JP2017079768A - 発現方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】微生物発酵において、タンパク質の生成物収率が高められる製造方法、当該方法で得られる微生物、及び、タンパク質製造のための当該微生物の使用の提供。
【解決手段】タンパク質をコードする第１の発現コンストラクトの他に、前記タンパク質とは異なり、タンパク質分解活性があり、特定の配列を有するアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む補助プロテアーゼをコードする第２発現コンストラクトを微生物中に導入し、発現させて、微生物によるタンパク質を製造する方法。前記タンパク質及び／又は前記補助プロテアーゼは前記微生物中には天然に存在しない、タンパク質の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、バイオテクノロジー、特に微生物タンパク質合成の分野に属する。本発明は、特に、遺伝子改変した微生物によるタンパク質の製造方法に関し、さらにそのような方法で使用される微生物を提案する。さらに本発明は、タンパク質製造のためのそのような微生物の使用に関する。
原料の製造のために微生物を使用できる。原料は、例えば低分子量化合物、例えば栄養補助物質又は医薬有効化合物、又はタンパク質であり、それらにはその多様性のためにやはり大きな技術的使用分野が存在する。第１の場合には、問題となる微生物の代謝特性が原料製造のために利用及び／又は変更される。第２の場合には、好ましくは、興味の対象となるタンパク質の遺伝子を発現する微生物が使用される。
大工業的バイオテクノロジー生産のためには、問題となる微生物は、微生物の代謝特性に相応して適合されている発酵器中で培養される。微生物は提供された基質を培養の間に代謝し、そして所望の生成物を形成し、前記生成物は発酵終了後に通常は製造生物から分離され、発酵器スラリー及び／又は発酵器媒体から精製及び／又は濃縮される。発酵によるタンパク質製造の場合には、典型的には複雑なタンパク質リッチな原材料が、炭素供給源（典型的にはグルコース）の他に基質として使用される。それ故、タンパク質製造は、基質タンパク質から目的タンパク質へのバイオトランスフォーメーションに相応する。このことは、基質タンパク質を個々のアミノ酸へと完全に加水分解することを要求し、前記アミノ酸はこうして目的タンパク質の生合成のために提供される。
そのため、微生物の発酵には、豊富な先行技術が存在し、それは、問題となる株を、例えば形成速度及び栄養利用の点で最適化することから、発酵器の技術的構造を経て、問題となる微生物及び／又は発酵媒体から原料を獲得することにまで及ぶ。
通常は、可能な限り高い生成物収率が微生物発酵の場合に所望される。例えば、国際特許出願WO 91/02792は、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）、特にバチラス・リシエニフォルミスプロモーターからの遺伝子調節配列の制御下で、最適化したバチラス・リシエニフォルミス株中でバチラス・レンタス（Bacillus lentus）からのアルカリ性プロテアーゼの改善された発酵による製造を開示する。
Wu et al. (J. Bacteriol. 173(16), 4952-8 (1991); Appl. Environ. Microbiol. 68(7), 3261 -9 (2002))による刊行物では、目的タンパク質の収率を高めるために、微生物により内在的に発現したプロテアーゼを停止することが提案される。それによって、目的タンパク質のタンパク質加水分解は妨げられ、そして、微生物の合成能は所望の生成物に照準が合わせられる。
さらに、高い生成物収率を可能にする、微生物による発酵方法に関する高い要求が存在する。意外なことに、そして、前述の刊行物とは対照的に、まさに所定の補助プロテアーゼを追加的に発現させることが生成物収率にとって好ましいことが見出された。
国際公開第９１／０２７９２号パンフレット
Ｗｕら、Ｊ.Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９１年８月、第１７３巻、第１６号、ｐ.４９５２−４９５８ Ｗｕら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００２年７月、第６８巻、第７号、ｐ.３２６１−３２６９
本発明は、生成物収率、特にタンパク質収率を微生物発酵において高めるとの課題を基礎とする。
本発明の主題は、
以下の方法工程
（ａ）タンパク質をコードする第１の発現コンストラクトを微生物中に導入する工程、
（ｂ）前記タンパク質とは異なり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む補助プロテアーゼをコードする第２の発現コンストラクトを前記微生物中に導入する工程、ここで前記補助プロテアーゼはタンパク質加水分解活性を有する、
（ｃ）前記タンパク質及び前記補助プロテアーゼを前記微生物中で発現させる工程
を含む、微生物によるタンパク質の製造方法である。
さらに本発明の方法は、任意に、更なる方法工程
（ｄ）前記微生物を培養する工程
を含む。
それ故、本発明の好ましい一実施態様において、本発明の方法は、発酵方法である。
