确边界作功能性限定，因为复制过程事实上可以根据重复区域内重组的精确位点复制DNA的部分，其可以被导入染色体中以及内源性染色体本身的部分中。这种原理在Janniére等人(1985，Stable gene amplification in the chromosome ofBacillus subtilis.Gene，40：47-55)得以阐明，将其并入本文作为参考。

对于自主复制，载体可以进一步包含复制的起点，其使得载体能够在所研究的宿主细胞中自主复制。细菌复制起点的例子是质粒pBR322，pUC19，pACYC177，pACYC184，pUB110，pE194，pTA1060，和pAMbetal的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的例子是复制的2micron起点，CEN6和ARS4的组合，和CEN3与ARS1的组合。复制起点可以是具有这样一种突变的起点，所述突变使得作用在宿主细胞中对于温度敏感(见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1433)。

本发明还涉及包含本发明的核酸序列的重组宿主细胞，其有利地用于多肽的重组生产中。术语″宿主细胞″包括亲本细胞的任何后代，其由于复制期间发生的突变与亲本细胞并不相同。

优选用包含本发明的核酸序列的载体来转化细胞，随后将载体整合入宿主染色体中。“转化”意指将包含本发明的核酸序列的载体导入宿主细胞中从而使得载体作为染色体整合部分或作为自身复制性的染色体外载体而维持。整合一般被认为是有利的，因为核酸序列更有可能稳定地维持在细胞中。载体整合入宿主染色体内可以通过如上所述的同源或非同源性重组而发生。

细菌宿主细胞的转化可以，例如，通过原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、通过利用感受态的细胞(参见，例如，Young和Spizizin，1961，细菌学杂志，81：823-829，或Dubnar和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology，56：209-221)、通过电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques，6：742-751)，或通过结合(conjugation)(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology，169：5771-5278)起作用。

在允许表达所需多肽的条件下将上述经转化或转染的宿主细胞培养在合适的营养培养基中，其后从细胞，或培养肉汤(culture broth)中回收得到的多肽。

用来培养细胞的培养基可以是合适于生长宿主细胞的任何常规培养基，如包含合适添加剂的基本或复合培养基。合适的培养基可获自商业供应商或可以根据公布的制作法来制备(例如在美国典型培养物保藏中心的目录中)。利用本领域已知的方法来制备培养基(见，例如，细菌和酵母的参考文献；Bennett，J.W.和LaSure，L.，editors，More Gene Manipulations inFungi，Academic Press，CA，1991)。

根据所研究多肽的类型，通过常规方法，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过盐例如硫酸铵的方式沉淀上清液或过滤物的蛋白质组分，通过多种层析方法，例如离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析，等等，来回收多肽。

可以利用本领域已知的对于多肽特异性的方法来检测所述多肽。这些检测方法可以包括使用特异性抗体，形成酶产物，或酶底物的消失。例如，可以利用酶测定试验测定多肽的活性。

可以通过本领域已知的多种方法来纯化本发明的多肽，包括，但不限于，层析(例如，离子交换，亲和，疏水，层析聚焦，和大小排阻)，电泳方法(例如，制备型等电聚焦(IEF)，差异溶解性(例如，硫酸铵沉淀)，或提取(见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，NewYork，1989)。

在本文中，术语“基本上纯的多肽”意指这样的多肽制品，其包含至多10％重量的其它多肽物质，它与所述其它多肽物质天然关联(优选更低百分比的其它多肽物质，例如至多8％重量，至多6％重量，至多5％重量，至多4％至多3％重量，至多2％重量，至多1％重量，和至多％重量)。因而，优选基本上纯的多肽为至少92％纯，即多肽由存在于制品中的至少92％重量比的总多肽物质组成，优选更高的百分比，如至少94％纯，至少95％纯，至少96％纯，至少96％纯，至少97％纯，至少98％纯，至少99％，和至多99.5％纯。本文公开的多肽优选是基本上纯的形式。特别地，优选本文公开的多肽是“基本上纯的形式”(essentially pure form)，即多肽制品基本上不含它天然关联的其它多肽物质。这可以，例如，通过公知的重组方法来制备多肽而实现。这里，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。

在本文中，两种氨基酸序列或两种核苷酸序列之间的同源性通过参数“同一性”来描述。为了本发明的目的，可以使用完全Smith-Waterman比对来进行序列的比对和同源性分值的计算，所述比对可用于蛋白质和DNA比对。对于蛋白质和DNA比对分别使用默认的计分矩阵BLOSUM50和同一性矩阵。对于缺口(gap)中第一残基的罚分，蛋白质为-12而DNA为-16，而对于缺口中的其它残基的罚分，蛋白质为-2而DNA为-4。可以用FASTA包v20u6版(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools forBiological Sequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA″，Methods in Enzymology，183：63-98)来进行比对。

可以利用“ClustalW”(Thompson，J.D.，Higgins，D.G and Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitvity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Research，22：4673-4680)进行蛋白质序列的多重比对。可以利用蛋白质比对作为模板进行DNA序列的比对，用来自DNA序列的相应密码子来替换氨基酸。

在本文中，术语“等位基因变体”表示出现在相同染色体位置上基因的两个或多个选择性形式。等位基因变异通过突变天然出现，并且可以导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有改变)或可以编码具有变化氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因等位变体编码的多肽。等位基因变体包括在本文的功能性同源物的定义中。

S2A/S1E蛋白酶或其功能性同源物可以是由天然来源鉴定和分离的野生型蛋白质。这种野生型蛋白酶可以通过本领域已知的标准技术进行特异性筛选。另外，编码S2A/S1E蛋白酶，或其功能性同源物的基因，可以通过DNA改组技术来制备，如在J.E.Ness等人Nature Biotechnology 17，893-896(1999)中所述。而且，S2A/S1E蛋白酶，或其功能性同源物，可以是人工变体。这种人工变体可以通过本领域已知的标准技术来构建，如通过定点/随机突变。在本发明的一个实施方案中，氨基酸变化(在人工变体以及在野生型多肽中)是性质改变最小的，其是不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小的缺失，一般为一个到大约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；高达大约20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变静电或另一种功能，如多组氨酸通道(tract)，抗原表位或结合结构域而有利于纯化。

保守性置换的实例限于碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸)、芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。通常不改变特异性活性的氨酸酸取代是本领域已知的并且由，例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，The Proteins，Academic Press，New York所描述。最常发生的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Iys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly以及逆向的这些。

对本领域技术人员而言显然可以在分子的关键功能区域之外进行这样的取代而仍可得到有活性的多肽。由本发明的核苷酸序列编码的多肽活性所必需的，和因此优选不进行修饰，如取代的氨基酸残基，可以按照诸如定点突为或丙氨酸扫描突变(alanine-scanning mutagenesis)的本领域已知的方法来确定(见，例如，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1080-1085)。在后一种技术中，在分子中每一带正电的残基上均引入突变，测定所得的突变分子的活性从而确定对于分子活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过诸如核磁共振分析、结晶学或光亲和标记(photoaffinitylabelling)等技术确定的三维结构的分析来确定(见，例如，de Vos等人，1992，Science 225：306-316；Smith等人，1992，Journal of Molecular Biology224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBSLetters 309：59-64)。

另外，编码本发明的多肽的核苷酸序列可以通过导入核苷酸取代而进行修饰，所述取代不会给出由所述核苷酸序列编码的多肽的另一种氨基酸序列，但其对应于欲生产酶的宿主生物的密码子用法。

向核苷酸序列中导入突变以便将一个核苷酸交换另一个核苷酸可以通过利用本领域已知的任何方法进行定点突变来实现。特别有用的是这样的方法，其利用超螺旋，带有目标插入片段的双链DNA载体和两条包含所需突变的合成性引物。分别与载体相反链互补的寡核苷酸引物，在使用PfuDNA聚合酶的温度循环期间延伸。在引物并入后，生成包含错列缺口(staggered nicks)的突变质粒。在温度循环后，用特异于甲基化和半甲基化DNA的DpnI处理产物以消化亲本DNA模板并选择包含突变的合成DNA。还可以使用本领域已知的其它方法。对核苷酸取代的一般性描述参见，例如，Ford等人，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

详述

在特定的实施方案中，本发明的以及根据本发明使用的蛋白质选自：

(a)属于EC 3.4.-.-酶组的蛋白酶；

(b)属于以上手册的S组的丝氨酸蛋白酶；

(c1)肽酶家族S2A的丝氨酸蛋白酶；

(c2)在Biochem.J.290：205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，版本(release)6.20，2003年3月24日，(www.merops.ac.uk)中描述的肽酶家族S1E的丝氨酸蛋白酶。该数据库描述于Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A.&Barrett，A.J.(2002)MEROPS：the protease database.Nucleic Acids Res.30，343-346。

