CN103608457A

CN103608457A - 表达方法

Info

Publication number: CN103608457A
Application number: CN201280028836.1A
Authority: CN
Inventors: L·马克西姆; R·克纳布; S·埃弗斯; K－H·莫勒; J·邦加特斯
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2011-04-13
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2014-02-26
Also published as: CA2831473A1; WO2012139964A1; RU2642324C2; DK2697376T3; PL2697376T3; MX2013011816A; US20140220628A1; EP2697376A1; JP6099627B2; JP2014511702A; DE102011007313A1; ES2639114T3; US9663798B2; RU2013150276A; KR20140019436A; JP2017079768A; BR112013025951A2; MX348766B; EP2697376B1

Abstract

本发明的目的是提高微生物发酵中的蛋白质产率。这通过下述方法来实现，所述方法中不仅将编码所述蛋白质的第一表达构建体引入到所述微生物中，还将第二表达构建体引入到所述微生物中，所述第二表达构建体编码不同于所述蛋白质的辅助蛋白酶，所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性且包含与SEQ ID NO.1中所示的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列。

Description

表达方法

本发明属于生物技术，更具体而言，微生物蛋白质合成领域。本发明尤其涉及利用遗传修饰的微生物制备蛋白质的方法，此外，提出用于这类方法的微生物。本发明还涉及这类微生物在蛋白质制备中的用途。

微生物可以用来制备有价值的物质。有价值的物质是例如低分子量化合物（例如食品添加剂或药物活性化合物）或蛋白质，对于蛋白质，由于蛋白质的多样性，又存在巨大的工业应用领域。首先，为了制备有价值的物质而开发和/或修饰所讨论的微生物的代谢性质；其次，优选使用表达目的蛋白质的基因的微生物。

对于工业规模的生物技术生产，将所讨论的微生物培养在相应地适应于所述微生物的代谢性质的发酵罐中。培养过程中，微生物代谢所提供的底物，并形成希望的产物，通常在发酵结束后将该产物与生产微生物分离，并从发酵浆液和/或发酵培养基纯化和/或浓缩所述产物。在蛋白质的发酵生产中，除碳源（通常为葡萄糖）外，通常将富含复合蛋白的原料用作底物。因此，蛋白质生产对应于底物蛋白至靶蛋白的生物转化。这需要将底物蛋白完全水解为单个氨基酸，然后该氨基酸可用于靶蛋白的生物合成。

因此，对于微生物的发酵，存在综合的现有技术，其从所讨论的菌株的优化（例如关于形成的速率和营养物利用）延伸至发酵罐的技术设计，以从所讨论的微生物和/或发酵培养基获得有价值的物质。

通常，微生物发酵中希望得到非常高的产品产率（product yield）。例如，国际专利申请WO91/02792公开了来自迟缓芽孢杆菌（Bacilluslentus）的碱性蛋白酶在来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的基因调节序列（更具体而言，地衣芽孢杆菌启动子）的控制下在优化的地衣芽孢杆菌菌株中的改善的发酵生产。

来自Wu等的出版物（J.Bacteriol.173(16),4952–8(1991);Appl.Environ.Microbiol.68(7),3261–9(2002)）提出关闭微生物内源表达的蛋白酶，以提高靶蛋白的产率。这旨在防止靶蛋白的蛋白水解降解，将微生物的合成能力集中在希望的产物上。

仍然存在对允许高产品产率的微生物发酵方法的巨大需求。现已发现，令人惊奇地，与前述出版物相反，特别地，额外表达特定的辅助蛋白酶对产品产率有利。

本发明的目的是提高微生物发酵中的产率，尤其是蛋白质的产率。

本发明提供利用微生物制备蛋白质的方法，其包括方法步骤：

（a）将编码所述蛋白质的第一表达构建体引入到所述微生物中；

（b）将编码辅助蛋白酶的第二表达构建体引入到所述微生物中，所述辅助蛋白酶不同于所述蛋白质，且包含与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50%的同一的氨基酸序列，其中所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性；

（c）在所述微生物中表达所述蛋白质和辅助蛋白酶。

根据本发明的方法任选地进一步包括其他方法步骤：

（d）培养所述微生物。

因此，在根据本发明的优选实施方案中，根据本发明的方法是发酵方法。

意外地，在微生物中引入和表达辅助蛋白酶未例如由于所表达的辅助蛋白酶的蛋白水解活性（其可以降解所合成的靶蛋白）而导致蛋白质产率（靶蛋白）降低。相反，辅助蛋白酶的表达导致蛋白质产率提高。在本发明的优选实施方案中，辅助蛋白酶涉及底物蛋白的水解，并优选与微生物的其他染色体编码的蛋白酶（=背景蛋白酶）一起导致底物蛋白的消化的改善，使得生产过程中每单位时间有更多的所需前体分子（尤其是氨基酸）可用于靶蛋白的合成。因此，在根据本发明的这类实施方案中，就微生物的底物消化而言，背景蛋白酶的底物特异性和辅助蛋白酶的底物特异性有利地彼此互补。

在这方面，在本发明的其他优选实施方案中，辅助蛋白酶不需要占发酵产物的显著比例。在这方面，辅助蛋白酶对蛋白质的表达，由此对蛋白质产率具有有益作用，但其在发酵产物中的比例优选很小或甚至不可确定。优选地，辅助蛋白酶在发酵产物中的比例以重量计小于25%，且优选小于20%、15%、10%、8%、7%、6%、5%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.5%、0.1%和0.05%。在这方面，发酵产物是这样的组合物，其中在已进行根据本发明的方法、已在培养基中培养微生物和任选地为了从微生物释放蛋白质已破裂微生物（如果所述微生物不分泌蛋白质）后存在该蛋白质。优选地，已将微生物或其片段与发酵产物分离。