为了确定给定的蛋白酶是否是丝氨酸蛋白酶，和S2A家族蛋白酶，参考上面的手册和其中指出的原理。这种确定能够对于所有类型的蛋白酶来实施，它是天然发生的或野生型蛋白酶；或经过遗传工程设计的或合成性的蛋白酶。

蛋白酶活性可以利用任何测定法来进行测量，其中采用底物，其包括所研究蛋白酶特异性相关的肽键。测定-pH和测定-温度同样适合于所研究的蛋白酶。测定-pH-值的例子是pH 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12。测定-温度的例子是30，35，37，40，45，50，55，60，65，70，80，90，或95℃。

蛋白酶底物的例子是酪蛋白，如Azurine-交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。为了本发明的目的，优选利用PNA测定来测量S2A蛋白酶活性，如果不另外提及，所述PNA测定以琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-paranitroanilide作为底物。PNA测定的原理描述于Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，PH.，和Smith，L.A.，Journal of the American Oil Chemists′Society，Vol.65(5)pp.806-810(1988)。

对于本发明的蛋白酶起源和/或根据本发明的应用没有限制。因而，术语蛋白酶不仅包括获自任何属的微生物的天然或野生型蛋白酶，还包括其显示蛋白酶活性的任何突变体，变异体，片段等，以及合成性蛋白酶，如改组(shuffled)蛋白酶，和共有(consensus)蛋白酶。这种经遗传设计的蛋白酶可以如本领域已知的，例如通过定点突变，通过PCR(在PCR反应中利用包含所需突变的PCR片段作为引物之一)，或通过随机突变来制备。共有蛋白酶的制备描述于例如EP 897985中。

在具体的实施方案中，蛋白酶是低变应原性变体，当暴露于动物，包括人时，指定引起减弱的免疫反应。术语免疫反应要被理解为暴露于蛋白酶的动物的免疫系统的任何反应。一种类型的免疫反应是导致暴露动物中IgE水平提高的变态反应。低变应原性(allergenic)变体可以利用本领域已知的技术来制备。例如蛋白酶可以与聚合物部位屏蔽部分或参与免疫反应的蛋白酶的表位结合。与聚合物结合可以包括聚合物与蛋白酶体外化学偶联，例如在WO 96/17929，WO 98/30682，WO 98/35026，和/或WO 99/00489中所描述的。结合可以另外或备选地包括聚合物与蛋白酶的体内偶联。这种结合可以通过编码蛋白酶的核苷酸序列的遗传工程设计，在蛋白酶中插入编码其它糖基化作用位点的共有序列和在能够糖基化所述蛋白酶的宿主中表达该蛋白酶来实现，见例如WO 00/26354。另外一种提供低变应原性变体的方式是编码蛋白酶的核苷酸序列的遗传工程设计以便引起蛋白酶自身寡聚化，招致蛋白酶单体可能屏蔽其它蛋白酶单体的表位并且由此降低寡聚物的抗原性。这些产物及其制品描述于例如WO 96/16177中。参与免疫反应的表位可以通过各种方法如在WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体展示法，或在EP 561907中描述的随机方法来鉴定。一旦鉴定了表位，就可以通过已知的基因操作技术如定点突变(见例如WO 00/26230，WO00/26354和/或WO 00/22103)改变它的氨基酸序列以产生蛋白酶改变的免疫学特性和/或在离聚合物表位足够近的地方进行聚合物的结合以屏蔽该表位。

在上面的概述中详述了本发明的第一方面，但是，它涉及通过使用包含至少一种编码至少一种S2A或S1E蛋白酶的多核苷酸的革兰氏阳性宿主细胞来生产异源S2A/S1E蛋白酶的方法，其中在至少一种多核苷酸的编码部分中密码子用法对应于芽孢杆菌属细胞中的平均密码子用法，并且其中通过用代替物替换富含G/C的密码子来调节G/C含量，同时维持接近于细胞的平均密码子用法。

可以使用来自WO 02/29113中公布的地衣芽孢杆菌ATCC 14580的序列信息来生成本文列出的对于在地衣芽孢杆菌中表达适合的密码用法表，将WO 02/29113并入本文作为参考。

对于在枯草芽孢杆菌中异源序列的增强表达，接近基于枯草芽孢杆菌染色体序列的密码子用法可能是有益的，所述用法是公众可以获得的(Kunst，F，等人，The Complete Genome Sequence of the Gram-positive...，1997，Nature，390，pp：249-256)。

密码子用法表可以基于(1)用于所有开放阅读框中的密码子，(2)选定的开放阅读框，(3)开放阅读框的片段，或(4)选定开放阅读框的片段，优选编码被编码多肽的N-末端氨基酸的片段，更加优选至少20个最开始的N-末端氨基酸。

可以对于每种氨基酸用最优选的密码子；对于每种氨基酸用多种共同的密码子；或用在选择表中发现的相同或相似的密码子用法统计学平均频率来设计合成性基因。

合成性基因可以利用任何方法，如定点突变或PCR生成的突变根据本领域已知的方法进行构建。尽管，在理论上，修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰核苷酸序列的细胞上进行，但优选在体外进行修饰。

利用本文所述的方法通过将合成性基因可操作地连接到一种或多种控制序列上而进一步修饰合成性基因，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适宿主细胞中的表达。利用本文所述的方法也可以制备包含所述合成性基因的核酸构建体，重组表达载体，和重组宿主细胞。

在下列实施例中通过同源重组将所有表达的基因整合在芽孢杆菌属宿主细胞基因组上。在三联体启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制之下表达基因，所述三联体启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)，和包括稳定序列的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA启动子的启动子组成。将编码氯霉素乙酰基转移酶的基因用作标记。(描述在例如，Diderichsen，B.；Poulsen，G.B.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid 30：312(1993)中)。

本发明的第一方面涉及在革兰氏阳性宿主细胞中生产异源S2A/S1E蛋白酶的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在有益于蛋白酶生产的条件下于补料分批发酵(fed-batchfermentation)中培养包含至少一种编码异源S2A/S1E蛋白酶的多核苷酸的革兰氏阳性细胞，其中至少20％，更加优选至少50％的所述培养步骤过程发生在36.5℃以下的温度；优选在低于36℃以下的温度；更加优选在35℃以下的温度，还要更加优选在33℃以下的温度，或最优选在31℃以下的温度；和

(b)回收蛋白酶。

本发明人发现这样在某种程度上是有益的，即如果本发明方法中的培养步骤在通常的37℃被“kick-started持续bried时期，直到革兰氏阳性宿主细胞活跃生长，因此它们降低了剩余发酵的温度以实现提高的S2A/S1E蛋白酶产量。这种温度转换策略的非限制性例子在下面的实施例部分提供。

因此，优选的实施方案涉及本发明的方法，其中所述培养步骤过程(duration)的开始的(first)50％或更少发生于31℃以上的温度；优选所述培养步骤过程的开始40％或更少；更加优选开始30％或更少；或最优选所述培养步骤过程的开始20％或更少发生于31℃以上的温度；优选于33℃以上的温度；更加优选于35℃以上的温度；或最优选于36℃以上的温度。

在优选的实施方案中革兰氏阳性细胞为芽孢杆菌属细胞，优选选自嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)，解淀粉芽孢杆菌，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，Bacillus clausii，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。

本文在SEQ ID NO’s：3，35，37，和39中提供了编码S2A/S1E蛋白酶的第一方面的四种具体的合成性多核苷酸。

因此，优选的实施方案涉及本发明的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO’s：3，35，37，或39的577-1140位置中所示核苷酸序列具有至少70％，75％，80％，优选85％，更加优选90％，还要更加优选95％，更加优选97％，更加优选98％，还要更加优选99％，和最优选99.5％同一性的核苷酸序列。

另一个优选的实施方案涉及本发明的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：3的位置577-1140中；SEQ ID NO：5的位置526-1089中；SEQ ID NO：9的位置508-1083中；SEQ ID NO：13的位置519一1085中；SEQ ID NO：17的位置568-1143中；SEQ ID NO：19的位置574-1149中；SEQ ID NO：21的位置574-1149中；SEQ ID NO：23的位置586-1152中；SEQ ID NO：25的位置5 86-1149中；SEQ ID NO：27的位置586-1152中；SEQ ID NO：29的位置502-1065中；SEQ ID NO：31的位置496-1059中；SEQ ID NO：33的位置499-1062中；SEQ ID NO：35的位置577-1140中；SEQ ID NO：37的位置577-1140中；或SEQ ID NO：39的位置577-1140中所示的核苷酸序列具有至少70％，75％，80％，优选85％，更加优选90％，还要更加优选95％，更加优选97％，更加优选98％，还要更加优选99％，和最优选99.5％同一性的核苷酸序列。