在优选实施方案中，根据本发明的方法是用于提高蛋白质在微生物中的表达的方法。与相似的方法相比，根据本发明的方法产生更大量的蛋白质，提高了蛋白质表达，所述相似的方法与根据本发明的方法的不同仅在于省去了所述方法的方法步骤b），结果导致方法步骤c）中无辅助蛋白酶表达。在这方面，用于比较的两种方法在相同的条件、相同的持续时间，使用仅因辅助蛋白酶的存在或缺乏而不同的微生物进行。

表达构建体是使得蛋白质或辅助蛋白酶能够在微生物中表达的核酸序列。它包含遗传信息，即编码该蛋白质或该辅助蛋白酶的核酸序列（基因）。核酸序列的表达是所述序列翻译为它所编码的基因产物，即翻译为多肽（蛋白质）或翻译为多种多肽（蛋白质）。术语多肽和蛋白质在本申请中作为同义词使用。对于本发明的目的，表达意指从遗传信息生物合成核糖核酸（RNA）和蛋白质。通常，表达包括转录，即根据基因的DNA（脱氧核糖核酸）序列合成信使核糖核酸（mRNA），以及mRNA翻译为对应的多肽链，该多肽链可以额外地进行翻译后修饰。因此，蛋白质的表达描述了从存在于根据本发明的微生物中的遗传信息生物合成所述蛋白质。

表达构建体进一步包含对编码所述蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列的表达具有调控功能的至少一种核酸序列，优选DNA（称为基因调节序列）。在这种情况下，基因调节序列是通过其在特定微生物中的存在来影响（优选提高）编码蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列的转录速率的任意核酸序列。优选地，它是启动子序列，因为这种序列为核酸序列的表达所必需。然而，根据本发明的表达构建体还可以包含其他基因调节序列，例如一个或多个增强子序列。因此，用于本发明的目的的表达构建体包含由基因和启动子组成的至少一个功能单位。它可以但并非必须以物理实体存在。

至少一个启动子的存在为根据本发明的表达构建体所必需。因此，启动子理解为意指允许调节基因表达的DNA序列。启动子序列是基因的天然组分，且通常定位在5’端，因此在RNA编码区之前。优选地，根据本发明的表达构建体中的启动子序列定位在编码蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列的5’上游。启动子最重要的性质是与至少一种DNA结合蛋白或多肽特异地相互作用，所述DNA结合蛋白或多肽介导通过RNA聚合酶进行的基因转录的起始，称为转录因子。通过RNA聚合酶进行的转录起始常涉及多种转录因子和/或其他蛋白质。因此，启动子优选是具有启动子活性的DNA序列，即至少瞬时结合至少一种转录因子以起始基因转录的DNA序列。启动子的强度可通过所表达的基因的转录速率来测量，即通过每单位时间产生的RNA分子，具体而言，mRNA分子的数目来测量。根据本发明的表达构建体的启动子可以是微生物的内源启动子。因此，这种启动子序列天然存在于微生物中。备选地，还可以以重组方式将根据本发明的表达构建体的启动子引入微生物中。相同的情况还适用于根据本发明的表达构建体可以具有的所有其他基因调节序列。

第一表达构建体编码蛋白质。因此，它包含编码所述蛋白质的核酸序列。对于此目的，基本上能使用可翻译为蛋白质的任意希望的核酸序列。在这种情况下，它是待用根据本发明的方法制备的蛋白质（靶蛋白）。优选地，它是酶，更优选下文所述的酶。

第二表达构建体编码辅助蛋白酶。所述辅助蛋白酶不同于所述蛋白质，即所述辅助蛋白酶和所述蛋白质具有不同的氨基酸序列。所述辅助蛋白酶包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50%，且优选地至少55%、60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，极其优选100%的同一性程度。特别优选地，所述辅助蛋白酶具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50%，且优选地至少55%、60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，极其优选100%的同一性程度。

通过序列比较来确定核酸或氨基酸序列的同一性。通过将核苷酸序列或氨基酸序列中相似的字符（succession）分配至彼此来实现这种比较。此种序列比较优选根据现有技术中已确立且常用的BLAST算法来进行（参见例如Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.(1990)"Basic local alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403–410；及Altschul,Stephan F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,JinghuiZhang,Hheng Zhang,Webb Miller和David J.Lipman(1997):"GappedBLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database searchprograms";Nucleic Acids Res.,25,3389–3402页），且基本上通过将核酸或氨基酸序列中相似的核苷酸或氨基酸的字符分配至彼此而进行。所讨论的位置的表格分配（tabular assignment）称为比对。现有技术中可用的另一算法是FASTA算法。通常用计算机程序产生序列比较（比对），更特别地，多重序列比较。常用的是例如Clustal系列（参见例如Chenna等(2003):Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.Nucleic Acid Research31,3497–3500）、T-Coffee（参见例如Notredame等(2000):T-Coffee:A novel method for multiple sequence alignments.J.Mol.Biol.302,205–217）或基于所述程序或算法的程序。对于本发明的目的，用计算机程序Vector

Suite10.3（Invitrogen Corporation,1600Faraday Avenue,Carlsbad,California,USA），优选使用预设的标准（默认）参数来产生序列比较和比对。