在SEQ ID NO’s：4，6，10，14，18，20，22，24，26，28，30，32，和34中提供本发明的优选的S2A/S1E蛋白酶。所以，优选的S2A/S1E蛋白酶包含与SEQ ID NO’s：4，6，10，14，18，20，22，24，26，28，30，32，或34中所示多肽的成熟部分的氨基酸序列具有至少70％，75％，80％，优选85％，更加优选90％，还要更加优选95％，更加优选97％，更加优选98％，还要更加优选99％，和最优选99.5％同一性的氨基酸序列。

本发明的其它优选S2A或S1E蛋白酶源自一种或多种选自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)sp.NRRL 18262，达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsisdassonvillei)subsp.dassonvillei DSM 43235，Nocardiopsis Alba DSM 15647，Nocardiopsis prasina DSM 15648，Nocardiopsis prasina DSM 15649，Nocardiopsis prasina(早先为alba)DSM 14010，拟诺卡氏菌属sp.DSM16424，Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657，和卢森坦类诺卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)DSM 44048的拟诺卡氏菌属物种。

如上所述，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的基因组序列对于本发明人来说是可获得的，并且它们都用于构建密码子用法数据。

在优选的实施方案中，在本发明的至少一种编码性多核苷酸中的密码子用法对应于芽孢杆菌属细胞中的平均密码子用法，优选地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞，更加优选地衣芽孢杆菌ATCC 14580细胞。

优选的实施方案涉及本发明的多核苷酸，其中密码子用法对应于编码一种或多种革兰氏阳性杆菌属细胞内源性分泌多肽的一种或多种多核苷酸中的平均密码子用法；优选对应于编码一种或多种芽孢杆菌属细胞内源性分泌多肽的一种或多种多核苷酸的至少最初的(first)5个，优选10个，更加优选15个，还要更加优选20个，和最优选至少开始25个密码子三联体；优选编码十种或更多芽孢杆菌属细胞内源性分泌多肽的十种或更多种多核苷酸中的密码子三联体中的平均密码子用法。

生物材料的保藏

下列生物材料已经由DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)按照布达佩斯条约进行了保藏，给出下列编号：

保藏物编号保藏日期

拟诺卡氏菌属sp. DSM16424 2004-05-24

Nocardiopsis prasina DSM15649 2003-05-30

Nocardiopsis prasina(早先为alba) DSM14010 2001-01-20

该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35u.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。该保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得该保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

菌株DSM 15649于2001分离自丹麦的土壤样品中。

公众可由DSMZ获得下列菌株：

达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(subsp.dassonvillei) DSM 43235

Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657

Nocardiopsis lucentensis DSM 44048

达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种菌株DSM 43235还在其它保藏机构中保藏如下：ATCC 23219，IMRU 1250，NCTC 10489。

本文所描述和要求保护的发明并不限于由本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案都将在本发明的范围之内。事实上，除了本文所显示和描述的那些之外，由在前描述对于本领域技术人员来说本发明的各种改进将是显而易见的。这些改进也将落入随附的权利要求的范围之内。在出现抵触的情况下，以包括定义的本说明书公开调控。

本文所描述和要求保护的发明并不限于由本文公开的具体实施方案的范围，包括下列实施例，因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案都将在本发明的范围之内。事实上，除了本文所显示和描述的那些之外，由在前描述对于本领域技术人员来说本发明的各种改进将是显而易见的。这些改进也将落入随附的权利要求的范围之内。在出现抵触的情况下，以包括定义的本说明书的公开来调控。

本文引用了多种参考文献，将其全部内容并入作为参考。

实施例

实施例1

菌株的构建

使用的菌株：枯草芽孢杆菌MB 1053(WO200395658)

使用的培养基：TY：(如在Ausubel，F.M.等人(eds.)“Current protocolsin Molecular Biology”.John Wiley and Sons，1995中所述)。

通过同源重组将所有表达基因整合在枯草芽孢杆菌MB1053宿主细胞基因组上(WO200395658)。所述基因在三联体启动子系统的控制之下表达(如在WO 99/43835中所述的)，所述三联体启动子系统由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)，和包括稳定序列的苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子的启动子组成。将编码氯霉素乙酰基转移酶的基因用作标记(描述在例如，Diderichsen，B.；Poulsen，GB.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid 30：312(1993)中)。

枯草芽孢杆菌菌株Sav-10RS，Sav-L2，Sav-L1和Sav-L3的构建

由拟诺卡氏菌属sp.NRRL 18262(WO 01/58276)构建编码S2A(或S1E)蛋白酶的合成性10R基因(10RS)，称作10R。通过框内PCR将这种合成性基因与编码来自SAVINASE^TM的信号肽(显示于SEQ ID NO：2中)的DNA(显示于SEQ ID NO：1中)融合，产生编码序列Sav-10RS，其显示于SEQID NO：3中，所述SAVINASE^TM是源自Bacillus clausii的公知性商业蛋白酶(Novozymes，丹麦)。将融合序列整合入枯草芽孢杆菌宿主细胞中并将得到的菌株称作Sav-10RS。

用编码来自达松维尔类诺卡菌达松维尔亚种DSM 43235的S1E蛋白酶的前体形式的DNA，表示为L2，制备类似的枯草芽孢杆菌菌株，所述L2通过框内PCR融合到编码来自SAVINASE^TM(Novozymes)的信号肽的DNA上，得到的菌株称作枯草芽孢杆菌Sav-L2。包括融合了前体成熟L2蛋白酶编码区的部分Savinase信号的DNA序列显示在SEQ ID NO：5中，用引物1423(SEQ ID NO：7)和1475(SEQ ID NO：8)进行扩增。

1423(SEQ ID NO：7)：gcttttagttcatcgatcgcatcggctgctccggcccccgtcccccag

1475(SEQ ID NO：8)：ggagcggattgaacatgcgattaggtccggatcctgacaccccag

用编码来自达松维尔类诺卡菌达松维尔亚种DSM43235的S1E蛋白酶的前体形式的DNA，表示为L1，制备枯草芽孢杆菌菌株，所述L1通过框内PCR融合到编码来自SAVINASE^TM(Novozymes，丹麦)的信号肽的DNA上，得到的菌株称作枯草芽孢杆菌Sav-L1。包括融合了前体成熟L1蛋白酶编码区的部分Savinase信号的DNA序列显示在SEQ ID NO：9中，用引物1485(SEQ ID NO：11)和1424(SEQ ID NO：12)进行扩增。

1485(SEQ ID NO：11)：ggagcggatgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagc

1424(SEQ ID NO：12)：ggagcggatgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagc

用编码来自拟诺卡氏菌属菌种DSM16424的S1E蛋白酶的前体形式的DNA，表示为L3，制备枯草芽孢杆菌菌株，所述L3通过框内PCR融合到编码来自SAVINASE^TM(Novozymes，丹麦)的信号肽的DNA上，得到的菌株称作枯草芽孢杆菌Sav-L3。包括融合了前体成熟L3蛋白酶编码区的部分Savinase信号的DNA序列显示在SEQ ID NO：13中，用引物1718(SEQID NO：15)和1720(SEQ ID NO：16)进行扩增。

1718(SEQ ID NO：15)：agttcatcgatcgcatcggctgcgcccggccccgtcccccag

1720(SEQ ID NO：16)：ggagcggattgaacatgcgatcagctggtgcggatgcgaac

通过同源重组将Sav-10RS，Sav-L1，Sav-L2和Sav-L3基因整合到枯草芽孢杆菌MB1053宿主细胞基因组上。在1％脱脂乳LB-PG琼脂糖板上(添加了6μg/ml的氯霉素)对氯霉素抗性转化子检查蛋白酶活性。通过插入片段的DNA测序进一步分析一些蛋白酶阳性菌落以确认正确的DNA序列，并对每种构建体选择一个菌株。

在包含添加了6mg/L氯霉素的100ml TY的500ml挡板式Erlenmeyer瓶中于旋转摇动工作台上对四种选定的枯草芽孢杆菌菌株Sav-10RS，Sav-L2，Sav-L1，和Sav-L3进行发酵。对于四种枯草芽孢杆菌菌株每种都并行对四个Erlenmeyer瓶进行发酵。将四个Erlenmeyer瓶中的两个在37℃(250rpm)温育，两个在30℃(250rpm)温育。在第1，2和3天从每个摇瓶中取样品并分析蛋白水解活性。相对于样品第一天于37℃的平均值，对于每个菌株将每组两个样品的平均值呈现在下表中。

表1.相对于第一天于37℃ Sav-10RS的蛋白水解酶活性

	第1天	第2天	第3天
	第1天	第2天	第3天	Sav-10RS37℃	1.0	0.9	0.9
Sav-10RS30℃	6.8	5.9	5.4	Sav-10RS37℃	1.0	0.9	0.9

表2.相对于第一天于37℃ Sav-L1的蛋白水解酶活性

	第1天	第2天	第3天
	第1天	第2天	第3天	Sav-L137℃	1.0	1.3	0.9
Sav-L130℃	1.4	1.7	1.8	Sav-L137℃	1.0	1.3	0.9

表3.相对于第一天于37℃ Sav-L2的蛋白水解酶活性

	第1天	第2天	第3天
	第1天	第2天	第3天	Sav-10L237℃	1.0	1.0	0.8
Sav-10L230℃	1.4	1.7	1.5	Sav-10L237℃	1.0	1.0	0.8

表4.相对于第一天于37℃ Sav-L3的蛋白水解酶活性

	第1天	第2天	第3天
	第1天	第2天	第3天	Sav-L3 37℃	1.0	0.7	0.6
Sav-L330℃	1.5	1.3	1.2	Sav-L3 37℃	1.0	0.7	0.6

如由表1-4可见，当与37℃相比时，30℃的较低发酵温度提高了所有四种测试S2A/S1E拟诺卡氏属菌种蛋白酶的表达水平。

编码适于通过本发明的方法表达和生产的S2A/S1E蛋白酶的非限制性例子提供在SEQ ID NO’s：17，19，21，23，25，27，29，31，和33中；编码蛋白酶的氨基酸序列相应地提供在SEQ ID NO’s：18，20，22，24，26，28，30，32，和34中。

实施例2

利用温度降低表达合成性10蛋白酶基因

设计编码给定氨基酸序列的合成性DNA序列的一种策略称为随机化。起始点是蛋白质序列，或编码所述蛋白质序列的野生型DNA序列，和密码子表。所述密码子表是利用所有或序列亚组，由选自生产宿主或相关物种的基因组的编码性DNA序列来制成的。在此实施例中，随后通过去除最少使用的密码子和一些具有高G-C含量的稀少使用的密码子来对密码子表进行改进。

在本文中采用密码子表意味着总共所有可能的64种密码子和频率的列表，所述频率给出了在选定的DNA序列亚组中，一种给定密码子相对于编码相同氨基酸的其它密码子的相对使用的频率。

随后将密码子表和蛋白质序列用于生成如下的合成性DNA序列。对于任何给定的氨基酸都以密码子表中给出的频率给出的可能性来选择密码子。密码子优化方法的综述在Claes Gustafsson，Sridhar Govindarajan andJeremy Minshull：Codon bias and heterologous protein expression，article inpress(可由 www.sciencedirect.com获得)，Trends in Biotechnology中给出。

用于设计编码给定蛋白质序列的合成性DNA序列的另一种策略称作严格优化(strict optimization)。在严格优化中的起点也是蛋白质序列，或编码蛋白质序列的DNA序列，以及密码子表。进行严格优化，只将密码子表中具有最高频率的密码子用来编码给定的氨基酸。

随机化方法将易于生成大量的合成性DNA序列，全部都编码相同的蛋白质并且全部都具有大约相同的密码子统计学，如在所用密码子表中所列出的。许多标准可以用来选择基因的最终候选物。

我们由拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262生成了许多编码S2A(或S1E)蛋白酶的合成性修饰基因(显示于SEQ ID NO’s：35，37，和39中)。对于每种基因都利用来自Nucleic Acids Res.31：3429-3431(2003)中所述Vienna软件包的RNAfold程序来计算折叠自由能和最小能量构象(conformation)。选择基因(SEQ ID NO：35)并且以精确相同构建(construction)中的单一拷贝并入芽孢杆菌属宿主细胞的基因组中，如在表达相同10R蛋白酶但来自野生型基因的可比较菌株那样。通过完整表达盒的DNA测序来确证每个染色体整合子的完整性。

在24小时剧烈摇动下于37℃利用富营养培养基将两个整合子在多个摇瓶中发酵多达6天，随后在26℃孵育(37/26)。在指定温度下孵育指定的时间后，通过离心收集1ml上清液样品并对样品分析蛋白质。相对于在精确相同条件下发酵的具有野生型蛋白酶基因的菌株，对于具有合成性蛋白酶基因的菌株在表5中给出结果。

10R合成性基因在37/26℃表达导致蛋白酶活性水平以1.5和13之间的系数(factor)提高。观察到表达的非常大量的变化，其部分归因于在发酵过程中在pH上缺少控制。不过毫无疑问合成性基因导致蛋白酶表达平均大约5倍的提高。

表5.相对于wt基因由使用合成性蛋白酶基因得到的表达产量

发酵时间	菌株	Rel.活性
发酵时间	菌株	Rel.活性	4天	蛋白酶2-5a	1.6
4天	蛋白酶2-8a	3.7	4天	蛋白酶2-5a	1.6
4天	蛋白酶2-8a	3.7	5天	蛋白酶2-5a	1.5
5天	蛋白酶2-8a	3.6	5天	蛋白酶2-5a	1.5
5天	蛋白酶2-8a	3.6	6天	蛋白酶2-5a	2.3
6天	蛋白酶2-8a	5.6	6天	蛋白酶2-5a	2.3
6天	蛋白酶2-8a	5.6	5天	蛋白酶2-8a	5.8
6天	蛋白酶2-8a	4.1	5天	蛋白酶2-8a	5.8
6天	蛋白酶2-8a	4.1	5天	蛋白酶2-8a	5.8
6天	蛋白酶2-8a	9.6	5天	蛋白酶2-8a	5.8
6天	蛋白酶2-8a	9.6	5天	蛋白酶A1-8	10.6
6天	蛋白酶A1-8	13.3	5天	蛋白酶A1-8	10.6

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>生产异源蛋白酶的改进方法

<130>10592.204-WO

<160>40

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>81

<212>DNA

<213>Bacillus clausii

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(81)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(81)

<400>1

atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc att 48

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

tct gtt gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct 81

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala

20 25

<210>2

<211>27

<212>PRT

<213>Bacillus clausii

<400>2

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala

20 25

<210>3

<211>1143

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Savinase信号与合成的S2A蛋白酶的融合

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1140)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(81)

<223>Sayinase信号

<220>

<221>mat_peptide

<222>(577)..(1140)

<400>3

atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc 45

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu

-190 -185 -180

att tct gtt gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct gct act gga 90

Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Gly

-175 -170 -165

gca tta cct cag tct cct aca cct gaa gca gat gca gta tcg atg 135

Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala Val Ser Met

-160 -155 -150

caa gaa gca tta caa cgt gat ctt gat ctt aca tca gct gaa gct 180

Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala Glu Ala

-145 -140 -135

gag gaa tta ctt gct gca caa gat aca gcc ttt gaa gtt gat gaa 225

Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu Val Asp Glu

-130 -125 -120

gct gcc gct gaa gca gct ggt gat gca tat ggt ggt tca gta ttc 270

Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser Val Phe

-115 -110 -105

gat act gaa tca ctc gaa ctt act gta cta gtg acc gat gca gca gct 318

Asp Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ala Ala

-100 -95 -90

gtt gaa gct gtt gaa gcc aca ggt gca ggt aca gag ctc gta tct tat 366

Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr

-85 -80 -75

ggt att gat gga tta gat gag atc gta caa gag ctt aat gca gct gat 414

Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln Glu Leu Asn Ala Ala Asp

-70 -65 -60 -55

gcc gtt cea ggt gta gtt gga tgg tat cct gat gta gca ggt gat act 462

Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly Asp Thr

-50 -45 -40

gtt gtc tta gaa gtt ctt gaa ggc tct gga gct gat gtt tct gga ctt 510

Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Ser Gly Leu

-35 -30 -25

tta gca gac gca gga gtc gat gca tcc gcg gtt gaa gtg acc acg tca 558

Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val Thr Thr Ser

-20 -15 -10

gat cag cct gaa ctc tat gcc gat atc att gga ggc cta gcg tac aca 606

Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr

-5 -1 1 5 10

atg ggt ggt cgc tgc agc gta gga ttt gca gcc aca aat gca gct gga 654

Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly

15 20 25

caa cct ggc ttc gtg aca gct gga cat tgc ggc cgc gtc ggt aca cag 702

Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln

30 35 40

gtt act atc ggc aat gga aga ggt gtc ttt gag caa agc gta ttt ccc 750

Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro

45 50 55

ggg aat gat gct gcc ttc gtt aga ggt acg tcc aac ttt acg ctt act 798

Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr

60 65 70

aac tta gta tct aga tac aac act ggc gga tat gca act gta gca ggt 846

Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly

75 80 85 90

cac aat caa gca cct att ggc tct agc gtc tgc cgc tca ggg tcg act 894

His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr

95 100 105

aca gga tgg cat tgt gga acc att caa gct aga ggt cag agc gtg agc 942

Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser

110 115 120

tat cct gaa ggt acc gta acg aac atg act cgt acg act gta tgt gca 990

Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala

125 130 135

gaa cca ggt gac tct gga ggt tca tat atc agc ggt acg caa gcg caa 1038

Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln

140 145 150

ggc gtt acc tca ggt gga tcc ggt aac tgt agg aca ggt ggc aca acg 1086

Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr

155 160 165 170

ttc tac cag gaa gtg aca ccg atg gtg aac tct tgg gga gtt aga ctc 1134

Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu

175 180 185

cgt aca taa 1143

Arg Thr

<210>4

<211>380

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>4

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu

-190 -185 -180

Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Gly

-175 -170 -165

Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala Val Ser Met

-160 -155 -150

Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala Glu Ala

-145 -140 -135

Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu Val Asp Glu

-130 -125 -120

Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser Val Phe

-115 -110 -105

Asp Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ala Ala

-100 -95 -90

Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr

-85 -80 -75

Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln Glu Leu Asn Ala Ala Asp

-70 -65 -60 -55

Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly Asp Thr

-50 -45 -40

Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Ser Gly Leu

-35 -30 -25

Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val Thr Thr Ser

-20 -15 -10

Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr

-5 -1 1 5 10

Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly

15 20 25

Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln

30 35 40

Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro

45 50 55

Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr

60 65 70

Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly

75 80 85 90

His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr

95 100 105

Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser

110 115 120

Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala

125 130 135

Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln

140 145 150

Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr

155 160 165 170

Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu

175 180 185

Arg Thr

<210>5

<211>1112

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Savinase信号与S2A蛋白酶基因的融合

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1089)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(27)

<223>部分Savinase信号肽

<220>

<221>mat_peptide

<222>(526)..(1089)

<400>5

gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct gct ccg gcc ccc gtc ccc 45

Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro

-175 -170 -165

cag acc ccc gtc gcc gac gac agc gcc gcc agc atg acc gag gcg 90

Gln Thr Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala Ala Ser Met Thr Glu Ala

-160 -155 -150

ctc aag cgc gac ctc gac ctc acc tcg gcc gag gcc gag gag ctt 135

Leu Lys Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala Glu Ala Glu Glu Leu

-145 -140 -135

ctc tcg gcg cag gaa gcc gcc atc gag acc gac gcc gag gcc acc 180

Leu Ser Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala Thr

-130 -125 -120

gag gcc gcg ggc gag gcc tac ggc ggc tca ctg ttc gac acc gag 225

Glu Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr Glu

-115 -110 -105

acc ctc gaa ctc acc gtg ctg gtc acc gac gcc tcc gcc gtc gag gcg 273

Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala

-100 -95 -90 -85

gtc gag gcc acc gga gcc cag gcc acc gtc gtc tcc cac ggc acc gag 321

Val Glu Ala Thr Gly Ala Gln Ala Thr Val Val Ser His Gly Thr Glu

-80 -75 -70

ggc ctg acc gag gtc gtg gag gac ctc aac ggc gcc gag gtt ccc gag 369

Gly Leu Thr Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Gly Ala Glu Val Pro Glu

-65 -60 -55

agc gtc ctc ggc tgg tac ccg gac gtg gag agc gac acc gtc gtg gtc 417

Ser Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val Val

-50 -45 -40

gag gtg ctg gag ggc tcc gac gcc gac gtc gcc gcc ctg ctc gcc gac 465

Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala Ala Leu Leu Ala Asp

-35 -30 -25

gcc ggt gtg gac tcc tcc tcg gtc cgg gtg gag gag gcc gag gag gcc 513

Ala Gly Val Asp Ser Ser Ser Val Arg Val Glu Glu Ala Glu Glu Ala

-20 -15 -10 -5

ccg cag gtc tac gcc gac atc atc ggc ggc ctg gcc tac tac atg ggc 561

Pro Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gly

-1 1 5 10

ggc cgc tgc tcc gtc ggc ttc gcc gcg acc aac agc gcc ggt cag ccc 609

Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro

15 20 25

ggt ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc acc gtc ggc acc ggc gtg acc 657

Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Val Thr

30 35 40

atc ggc aac ggc acc ggc acc ttc cag aac tcg gtc ttc ccc ggc aac 705

Ile Gly Asn Gly Thr Gly Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Pro Gly Asn

45 50 55 60

gac gcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcc aac ttc acc ctg acc aac ctg 753

Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu

65 70 75

gtc tcg cgc tac aac tcc ggc ggc tac cag tcg gtg acc ggt acc agc 801

Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Ser Val Thr Gly Thr Ser

80 85 90

cag gcc ccg gcc ggc tcg gcc gtg tgc cgc tcc ggc tcc acc acc ggc 849

Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly

95 100 105

tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag acc gtg cgc tac ccg 897

Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro

110 115 120

cag ggc acc gtc tac tcg ctc acc cgc acc aac gtg tgc gcc gag ccc 945

Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro

125 130 135 140

ggc gac tcc ggc ggt tcg ttc atc tcc ggc tcg cag gcc cag ggc gtc 993

Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val

145 150 155

acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc gtc ggc ggc acg acc tac tac 1041

Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr

160 165 170

cag gag gtc acc ccg atg atc aac tcc tgg ggt gtc agg atc cgg acc 1089

Gln Glu Val Thr Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr

175 180 185

taatcgcatg ttcaatccgc tcc 1112

<210>6

<211>363

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>6

Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro

-175 -170 -165

Gln Thr Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala Ala Ser Met Thr Glu Ala

-160 -155 -150

Leu Lys Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala Glu Ala Glu Glu Leu

-145 -140 -135

Leu Ser Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala Thr

-130 -125 -120

Glu Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr Glu

-115 -110 -105

Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala

-100 -95 -90 -85

Val Glu Ala Thr Gly Ala Gln Ala Thr Val Val Ser His Gly Thr Glu

-80 -75 -70

Gly Leu Thr Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Gly Ala Glu Val Pro Glu

-65 -60 -55

Ser Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val Val

-50 -45 -40

Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala Ala Leu Leu Ala Asp

-35 -30 -25

Ala Gly Val Asp Ser Ser Ser Val Arg Val Glu Glu Ala Glu Glu Ala

-20 -15 -10 -5

Pro Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr Met Gly

-1 1 5 10

Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro

15 20 25

Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Val Thr

30 35 40

Ile Gly Asn Gly Thr Gly Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Pro Gly Asn

45 50 55 60

Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu

65 70 75

Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Ser Val Thr Gly Thr Ser

80 85 90

Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly

95 100 105

Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro

110 115 120

Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro

125 130 135 140

Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val

145 150 155

Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr

160 165 170

Gln Glu Val Thr Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr

175 180 185

<210>7

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1423

<400>7

gcttttagtt catcgatcgc atcggctgct ccggcccccg tcccccag 48

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1475

<400>8

ggagcggatt gaacatgcga ttaggtccgg atcctgacac cccag 45

<210>9

<211>1108

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Savinase信号与S2A蛋白酶基因的融合

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1083)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(27)

<223>部分Savinase信号

<220>

<221>mat_peptide

<222>(508)..(1083)

<400>9

gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct gcg acc gta ccg gcc gag 45

Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Val Pro Ala Glu

-165 -160 -155

cca gcg agc gag gcc cag acg atg atg gaa gcg ctg cag aga gac 90

Pro Ala Ser Glu Ala Gln Thr Met Met Glu Ala Leu Gln Arg Asp

-150 -145 -140

ctc ggc ctc acc ccg ctc ggg gcc gag gag ctg ctc tcg gcg cag 135

Leu Gly Leu Thr Pro Leu Gly Ala Glu Glu Leu Leu Ser Ala Gln

-135 -130 -125

gaa gag gcg atc gag acc gac gcc gag gcc acc gag gcc gcg gga 180

Glu Glu Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala Thr Glu Ala Ala Gly