这种比较使得可能揭示所比较的序列相互之间的相似性。它通常报告为百分比同一性，即相同的位置上或比对中相互对应的位置上相同的核苷酸或氨基酸残基的比例。在氨基酸序列的情况下，含义扩展的术语同源性考虑保守氨基酸取代，即具有相似性质的氨基酸，因为它们通常在蛋白质内产生相似的活性或功能。因此，所比较的序列的相似性还可以报告为百分比同源性或百分比相似性。可以在整个多肽或基因内或仅在特定区域内报告同一性和/或同源性。因此，通过序列的一致性来定义不同核酸或氨基酸序列的同源区或相同区。它们通常具有相同或相似的功能。它们可以很小，且仅包含几个核苷酸或氨基酸。这类小区域通常执行蛋白质的整体活性所必需的功能。因此，仅将序列一致性基于特定的可能很小的区域是合理的。然而，除非另有说明，本申请中的同一性或同源性值指所示多种核酸或氨基酸序列的全长。在蛋白质（具体而言，酶，且下文尤其指蛋白酶）的情况下，除非另有说明，该值还指多种成熟蛋白质。因此，除非另有说明，序列图涉及成熟、完全加工的蛋白质，即使相关基因编码未成熟形式的蛋白质，翻译后进一步加工为成熟形式的蛋白质。

此外，辅助蛋白酶具有蛋白水解活性。因此，它具有催化活性，即它是活性酶。可以按照本领域的常规测量来进行酶活性的测定（在这方面，适合特定的酶类型）。用于测定活性的方法为酶技术领域技术人员所熟悉，并常规使用。用于测定蛋白酶活性的方法例如公开于Tenside,7卷(1970),125–132页中。此外，可以通过从底物suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对-硝基苯胺（suc-AAPF-pNA）释放生色团对-硝基苯胺（pNA）来测定蛋白水解活性。蛋白酶切割底物并释放pNA。pNA的释放导致410nm处吸光度的提高，它随时间的变化是酶活性的测量结果（参见Del Mar等,1979）。该测量在25℃、pH8.6及410nm的波长下进行。测量时间为5分钟，测量间隔为20秒至60秒。优选以PU（蛋白酶单位）报告蛋白酶活性。

可以通过本身已知的用于修饰核酸的方法来产生根据本发明的核酸和表达构建体。这类方法例如出现在相关的手册（如Fritsch,Sambrook和Maniatis,―Molecular cloning:a laboratory manual‖,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York,1989）中，并为生物技术领域技术人员所熟悉。这类方法的实例是任选地与分子生物学和/或化学或生物化学中的其他标准方法结合的化学合成或聚合酶链反应（PCR）。

本发明尤其适合于蛋白质（特别地，酶）的重组制备。对于此目的，优选通过转化来将第一和第二表达构建体引入微生物中。在这方面，优选通过载体（具体而言，表达载体）来引入特定的表达构建体或其部分。然而，还可能仅将表达构建体的部分（优选至少编码蛋白质或辅助蛋白酶的核酸）引入微生物中，使得仅在微生物中出现完整的表达构建体。这可以例如通过载体来实现，该载体使得待引入宿主细胞的蛋白质基因和/或辅助蛋白酶基因能够进入已经存在的遗传元件（如染色体、染色体DNA或其他载体），例如，用内源启动子来进行蛋白质基因或辅助蛋白酶基因的表达。更特别地，编码辅助蛋白酶的基因可以以这种方式与微生物的内源启动子功能性连接，然后构成第二表达构建体。因此，术语引入不仅包括将表达构建体以其整体引入（优选转化）到微生物的可能性，还包括仅将表达构建体的部分（优选编码辅助蛋白酶的核酸）引入（优选转化）到微生物且仅在微生物中出现完整的表达构建体的可能性。然而，对于本发明的目的，总是将表达构建体的至少部分引入微生物中。

载体为生物技术领域技术人员已知。尤其在用于细菌中时，它们是特定的质粒，即环状遗传元件。对于本发明的目的，优选将表达构建体克隆入载体。载体可以例如包括来源于细菌质粒、病毒或噬菌体的那些载体，或主要为合成的载体，或包含多样来源的元件的质粒。每种情况下存在的其他遗传元件使得载体能够作为稳定单位在微生物中存在多代。在这方面，它们是否作为分开的单位存在于染色体外或整合入染色体或染色体DNA对发明的目的而言并不重要。选择许多系统中的哪一种取决于个案。关键因素可以是例如可达到的拷贝数、可用的选择系统（尤其包括抗生素抗性）或能够摄取载体的微生物的可培养性。

此外，表达载体可以是通过培养条件的变化（例如细胞密度或特定化合物的加入）来调节的。这种化合物的实例是半乳糖衍生物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），其用作细菌乳糖操纵子（lac操纵子）的激活剂。在本发明的另一实施方案中，根据本发明的方法的区别在于这样的事实，所述蛋白质并非天然存在于微生物中和/或所述辅助蛋白酶并非天然存在于微生物中。

关于这一点，―非天然存在‖意指蛋白质或辅助蛋白酶并非微生物的内源蛋白质或酶。因此，在所述微生物中不能由核酸序列表达所述蛋白质或辅助蛋白酶，所述核酸序列是以野生型形式存在的微生物的染色体DNA的部分。因此，所述蛋白质或所述辅助蛋白酶和/或编码所述蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列不存在于所述微生物的野生型形式中，和/或不能从所述微生物的野生型形式分离。优选地，已用基因技术方法将非天然存在于微生物中的蛋白质或非天然存在于微生物中的辅助蛋白酶或编码所述蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列明确引入微生物中，所以所述微生物富含所述蛋白质或辅助蛋白酶或编码所述蛋白质或辅助蛋白酶的核酸序列。然而，蛋白质或辅助蛋白酶也可以天然存在于另一微生物中——该讨论仅与用于所述方法的微生物相关。