-120 -115 -110

gcg tcc tac ggc ggc tcc ctg ttc gac acc gag acc ctc cag ctc acc 228

Ala Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu Gln Leu Thr

-105 -100 -95

gtg ctg gtg acc gac gcc tcg gcc gtc gag gcg gtg gag gcc acc ggc 276

Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly

-90 -85 -80

gcc gag gcc acc gtg gtc tca cac ggc gca gag ggc ctg gcc gag gtg 324

Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala Glu Gly Leu Ala Glu Val

-75 -70 -65

gtc gac gcg ctc gac gag acc ggc ggc cgg gaa ggg gtc gtc ggc tgg 372

Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg Glu Gly Val Val Gly Trp

-60 -55 -50

tac ccg gac gtg gag agc gac acc gtc gtg gtc cag gtc gcc gag ggc 420

Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val Val Gln Val Ala Glu Gly

-45 -40 -35 -30

gcc agc gcc gac ggc ctc atc gag gcc gcg ggc gtg gac ccc tcc gcc 468

Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala Gly Val Asp Pro Ser Ala

-25 -20 -15

gtc cgg gtg gag gag acc agt gag act ccg cgc ctg tac gcc gac atc 516

Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro Arg Leu Tyr Ala Asp Ile

-10 -5 -1 1

gtc ggc ggc gag gcg tac tac atg ggc ggc gga cgc tgc tcg gtc ggg 564

Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly

5 10 15

ttc gcc gtg acc gac ggc tcc ggc gcg ggc ggc ttc gtg acg gcg ggc 612

Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly Gly Phe Val Thr Ala Gly

20 25 30 35

cac tgc ggc acc gtc ggc acc ggc gcc gag agc tcc gac ggc agc ggc 660

His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu Ser Ser Asp Gly Ser Gly

40 45 50

tcc gga acc ttc cag gag tcc gtc ttc ccg ggc agc gac ggc gcc ttc 708

Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro Gly Ser Asp Gly Ala Phe

55 60 65

gtc gcg gcc acc tcc aac tgg aac gtg acc aac ctg gtc agc cgg tac 756

Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr

70 75 80

gac tcc ggc agc ccc cag gcg gtg tcg ggt tcc agc cag gcc ccg gag 804

Asp Ser Gly Ser Pro Gln Ala Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Pro Glu

85 90 95

ggc tcg gcg gtg tgc cgc tcc ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggg 852

Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly

100 105 110 115

acc atc gag gcc cgc ggc cag acg gtg aac tac ccg cag ggc acg gtc 900

Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn Tyr Pro Gln Gly Thr Val

120 125 130

cag gac ctg acc cgg acg gac gtg tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggc 948

Gln Asp Leu Thr Arg Thr Asp Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly

135 140 145

ggc tcg ttc atc gcc ggt tcg cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggc ggc 996

Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly

150 155 160

tcg ggc aac tgc acc tcc ggc ggc acg acc tac tac cag gag gtc act 1044

Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr

165 170 175

ccc ctg ctg agc agc tgg ggg ctg tcc ctg gtg acc ggt tagtaatcgc 1093

Pro Leu Leu Ser Ser Trp Gly Leu Ser Leu Val Thr Gly

180 185 190

atgttcatcc gctcc 1108

<210>10

<211>361

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>10

Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Val Pro Ala Glu

-165 -160 -155

Pro Ala Ser Glu Ala Gln Thr Met Met Glu Ala Leu Gln Arg Asp

-150 -145 -140

Leu Gly Leu Thr Pro Leu Gly Ala Glu Glu Leu Leu Ser Ala Gln

-135 -130 -125

Glu Glu Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala Thr Glu Ala Ala Gly

-120 -115 -110

Ala Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu Gln Leu Thr

-105 -100 -95

Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly

-90 -85 -80

Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala Glu Gly Leu Ala Glu Val

-75 -70 -65

Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg Glu Gly Val Val Gly Trp

-60 -55 -50

Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val Val Gln Val Ala Glu Gly

-45 -40 -35 -30

Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala Gly Val Asp Pro Ser Ala

-25 -20 -15

Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro Arg Leu Tyr Ala Asp Ile

-10 -5 -1 1

Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly

5 10 15

Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly Gly Phe Val Thr Ala Gly

20 25 30 35

His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu Ser Ser Asp Gly Ser Gly

40 45 50

Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro Gly Ser Asp Gly Ala Phe

55 60 65

Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr

70 75 80

Asp Ser Gly Ser Pro Gln Ala Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Pro Glu

85 90 95

Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly

100 105 110 115

Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn Tyr Pro Gln Gly Thr Val

120 125 130

Gln Asp Leu Thr Arg Thr Asp Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly

135 140 145

Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly

150 155 160

Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr

165 170 175

Pro Leu Leu Ser Ser Trp Gly Leu Ser Leu Val Thr Gly

180 185 190

<210>11

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1485

<400>11

ggagcggatg aacatgcgat tactaaccgg tcaccaggga cagc 44

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1424

<400>12

ggagcggatg aacatgcgat tactaaccgg tcaccaggga cagc 44

<210>13

<211>1109

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Savinase信号与S2A蛋白酶的融合

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1086)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(21)

<223>部分Savinase信号

<220>

<221>mat_peptide

<222>(520)..(1086)

<400>13

agt tca tcg atc gca tcg gct gcg ccc ggc ccc gtc ccc cag acc 45

Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Pro Gly Pro Val Pro Gln Thr

-170 -165 -160

ccc gtc gcc gac gac agc gcc gcc agc atg acc gaa gcg ctc aag 90

Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala Ala Ser Met Thr Glu Ala Leu Lys

-155 -150 -145

cgt gac ctc aac ctc tcc tcg gcc gag gcc gag gag ctg ctc tcg 135

Arg Asp Leu Asn Leu Ser Ser Ala Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ser

-140 -135 -130

gcg cag gaa gcc gcg atc gag acc gac gcc gag gcc gcc gag gcc 180

Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala Ala Glu Ala

-125 -120 -115

gcg gga gag gcc tac ggc ggc tcc ctg ttc gac acc gaa acc ctc 225

Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu

-110 -105 -100

gaa ctc acc gtg ctg gtg acc gac acc acg gcc gtc gac gcg gtc gag 273

Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Thr Thr Ala Val Asp Ala Val Glu

-95 -90 -85

gcc acc gga gcc gag gcc acc gtg gtc acc cac ggc acc gac ggc ctg 321

Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Thr His Gly Thr Asp Gly Leu

-80 -75 -70

gcc gag gtc gtg gag gac ctc aac agc gcc gac gcc ccg gcg ggc gtc 369

Ala Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Ser Ala Asp Ala Pro Ala Gly Val

-65 -60 -55

ctc ggc tgg tac ccc gac atg gag agc gac acc gtg gtg gtc gag gtg 417

Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Met Glu Ser Asp Thr Val Val Val Glu Val

-50 -45 -40 -35

ctg gag ggc tcc gac gcc gac gtc gcc gcc ctg ctc gcc gac gcc ggc 465

Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly

-30 -25 -20

gtg gac gcc tcc gcc gtc cgg gtg gag gag gcg gag gag gtc ccg cag 513

Val Asp Ala Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Ala Glu Glu Val Pro Gln

-15 -10 -5

gtc tac gcc aac atc atc ggc ggc ctg gcc tac acc atg ggc gga cgc 561

Val Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg

-1 1 5 10

tgc tcc gtc ggc ttc gcg gcg acc aae agc gcc gga cag ccc ggt ttc 609

Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe

15 20 25 30

gtg acg gcg ggc cac tgc ggc acc gtc ggc acc gcc gtg acc atc ggc 657

Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ala Val Thr Ile Gly

35 40 45

gac ggc cgc ggc gtc ttc gag cgc tcg gtc ttc ccc ggc aac gac gcc 705

Asp Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala

50 55 60

gcc ttc gtc cgc ggc acc tcc aac ttc acc ctg acc aac ctg gtc tcc 753

Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser

65 70 75

cgc tac aac tcc ggc ggc cac cag gcg gtg acc ggc acc agc cag gcc 801

Arg Tyr Asn Ser Gly Gly His Gln Ala Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala

80 85 90

ccg gcc ggc tcg gcc gtc tgc cgc tcc ggc tcc acc acc ggc tgg cac 849

Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His

95 100 105 110

tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag acc gtg cgc tac ccg cag ggc 897

Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly

115 120 125

acc gtc aac gcg ctc acc cgc acc aac gtg tgc gcc gag ccc ggt gac 945

Thr Val Asn Ala Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp

130 135 140

tcc ggc ggc tcg ttc atc tcc ggc tcg cag gcc cag ggc gtc acc tcc 993

Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser

145 150 155

ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc ttc ggc ggc acg acc tac tac cag gag 1041

Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu

160 165 170

gtc gcc ccg atg atc aac tcc tgg ggc gtt cgc atc cgc acc agc 1086

Val Ala Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr Ser

175 180 185

tgatcgcatg ttcaatccgc tcc 1109

<210>14

<211>362

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>14

Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Pro Gly Pro Val Pro Gln Thr

-170 -165 -160

Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala Ala Ser Met Thr Glu Ala Leu Lys

-155 -150 -145

Arg Asp Leu Asn Leu Ser Ser Ala Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ser

-140 -135 -130

Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala Ala Glu Ala

-125 -120 -115

Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu

-110 -105 -100

Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Thr Thr Ala Val Asp Ala Val Glu

-95 -90 -85

Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Thr His Gly Thr Asp Gly Leu

-80 -75 -70

Ala Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Ser Ala Asp Ala Pro Ala Gly Val

-65 -60 -55

Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Met Glu Ser Asp Thr Val Val Val Glu Val

-50 -45 -40 -35

Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly

-30 -25 -20

Val Asp Ala Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Ala Glu Glu Val Pro Gln

-15 -10 -5

Val Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg

-1 1 5 10

Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe

15 20 25 30

Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ala Val Thr Ile Gly

35 40 45

Asp Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala

50 55 60

Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser

65 70 75

Arg Tyr Asn Ser Gly Gly His Gln Ala Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala

80 85 90

Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His

95 100 105 110

Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly

115 120 125

Thr Val Asn Ala Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp

130 135 140

Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser

145 150 155

Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu

160 165 170

Val Ala Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr Ser

175 180 185

<210>15

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1718

<400>15

agttcatcga tcgcatcggc tgcgcccggc cccgtccccc ag 42

<210>16

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1720

<400>16

ggagcggatt gaacatgcga tcagctggtg cggatgcgaa c 41

<210>17

<211>1146

<212>DNA

<213>达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subsp.

dassonvillei) DSM 43235

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1143)

<220>

<221>sig-peptide

<222>(1)..(87)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(568)..(1143)

<400>17

atg cga ccc tcc ccc gct atc tcc gct atc ggc acc ggc gca ctc 45

Met Arg Pro Ser Pro Ala Ile Ser Ala Ile Gly Thr Gly Ala Leu

-185 -180 -175

gcg ttc ggt ctg gcg ttc tcc gtg acg ccg ggc gcc agt gcg gcg 90

Ala Phe Gly Leu Ala Phe Ser Val Thr Pro Gly Ala Ser Ala Ala

-170 -165 -160

acc gta ccg gcc gag cca gcg agc gag gcc cag acg atg atg gaa 135

Thr Val Pro Ala Glu Pro Ala Ser Glu Ala Gln Thr Met Met Glu

-155 -150 -145

gcg ctg cag aga gac ctc ggc ctc acc ccg ctc ggg gcc gag gag 180

Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Thr Pro Leu Gly Ala Glu Glu

-140 -135 -130

ctg ctc tcg gcg cag gaa gag gcg atc gag acc gac gcc gag gcc 225

Leu Leu Ser Ala Gln Glu Glu Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala

-125 -120 -115

acc gag gcc gcg gga gcg tcc tac ggc ggc tcc ctg ttc gac acc 270

Thr Glu Ala Ala Gly Ala Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr

-110 -105 -100

gag acc ctc cag ctc acc gtg ctg gtg acc gac gcc tcg gcc gtc gag 318

Glu Thr Leu Gln Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu

-95 -90 -85

gcg gtg gag gcc acc ggc gcc gag gcc acc gtg gtc tca cac ggc gca 366

Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala

-80 -75 -70

gag ggc ctg gcc gag gtg gtc gac gcg ctc gac gag acc ggc ggc cgg 414

Glu Gly Leu Ala Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg

-65 -60 -55

gaa ggg gtc gtc ggc tgg tac ccg gac gtg gag agc gac acc gtc gtg 462

Glu Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val

-50 -45 -40

gtc cag gtc gcc gag ggc gcc agc gcc gac ggc ctc atc gag gcc gcg 510

Val Gln Val Ala Glu Gly Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala

-35 -30 -25 -20

ggc gtg gac ccc tcc gcc gtc cgg gtg gag gag acc agt gag act ccg 558

Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro

-15 -10 -5

cgc ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggc gag gcg tac tac atg ggc ggc 606

Arg Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly

-1 1 5 10

gga cgc tgc tcg gtc ggg ttc gcc gtg acc gac ggc tcc ggc gcg ggc 654

Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly

15 20 25

ggc ttc gtg acg gcg ggc cac tgc ggc acc gtc ggc acc ggc gcc gag 702

Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu

30 35 40 45

agc tcc gac ggc agc ggc tcc gga acc ttc cag gag tcc gtc ttc ccg 750

Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro

50 55 60

ggc agc gac ggc gcc ttc gtc gcg gcc acc tcc aac tgg aac gtg acc 798

Gly Ser Asp Gly Ala Phe Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr

65 70 75

aac ctg gtc agc cgg tac gac tcc ggc age ccc cag gcg gtg tcg ggt 846

Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Gln Ala Val Ser Gly

80 85 90

tcc agc cag gcc ccg gag ggc tcg gcg gtg tgc cgc tcc ggc tcc acc 894

Ser Ser Gln Ala Pro Glu Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr

95 100 105

acc ggc tgg cac tgc ggg acc atc gag gcc cgc ggc cag acg gtg aac 942

Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn

110 115 120 125

tac ccg cag ggc acg gtc cag gac ctg acc cgg acg gac gtg tgc gcc 990

Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asp Leu Thr Arg Thr Asp Val Cys Ala

130 135 140

gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcg ttc atc gcc ggt tcg cag gcc cag 1038

Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Gln Ala Gln

145 150 155

ggc gtc acc tcc ggc ggc tcg ggc aac tgc acc tcc ggc ggc acg acc 1086

Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr

160 165 170

tac tac cag gag gtc act ccc ctg ctg agc agc tgg ggg ctg tcc ctg 1134

Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Leu Leu Ser Ser Trp Gly Leu Ser Leu

175 180 185

gtg acc ggt tag 1146

Val Thr Gly

190

<210>18

<211>381

<212>PRT

<213>达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235

<400>18

Met Arg Pro Ser Pro Ala Ile Ser Ala Ile Gly Thr Gly Ala Leu

-185 -180 -175

Ala Phe Gly Leu Ala Phe Ser Val Thr Pro Gly Ala Ser Ala Ala

-170 -165 -160

Thr Val Pro Ala Glu Pro Ala Ser Glu Ala Gln Thr Met Met Glu

-155 -150 -145

Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Thr Pro Leu Gly Ala Glu Glu

-140 -135 -130

Leu Leu Ser Ala Gln Glu Glu Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala

-125 -120 -115

Thr Glu Ala Ala Gly Ala Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr

-110 -105 -100

Glu Thr Leu Gln Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu

-95 -90 -85

Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala

-80 -75 -70

Glu Gly Leu Ala Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg

-65 -60 -55

Glu Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val

-50 -45 -40

Val Gln Val Ala Glu Gly Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala

-35 -30 -25 -20

Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro

-15 -10 -5

Arg Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly

-1 1 5 10

Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly

15 20 25

Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu

30 35 40 45

Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro

50 55 60

Gly Ser Asp Gly Ala Phe Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr

65 70 75

Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Gln Ala Val Ser Gly

80 85 90

Ser Ser Gln Ala Pro Glu Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr

95 100 105

Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn

110 115 120 125

Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asp Leu Thr Arg Thr Asp Val Cys Ala

130 135 140

Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Gln Ala Gln

145 150 155

Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Thr Ser Gly Gly Thr Thr

160 165 170

Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Leu Leu Ser Ser Trp Gly Leu Ser Leu

175 180 185

Val Thr Gly

190

<210>19

<211>1152

<212>DNA

<213>Nocardiopsis prasina DSM 15649

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1149)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(87)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(574)..(1149)