蛋白质和辅助蛋白酶均可以非天然地存在于微生物中。然而，在备选实施方案中，所述蛋白质可以天然存在于所述微生物中，而所述辅助蛋白酶可以非天然地存在于所述微生物中。在另一备选实施方案中，还可能是所述蛋白质非天然地存在于所述微生物中，而所述辅助蛋白酶天然存在于所述微生物中。

在本发明的另一实施方案中，根据本发明的方法的区别在于这样的事实，辅助蛋白酶替换了微生物中的至少一个染色体编码的蛋白酶。在这种情况下，用作根据本发明的辅助蛋白酶的异源蛋白酶取代至少一个已存在的染色体蛋白酶。优选地，将编码辅助蛋白酶的核酸序列引入到编码微生物的蛋白酶的染色体核酸序列。结果，染色体编码的蛋白酶在功能上失活。微生物表达辅助蛋白酶而不是染色体编码的蛋白酶。为了表达辅助蛋白酶，可能使用用于染色体编码的蛋白酶的原始启动子，所以第二表达构建体在这种情况下不仅包含编码辅助蛋白酶的核酸序列，还包含染色体编码的蛋白酶的启动子序列，即微生物的天然启动子序列。备选地，可能使用特异地用于辅助蛋白酶的启动子，所以除编码辅助蛋白酶的核酸序列外，第二表达构建体在这种情况下不包含染色体编码的蛋白酶的启动子序列。优选地，第二表达构建体在这种情况下包含微生物的非天然启动子序列。如果使用特异地用于辅助蛋白酶的启动子，则优选将它与编码辅助蛋白酶的核酸序列一起引入到微生物的染色体编码的蛋白酶的核酸序列中。在另一备选实施方案中，为了表达辅助蛋白酶，可能使用用于染色体编码的蛋白酶的启动子和特异地用于辅助蛋白酶的启动子。

在根据本发明的另一实施方案中，根据本发明的方法的区别在于这样的事实，除染色体编码的蛋白酶外，辅助蛋白酶也在微生物中表达。在这种情况下，在所述微生物中由作为根据本发明的辅助蛋白酶的异源蛋白酶提供额外的蛋白水解活性。因此，第二表达构建体优选包含至少编码辅助蛋白酶的核酸序列，以及预期用于表达辅助蛋白酶的启动子。优选地，第二表达构建体在这种情况下包含微生物的非天然启动子序列。

在特别优选的实施方案中，根据本发明的方法的区别在于这样的事实，辅助蛋白酶替换微生物中的至少一种染色体编码的蛋白酶，该染色体编码的蛋白酶包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，极其优选100%的同一性程度。特别优选地，该染色体编码的蛋白酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80%，优选地至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，极其优选100%的同一性程度。特别优选地，在微生物（其是细菌，具体而言，是芽孢杆菌属（Bacillus）的一种，且在下文中优选地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis））中替换这种蛋白酶。

在本发明的另一实施方案中，根据本发明的方法的区别在于这样的事实，辅助蛋白酶的表达使蛋白质的表达增加。如上文已解释，在根据本发明的优选实施方案中，辅助蛋白酶的表达导致该蛋白质的产率提高。这通过微生物表达的蛋白质增加，即合成的增加来实现。辅助蛋白酶涉及底物蛋白的水解，并任选地与微生物的其他染色体编码的蛋白酶一起导致在培养过程中提供给微生物的底物蛋白的改善的消化。结果，更多的所需前体分子，具体而言，氨基酸可用于蛋白质的合成。

通过编码蛋白质的核酸序列的转录速率及其翻译为希望的蛋白质的速率（即通过每单位时间内产生的蛋白质的数目）来解决此问题。将翻译步骤包括在表达的测定中。用于比较的方法是因缺乏辅助蛋白酶而不同于根据本发明的方法。根据本发明在相同类型的微生物中并在相同的条件下进行这种比较，以确保测量结果的可比性。

在本发明的优选实施方案中，所述方法的区别在于这样的事实，蛋白质是酶，更特别地，蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、卡拉胶酶(carrageenase)、过氧化氢酶(perhydrolase)、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶。极其优选地，所述蛋白质是蛋白酶。待产生的蛋白酶（=靶蛋白酶）因此也同时涉及底物蛋白的水解，并可以有利地导致底物蛋白消化的进一步改善。

例如，可能用根据本发明的方法来有利地制备下文提到的酶。

在蛋白酶中，优选枯草杆菌蛋白酶。实例是枯草杆菌蛋白酶BPN'和Carlsberg、蛋白酶PB92、枯草杆菌蛋白酶147和309、来自迟缓芽孢杆菌的碱性蛋白酶、枯草蛋白酶DY，及分配至枯草杆菌酶（subtilase）而不再分配至狭义的枯草杆菌蛋白酶的酶，这些酶是耐热蛋白酶(thermitase)、蛋白酶K及蛋白酶TW3和TW7。枯草杆菌蛋白酶Carlsberg可在商品名下从Novozymes A/S,

Denmark以进一步发展的形式获得。枯草杆菌蛋白酶147和309由Novozymes在商品名

或下销售。来源于迟缓芽孢杆菌的DSM5483蛋白酶是称为

的蛋白酶变体。此外，其他优选的蛋白酶是例如称为PUR的酶。此外，其他蛋白酶是可在商品名

和

下从Novozymes获得的酶，可在商品名

OxP、

Prime、

和

下从Genencor获得的酶，可在商品名

下从AdvancedBiochemicals Ltd.,Thane,印度获得的酶，可在商品名下从WuxiSnyder Bioproducts Ltd.,中国获得的酶，可在商品名

和下从Amano Pharmaceuticals Ltd.,Nagoya,日本获得的酶，及可在商品名Proteinase K-16下从Kao Corp.,Tokyo,日本获得的酶。此外，公开于国际专利申请WO2008/086916和WO2007/131656中的来自吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的蛋白酶也是优选的。

淀粉酶的实例是来自地衣芽孢杆菌、来自解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）或来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的α-淀粉酶，特别地，还有所述淀粉酶在用于洗涤剂或清洁剂中的改进的进一步发展的产品。来自地衣芽孢杆菌的酶可在名称

下从Novozymes及在名称

ST下从Danisco/Genencor获得。这种α-淀粉酶的进一步发展的产品可在商品名和

ultra下从Novozymes、名称

OxAm下从Danisco/Genencor及以

从Daiwa Seiko Inc.,Tokyo,日本获得。解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶由Novozymes在名称

下销售，来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶的变体同样由Novozymes在名称和

下销售。此外，应提到来自芽孢杆菌属（Bacillus sp.）A7-7（DSM12368）的α-淀粉酶及来自Bacillus agaradherens（DSM9948）的环糊精葡聚糖转移酶（CGTase）。类似地，可以使用所有前述分子的融合产物。此外，来自黑曲霉（Aspergillusniger）和米曲霉（A.Oryzae）的α-淀粉酶的进一步发展的产品也适合，所述进一步发展的产品可在商品名

下从Novozymes获得。其他有利的市售产品是例如来自Danisco/Genencor的淀粉酶

及淀粉酶

和Stainzyme

后者来自Novozymes。还可以根据本发明制备这些酶的变体，其可通过点突变获得。其他优选的淀粉酶公开于已公开的说明书WO00/60060、WO03/002711、WO03/054177和WO07/079938中，因此将所述说明书的公开内容在此明确引入作为参考，且将所述说明书的相关公开内容明确并入本专利申请。此外，根据本发明待制备的淀粉酶优选α-淀粉酶。

脂肪酶或角质酶的实例是最初从柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa）（疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)）获得或者进一步发展的脂肪酶，更特别地，具有氨基酸取代D96L的那些脂肪酶。它们例如由Novozymes在商品名

Ultra、

和

下销售。此外，可能制备例如最初分离自茄病镰刀菌(Fusariumsolani pisi)和特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶。从Danisco/Genencor，可能制备例如脂肪酶或角质酶,它们的起始酶最初分离自门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）和茄病镰刀菌。应提到的其他重要的市售产品是最初由Gist-Brocades（现在的Danisco/Genencor）销售的制剂M1

和

及由Meito Sangyo KK,日本在名称LipaseLipase

和Lipase

下销售的酶，此外还有来自Danisco/Genencor的产品

纤维素酶（内切葡聚糖酶，EG）的实例包括真菌的富含内切葡聚糖酶（EG）的纤维素酶制剂的系列，或其进一步发展的产品，它们由Novozymes在商品名

下提供。同样可从Novozymes获得的产品

和

分别基于来自特异腐质霉DSM1800的50kD EG和43kDEG。可以制备的该公司的其他市售产品是

和

还可能制备例如可在商品名

和下从AB Enzymes,Finland获得，且至少部分基于来自Melanocarpus的20kDEG的纤维素酶。来自AB Enzymes的其他纤维素酶是

和

其他合适的纤维素酶来自芽孢杆菌属CBS670.93和CBS669.93，来自芽孢杆菌属CBS670.93的纤维素酶可在商品名

下从Danisco/Genencor获得。可以制备的Danisco/Genencor的其他市售产品是―Genencor detergent cellulase L‖和Indi

Neutra。

根据本发明，还可能制备这些酶的变体，其可通过点突变获得。特别优选的纤维素酶是公开于国际公开的说明书WO98/12307中的太瑞斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）纤维素酶变体，公开于国际公开的说明书WO97/14804中的来自黑钩叶（Melanocarpus）（具体而言，Melanocarpusalbomyces）的纤维素酶，公开于欧洲专利申请EP1305432中的来自里氏木霉（Trichoderma reesei）的纤维素酶，或可从其获得的变体，更特别地，公开于欧洲专利申请EP1240525和EP1305432中的那些纤维素酶，以及公开于国际公开的说明书WO1992006165、WO96/29397和WO02/099091中的纤维素酶。将所述各个公开内容明确并入本文作为参考，且将所述各个公开内容的相关公开内容明确掺入本专利申请。

此外，可能制备由术语半纤维素酶所涵盖的其他酶。这些酶包括例如甘露聚糖酶、黄原胶裂合酶（xanthan lyase）、黄原胶酶、果胶裂合酶（=果胶酶）、果胶酯酶、果胶酸裂合酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、支链淀粉酶和β-葡聚糖酶。适于这方面的酶例如可在名称Pektinex

和

下从Novozymes，在名称

B1L下从ABEnzymes，及在名称

下从Diversa Corp.,San Diego,CA,USA获得。获自枯草芽孢杆菌的β-葡聚糖酶可在名称

下从Novozymes获得。根据本发明特别优选的半纤维素酶是甘露聚糖酶，其例如在商品名

下从Novozymes销售，或在商品名

下从Genencor销售。此外，还可能制备氧化还原酶，例如氧化酶；加氧酶；过氧化氢酶；过氧化物酶，如卤过氧化物酶（haloperoxidase）、氯过氧化物酶、溴代过氧化物酶、木质素过氧化物酶、葡萄糖过氧化物酶或锰过氧化物酶；双加氧酶或漆酶（酚氧化酶、多酚氧化酶）。应提到的合适的市售产品是来自Novozymes的