<400>19

atg cga ccc tcc ccc gtc atc tcc gcg atc ggc acg gga gca ctg 45

Met Arg Pro Ser Pro Val Ile Ser Ala Ile Gly Thr Gly Ala Leu

-190 -185 -180

gcc ttc ggg ctc gcg ctc tcg gtc gcg ccc ggc gcc tcc gcc gtc 90

Ala Phe Gly Leu Ala Leu Ser Val Ala Pro Gly Ala Ser Ala Val

-175 -170 -165

acc gca ccc acc gag ccc gcg ccc cag ggc gag gcg gcc acc atg 135

Thr Ala Pro Thr Glu Pro Ala Pro Gln Gly Glu Ala Ala Thr Met

-160 -155 -150

cag gaa gcg ctt gag agg gac ttc ggc ctc acc ccg ttc gag gcc 180

Gln Glu Ala Leu Glu Arg Asp Phe Gly Leu Thr Pro Phe Glu Ala

-145 -140 -135

gaa gac ctg ctc gaa gcc cag aat gac gct ctc ggg atc gac acg 225

Glu Asp Leu Leu Glu Ala Gln Asn Asp Ala Leu Gly Ile Asp Thr

-130 -125 -120

gcg gcg gcc aag gcc gcc ggt gac gcc tac gcg ggc tcc gtg ttc 270

Ala Ala Ala Lys Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Ala Gly Ser Val Phe

-115 -110 -105

gac acc gac acc ctg gaa ctg acc gtc ctg ctc acg gac gcc gga gcc 318

Asp Thr Asp Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Leu Thr Asp Ala Gly Ala

-100 -95 -90

gtg tcg gac gtc gag gcc acc ggc gcc ggg acc gaa ctg gtc tcg tac 366

Val Ser Asp Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr

-85 -80 -75 -70

ggc acc gag ggc ctg gcg gag atc atg gac gag ctc gac gca gcc ggc 414

Gly Thr Glu Gly Leu Ala Glu Ile Met Asp Glu Leu Asp Ala Ala Gly

-65 -60 -55

gcc cag ccg ggt gtc gtc ggc tgg tac ccg gac ctc gcc ggc gac acc 462

Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Leu Ala Gly Asp Thr

-50 -45 -40

gtc gtc atc gag gcc acc gac acc tcc gag gcc cag agc ttc gtc gag 510

Val Val Ile Glu Ala Thr Asp Thr Ser Glu Ala Gln Ser Phe Val Glu

-35 -30 -25

gcc gcg ggc gtg gac tcc tcc gcc gtc cag gtg gag cag acc gac gag 558

Ala Ala Gly Val Asp Ser Ser Ala Val Gln Val Glu Gln Thr Asp Glu

-20 -15 -10

gcg ccg cag ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggt gac gcc tac tac atg 606

Ala Pro Gln Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Asp Ala Tyr Tyr Met

-5 -1 1 5 10

ggc ggc ggg cgc tgc tcg gtc gga ttc gcg gtc acc gac agt tcc ggc 654

Gly Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Ser Ser Gly

15 20 25

aac gac gga ttc gtg acg gcc ggc cac tgc ggc acg gtc ggc acc tcc 702

Asn Asp Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Ser

30 35 40

gcc gac agc gag gac ggc agc ggc tcc ggt gtg ttc gag gag tcc atc 750

Ala Asp Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Glu Glu Ser Ile

45 50 55

ttc ccg ggc aac gac gcg gcc ttc gtc agt tcg acg tcc aac tgg acc 798

Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Ser Ser Thr Ser Asn Trp Thr

60 65 70 75

gtc acc aac ctg gtc aac atg tac agc tcg ggt ggc acc cag tcc gtc 846

Val Thr Asn Leu Val Asn Met Tyr Ser Ser Gly Gly Thr Gln Ser Val

80 85 90

ggc ggc tcc agc cag gcc ccg gtc ggc gcg gcc gtc tgc cgt tcc ggc 894

Gly Gly Ser Ser Gln Ala Pro Val Gly Ala Ala Val Cys Arg Ser Gly

95 100 105

tcc acc acg ggc tgg cac tgc ggg tcc atc gag gcc cgc ggg cag tcg 942

Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Ser Ile Glu Ala Arg Gly Gln Ser

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Ser Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Ser Val

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125 130 135

gaa ccg ggc gat tca ggc ggc tca tat att agc ggc acg cag gcg caa 1038

Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln

140 145 150

ggc gtt aca tca ggc ggc tca ggc aat tgc aga aca ggc ggc act aca 1086

Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr

155 160 165 170

ttt tac caa gaa gtt aca ccg atg gta aat tca tgg ggc gtg cgc ctt 1134

Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu

175 180 185

cgc aca taa 1143

Arg Thr

<210>40

<211>380

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>40

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu

-190 -185 -180

Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Gly

-175 -170 -165

Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala Val Ser Met

-160 -155 -150

Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala Glu Ala

-145 -140 -135

Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu Val Asp Glu

-130 -125 -120

Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser Val Phe

-115 -110 -105

Asp Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ala Ala

-100 -95 -90

Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser Tyr

-85 -80 -75

Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln Glu Leu Asn Ala Ala Asp

-70 -65 -60 -55

Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly Asp Thr

-50 -45 -40

Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Ser Gly Leu

-35 -30 -25

Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val Thr Thr Ser

-20 -15 -10

Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr

-5 -1 1 5 10

Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly

15 20 25

Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln

30 35 40

Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro

45 50 55

Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr

60 65 70

Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly

75 80 85 90

His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr

95 100 105

Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser

110 115 120

Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala

125 130 135

Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln

140 145 150

Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr

155 160 165 170

Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu

175 180 185

Arg Thr

Claims

1.在革兰氏阳性宿主细胞中生产异源S2A/S1E蛋白酶的方法，该方法包括以下步骤：

(a)以补料分批发酵将包含至少一种编码异源S2A/S1E蛋白酶的多核苷酸的革兰氏阳性细胞在有益于生产所述蛋白酶的条件下进行培养，其中所述培养的时间的至少20％发生在36.5℃以下的温度；和

(b)回收所述蛋白酶。

2.根据权利要求1的方法，其中所述革兰氏阳性宿主细胞是芽孢杆菌属细胞。

3.根据权利要求1或2的方法，其中革兰氏阳性宿主细胞是选自嗜碱性芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，短芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，Bacillus clausii，凝结芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，和苏云金芽孢杆菌的芽孢杆菌属的菌种。

4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中S2A/S1E蛋白酶包含与SEQID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：32；或SEQ ID NO：34中所示多肽的成熟部分的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中S2A/S1E蛋白酶源自一种或多种选自拟诺卡氏菌属菌种NRRL 18262，达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235，Nocardiopsis Alba DSM 15647，Nocardiopsis prasina DSM15648，Nocardiopsis prasina DSM 15649，Nocardiopsis prasina(早先为alba)DSM 14010，拟诺卡氏菌属菌种DSM 16424，Nocardiopsis alkaliphila DSM44657，和卢森坦类诺卡氏菌DSM 44048中的拟诺卡氏菌属菌种。

6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中至少一种多核苷酸包含与SEQ ID NO：3的位置577-1140中；SEQ ID NO：5的位置526-1089中；SEQID NO：9的位置508-1083中；SEQ ID NO：13的位置519-1085中；SEQ IDNO：17的位置568-1143中；SEQ ID NO：19的位置574-1149中；SEQ ID NO：21的位置574-1149中；SEQ ID NO：23的位置586-1152中；SEQ ID NO：25的位置586-1149中；SEQ ID NO：27的位置586-1152中；SEQ ID NO：29的位置502-1065中；SEQ ID NO：31的位置496-1059中；SEQ ID NO：33的位置499-1062中；SEQ ID NO：35的位置577-1140中；SEQ ID NO：37的位置577-1140中；或SEQ ID NO：39的位置577-1140中所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中在至少一种多核苷酸中的密码子用法对应于芽孢杆菌属细胞中的平均密码子用法；优选地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞；更加优选地衣芽孢杆菌ATCC 14580细胞。

8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述培养步骤的至少50％的时间发生在36.5℃以下的温度；优选在36℃以下的温度；更加优选在35℃以下的温度，还更加优选在33℃以下，或最优选在31℃以下的温度。

9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述培养步骤的最初的50％或更少的时间发生于31℃以上的温度；优选所述培养步骤的最初的40％或更少的时间；更加优选最初的30％或更少；或最优选所述培养步骤的最初的20％或更少的时间发生于31℃以上的温度。

10.权利要求9的方法，其中最初的50％或更少，40％或更少，30％或更少，或20％或更少的培养步骤的时间发生在33℃以上的温度；优选35℃以上；或最优选36℃以上的温度。