1和2。其他酶公开于国际专利申请WO98/45398、WO2005/056782、WO2004/058961和WO2005/124012中。

在本发明的另一实施方案中，该方法的区别在于该微生物是细菌的事实。

在根据本发明的方法中，细菌是优选的微生物。细菌具有短的世代时间，且就培养条件而言具有低需求。因此，可能建立低成本的培养方法或制备方法。此外，在细菌发酵技术的情况下，对本领域技术人员而言，有大量的经验可用。革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌都是合适的。

在革兰氏阴性细菌（例如大肠杆菌（Escherichia coli））的情况下，多种蛋白质分泌进入周质间隙，即分泌进入围绕细胞的两层膜之间的区室。这可能对特定的应用有利。此外，还可能这样配置革兰氏阴性细菌，使得它们不仅将所表达的蛋白质排入周质间隙，还排入围绕细菌的培养基中。相反，革兰氏阳性细菌（例如芽孢杆菌或诸如放线菌科（Actinomycetaceae）的微生物或放线菌目（Actinomycetales）的其他代表性菌株）不具有外膜，所以分泌的蛋白质立即释放到围绕细菌的介质（通常为培养基）中，因此可以从所述介质纯化所表达的蛋白质。可以直接从培养基分离或进一步处理所述蛋白质。

根据本发明优选的细菌选自下列细菌之一：埃希氏菌属（Escherichia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、芽孢杆菌属、葡萄球菌属（Staphylococcus）、棒杆菌属（Corynebakterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）和弧菌属（Vibrio）。更优选地，所述细菌选自下列细菌之一：大肠杆菌、植生克雷伯氏菌（Klebsiella planticola）、荚壳伯克氏菌（Burkholderia glumae）、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）、球芽孢杆菌（Bacillus globigii）、吉氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、氧化节杆菌（Arthrobacter oxidans）、浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans）、天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）、嗜麦芽糖寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）和麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。特别优选所述细菌是地衣芽孢杆菌。

然而，微生物也可以是真核细胞，其特征在于具有核。与原核细胞不同，真核细胞能够在翻译后修饰所形成的蛋白质。所述真核细胞的实例是诸如放线菌科的真菌或诸如酵母属（Saccharomyces）或克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces）的酵母。这在例如蛋白质进行与其合成相结合的特定修饰（这类系统所允许）时可以尤其有利。真核系统进行的尤其是与蛋白质合成相结合的修饰包括例如低分子量化合物（如膜锚着点或寡糖）的结合。这类寡糖修饰可以例如是为降低所表达的蛋白质的变应原性所希望的。与由这类细胞天然形成的酶（例如纤维素酶或脂肪酶）共表达也可以是有利的。此外，嗜热真菌表达系统可能例如尤其适合于表达温度抗性蛋白或变体。

可以用根据本发明待使用的微生物在培养条件方面的需要修饰所述微生物，其可以具有其他或额外的选择标记，或可以表达其他或额外的蛋白质。更特别地，该微生物可以是转基因表达多种靶蛋白的那些微生物。优选地，它们将蛋白质（靶蛋白）分泌到围绕该微生物的培养基中。

可以例如在分批系统或连续系统中以常规方式培养和发酵用于根据本发明的方法的微生物。在第一种情况下，用微生物接种适当的培养基，并在待用实验确定的时期后从培养基收获蛋白质。连续发酵涉及达到稳态，其中在比较长的时期内，部分细胞死亡，其他细胞再次生长，同时可以从培养基取出所形成的蛋白质。

根据本发明的方法优选是发酵方法。发酵方法本身从现有技术已知，且构成实际的工业规模的生产步骤，紧接着通常是用于所制备的蛋白质的适当的纯化方法。涉及根据本发明的用于制备蛋白质的方法的所有发酵方法构成此发明主题的实施方案。

表征为通过摄取策略进行发酵的发酵方法是特别有可能的。在这种情况下，额外地提供由正在进行的培养消耗的培养基组分。结果，可以达到细胞密度和细胞团和/或干物质的明显增加。此外，还可以这样配置发酵，使得在每种情况下通过加入缓冲液或合适的抗衡离子来滤出或中和不想要的代谢产物。

可以从发酵培养基收获所制备的蛋白质。这种发酵方法优于从微生物分离蛋白质，即从细胞团（干物质）加工产物。这可以例如通过为合适的微生物提供一种或多种合适的选择标记或机制和/或转运系统，使得微生物将蛋白质分泌到发酵培养基来实现。在缺乏分泌的情况下，备选地，有可能例如通过用硫酸铵或乙醇沉淀，或通过层析纯化从宿主细胞分离蛋白质，即从细胞团纯化蛋白质。

本发明还提供微生物，其可通过包括以下方法步骤的方法获得：

（a）将编码蛋白质的第一表达构建体引入到所述微生物中；

（b）将编码辅助蛋白酶的第二表达构建体引入到所述微生物中，所述辅助蛋白酶不同于所述蛋白质，且包含与SEQ ID NO.1（=Blap S）中所示的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列，其中所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性。

因此，这是可以作为根据本发明的方法的主题的所有微生物。针对根据本发明的方法描述的所有事实、主题和实施方案也可适用于此发明主题。因此，在这一点上明确参考的公开内容也适用于根据本发明的微生物的对应的点上的公开内容。

根据本发明的微生物特别优选的实施方案的区别在于以下事实：

（a）蛋白质非天然地存在于该微生物中；和/或

（b）辅助蛋白酶非天然地存在于该微生物中；和/或

（c）所述辅助蛋白酶替换所述微生物中的至少一种染色体编码的蛋白酶，或除染色体编码的蛋白酶外，所述辅助蛋白酶在所述微生物中表达；和/或

（d）所述辅助蛋白酶的表达使所述蛋白质的表达增加；和/或

（e）所述微生物是细菌，其优选地选自下述细菌之一：埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、伯克霍尔德氏菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、棒杆菌属、节杆菌属、链霉菌属、寡养单胞菌属、假单胞菌属和弧菌属。更优选地，所属细菌选自下述细菌之一：大肠杆菌、植生克雷伯氏菌、荚壳伯克氏菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、球芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肉葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、氧化节杆菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌和麦氏弧菌。特别优选地所述细菌是地衣芽孢杆菌。

为了制备蛋白质，将根据本发明的微生物有利地用于根据本发明的方法。因此，本发明进一步提供根据本发明的微生物在制备蛋白质（具体而言，酶）中的用途。

针对根据本发明的方法和微生物描述的所有事实、主题和实施方案也可适用于此发明主题。因此，在这一点上明确参考的公开内容也适用于根据本发明的用途的对应的点上的公开内容。

实施例

所有分子生物学方法步骤按照例如手册Fritsch,Sambrook和Maniatis―Molecular cloning:a laboratory manual‖,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York,1989或类似相关著作中指出的标准方法进行。酶、试剂盒和仪器按照各自厂家的说明使用。

实施例1：

在地衣芽孢杆菌中用编码根据SEQ ID NO.1的辅助蛋白酶的基因取代编码根据SEQ ID NO.2的蛋白酶的基因（aprE）

用以下寡核苷酸作为引物（以5'→3'的方向指出）：

aprE1(SEQ ID AAACTGCAGCGTACCGGCTCCTTGAAAGGNO.3)

aprE2(SEQ ID GAGAAGACTAAGCTTCCCGAGGATCCCGANO.4)ATGACAGG AGATTGCTCCATC

aprE3(SEQ ID TTCGGGATCCTCGGGAAGCTTAGTCTTCTNO.5)CATTCTGATGAAGGTTGTTCAATATTTTGAATCC

aprE4(SEQ ID AAATCTAGATAGACCTCGAAGAGGAGAAGNO.6)C

tet5(SEQ ID GCGGATCCAAACGGGCCATATTGTTGTATNO.7)AAG

tet6(SEQ ID CCAAGCTTCTCTCGTATCTTTTATTCAGCANO.8)ATCGC

aprE7(SEQ ID CGAAAGTATGAATAGACCGCTTCAGCCTGNO.9)GCAGGGAAAGAGGTCCCGAGG

aprE8(SEQ ID CTGCCGCTCAATAACATATTCTAACAAATANO.10)GCATATAGAAAAAGCTAGTG

ziel9(SEQ ID CTGCCAGGCTGAAGCGGTCTATTCATACTNO.11)TTCGAACTGAACATTTTTCTA

ziel10(SEQ ID ATTTGTTAGAATATGTTATTGATCGGCAGNO.12)CTTCGACATTGATCAGACCTT

用中间步骤来实现取代，其中首先用四环素抗性基因tet取代aprE基因。为了用tet基因取代aprE基因，用引物aprE1和aprE2及引物aprE3和aprE4分别扩增aprE基因的上游1033bp和下游1015bp的序列区段（侧翼A和B）。由于引物aprE2和aprE3的适当重叠，通过使用外侧引物aprE1和aprE4进行的融合聚合酶链反应（PCR）来融合两个侧翼。将2018bp的融合PCR产物克隆入载体pE194（Horinouchi&Weisblum,J.Bacteriol.(150),pages804ff.(1982)）的PstI和XbaI限制位点中。用引物tet5和tet6从质粒pBC16（Bernhard等,J.Bacteriol.(133),pages897ff.,(1978)）扩增tet基因，并克隆入融合的aprE侧翼的中间的BamHI和HindIII限制位点（参见图1）。将获得的质粒pRK25转化入地衣芽孢杆菌。在30℃用5μg/ml红霉素和15μg/ml四环素实现选择。在42℃培养后，通过在0.3μg/ml红霉素上培养来鉴定具有整合的载体的克隆。在42℃但不使用红霉素重新培养后，获得了这样的克隆，其是针对四环素抗性及通过PCR针对tet基因对aprE基因成功取代进行筛选的（地衣芽孢杆菌ΔaprE::tet，参见图2）。

为了用编码根据SEQ ID NO.1的辅助蛋白酶的基因取代tet基因，用引物aprE1和aprE7及引物aprE8和aprE4分别扩增aprE基因的上游1061bp和下游1058bp的序列区段（侧翼C和D）。用引物ziel9和ziel10从质粒pCB76R49CK扩增编码根据SEQ ID NO.1的辅助蛋白酶的基因。由于引物aprE7和ziel9及aprE8和ziel10的适当重叠，通过使用外侧引物aprE1和aprE4进行的融合PCR将两个侧翼与辅助蛋白酶PCR产物融合。将3704bp的融合PCR产物克隆入载体pRK25的PstI和NdeI限制位点中（参见图1）。将获得的质粒pRK19转化入地衣芽孢杆菌ΔaprE::tet（见上文）。在30℃用5μg/ml红霉素实现选择。在42℃培养后，通过在0.3μg/ml红霉素上培养来鉴定具有整合的载体的克隆。在42℃但不使用抗生素重新培养后，获得这样的克隆，其是通过PCR针对编码根据SEQ IDNO.1的辅助蛋白酶的基因对tet基因的成功取代进行筛选的（地衣芽孢杆菌ΔaprE::辅助蛋白酶，参见图2）。

实施例2：

用生产菌株地衣芽孢杆菌ΔaprE::辅助蛋白酶发酵产生蛋白酶（靶蛋白）

用蛋白酶（靶蛋白）的产生质粒转化地衣芽孢杆菌起始菌株及取代突变体ΔaprE::辅助蛋白酶。得到的生产菌株用于标准发酵方法，并测定所获得的蛋白酶活性。与起始菌株相比，在2升实验发酵罐中的产率提高了65%（参见图3）。测量的蛋白酶活性基本上基于靶蛋白酶的活性，这是因为靶蛋白酶的表达已显著增加。所述增加通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行的地衣芽孢杆菌ΔaprE::辅助蛋白酶/靶蛋白酶的培养物的发酵上清液的分泌分析来验证（参见图4；t是培养时间；AP103是辅助蛋白酶（两条带）；AP217是靶蛋白酶）。与靶蛋白酶相比，培养上清液中仅存在非常低的量的辅助蛋白酶。

附图描述

图1：显示构建载体pRK25和pRK19的简图，在pRK25和pRK19中，分别用四环素抗性基因tet和编码根据SEQ ID NO.1的辅助蛋白酶的基因染色体取代编码根据SEQ ID NO.2的蛋白酶的基因（aprE）。箭头表示基因ydeD、aprE和yhfN的可读框，

表示引物，条表示PCR产物。

图2：aprE基因在地衣芽孢杆菌中的基因定位。图片显示野生型情况（上），pRK19介导的四环素抗性基因tet取代aprE基因（中），及pRK25介导的编码根据SEQ ID NO.1的辅助蛋白酶的基因取代四环素抗性基因tet（下）。

图3：生产菌株地衣芽孢杆菌/靶蛋白酶和地衣芽孢杆菌ΔaprE::辅助蛋白酶/靶蛋白酶的相对产率。将菌株用于产生靶蛋白酶的标准发酵方法。

图4：利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对根据本发明的方法中或根据本发明的微生物中（地衣芽孢杆菌ΔaprE::辅助蛋白酶/靶蛋白酶，也参见图3）的发酵上清液进行的分泌分析。增加的蛋白酶活性基本上基于靶蛋白酶的活性，这是因为所述靶蛋白酶表达和分泌已显著增加（t：培养时间；AP103：辅助蛋白酶（两条带）；AP217：靶蛋白酶；Mpr：其他大小标记）。

Claims

1.利用微生物制备蛋白质的方法，其包括方法步骤：

（b）将编码辅助蛋白酶的第二表达构建体引入到所述微生物中，所述辅助蛋白酶不同于所述蛋白质，且包含与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50%的同一性的氨基酸序列，其中所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性；

（c）在所述微生物中表达所述蛋白质和辅助蛋白酶。

2.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质非天然地存在于所述微生物中和/或所述辅助蛋白酶非天然地存在于所述微生物中。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述辅助蛋白酶替换所述微生物中至少一种染色体编码的蛋白酶，或其中除染色体编码的蛋白酶外，所述辅助蛋白酶在所述微生物中表达。

4.根据权利要求3的方法，其中所述辅助蛋白酶替换所述微生物中的至少一种染色体编码的蛋白酶，所述染色体编码的蛋白酶包含与SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述辅助蛋白酶的表达使所述蛋白质的表达增加。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述蛋白质是酶，更特别地是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述微生物是细菌，其优选地选自下述细菌之一：埃希氏菌属（Escherichia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、棒杆菌属（Corynebakterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）和弧菌属（Vibrio）；更优选地，所述细菌选自下列细菌之一：大肠杆菌（Escherichia coli）、植生克雷伯氏菌（Klebsiella planticola）、荚壳伯克氏菌（Burkholderiaglumae）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、迟缓芽孢杆菌（Bacilluslentus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）、球芽孢杆菌（Bacillus globigii）、吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、氧化节杆菌（Arthrobacter oxidans）、浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans）、天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）、嗜麦芽糖寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）和麦氏弧菌（Vibrio metschnikovii）。

8.微生物，其通过包括以下方法步骤的方法获得：

（a）将编码蛋白质的第一表达构建体引入到所述微生物中；

（b）将编码辅助蛋白酶的第二表达构建体引入到所述微生物中，所述辅助蛋白酶不同于所述蛋白质，且包含与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列，其中所述辅助蛋白酶具有蛋白水解活性。

9.根据权利要求8的微生物，其中：

（a）所述蛋白质非天然地存在于所述微生物中；和/或

（b）所述辅助蛋白酶非天然地存在于所述微生物中；和/或

（e）所述微生物是细菌，其优选地选自下述细菌之一：埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、伯克霍尔德氏菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、棒杆菌属、节杆菌属、链霉菌属、寡养单胞菌属、假单胞菌属和弧菌属；更优选地，所述细菌选自下述细菌之一：大肠杆菌、植生克雷伯氏菌、荚壳伯克氏菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、球芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肉葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、氧化节杆菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌和麦氏弧菌。

10.根据权利要求8和9中任一项的微生物的用途，用于制备蛋白质，更特别地酶。