予期されなかったことに、微生物中への補助プロテアーゼの導入及び発現は、タンパク質（目的タンパク質）の生成物収率が、例えば、合成された目的タンパク質を分解することができる発現した補助プロテアーゼのタンパク質加水分解活性のために、減少することを生じない。それどころか、補助プロテアーゼの発現は、タンパク質の生成物収率が増加することを引き起こす。本発明の好ましい一実施態様において、補助プロテアーゼは、基質タンパク質の加水分解に関与し、そして、好ましくは更なる、染色体によってコードされた微生物プロテアーゼ（＝バックグラウンドプロテアーゼ）と一緒になって、基質タンパク質の改善された消化（Aufschluss）を引き起こし、その結果、製造プロセスにおいて目的タンパク質の合成のための時間単位あたりに、より多くの必要とされる前駆体分子、特にアミノ酸が提供される。したがって、そのような本発明の実施態様において、バックグラウンドプロテアーゼ及び補助プロテアーゼの基質特異性は、好ましくは微生物による基質消化に関して補い合う。
この点に関して、本発明の更なる好ましい一実施態様において、補助プロテアーゼが発酵生成物の著しい割合を占めることは必要でない。この点に関して、補助プロテアーゼは、タンパク質の発現に対し、ひいてはタンパク質の生成物収率に対し有益に作用するが、しかし好ましくは、発酵生成物中のその割合は少ないか又は全く把握可能でない。好ましくは、発酵生成物中のその割合は、２５％未満であり、より好ましくは２０質量％未満、１５質量％未満、１０質量％未満、８質量％未満、７質量％未満、６質量％未満、５質量％未満、２．５質量％未満、２質量％未満、１．５質量％未満、１質量％未満、０．５質量％未満、０．１質量％未満、０．０５質量％未満である。この点に関して、発酵生成物とは、本発明の方法を実施して培養媒体中の微生物を培養し、そして任意に、タンパク質が微生物から分泌されない限りタンパク質を放出させるべく微生物を破壊させた後に、前記タンパク質が含まれている組成物である。好ましくは、発酵生成物は微生物又はその破片から分離されている。
したがって、好ましい一実施態様において、本発明の方法は、微生物中のタンパク質発現を増加させるための方法である。タンパク質の増加した発現は、単に方法工程ｂ）を有しない点でのみ本発明の方法とは異なり、そのため、方法工程ｃ）において微生物中に補助プロテアーゼが発現されない同種の方法に比較して、本発明の方法によりより大量のタンパク質が得られる場合に存在する。この点に関して、比較すべき両方の方法は、同一条件下で、同一期間にわたり、単に補助プロテアーゼの存在又は非存在の点でのみ異なる微生物を用いて実施される。
テトラサイクリン耐性遺伝子tet又は配列番号１に記載の補助プロテアーゼをコードする遺伝子に対する、配列番号２に記載のプロテアーゼをコードする遺伝子（aprE）の染色体交換のためのベクターpRK25及びpRK19の構造の図示。矢印は、遺伝子ydeD, aprE及びyhfNのリーディングフレームを、黒三角はプライマーを、バーはＰＣＲ産物を指す。 バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）中のaprE遺伝子の遺伝子位置を示す。野生型状況（上方）、pRK19媒介した、テトラサイクリン耐性遺伝子tetに対するaprE遺伝子の交換（中央）、及び、pRK25媒介した、配列番号１記載の補助プロテアーゼをコードする遺伝子に対するテトラサイクリン耐性遺伝子tetの交換（下方）が示されている。 製造株バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）／目的プロテアーゼ及びバチラス・リシエニフォルミスΔaprE::補助プロテアーゼ／目的プロテアーゼの相対的収率。前記株を、目的プロテアーゼの生産のために標準発酵方法において使用した。 ネイティブポリアクリルアミド−ゲル電気泳動を用いた、本発明の方法又は本発明の微生物（バチラス・リシエニフォルミスΔaprE::補助プロテアーゼ／目的プロテアーゼ、図３も参照）中の発酵上清の分泌分析。増加したプロテアーゼ活性は、実質的に目的プロテアーゼの活性に基づく。それというのも、その発現及び分泌は顕著に高められたためである（ｔは培養時間を指し、AP103は補助プロテアーゼ（２本のバンド）、AP217は目的プロテアーゼ、Mprは更なるサイズマーカーである）。
発現コンストラクトは、タンパク質又は補助プロテアーゼが微生物において発現されることができるように働く核酸配列である。発現コンストラクトは、遺伝情報、すなわち、タンパク質又は補助プロテアーゼをコードする核酸配列（遺伝子）、を含む。核酸配列の発現は、１又は複数の、前記配列によってコードされた遺伝子産物、すなわち、１又は複数のポリペプチド（タンパク質）への翻訳である。ポリペプチド及びタンパク質の概念は、本出願において同義に使用される。したがって、本発明の意味合いにおいて、発現とは、遺伝情報からのリボ核酸（ＲＮＡ）及びタンパク質の生合成を指す。通常は、発現は、転写、すなわち、遺伝子のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列から出発したメッセンジャー（「messenger」）リボ核酸（ｍＲＮＡ）の合成と、相応するポリペプチド鎖（場合によってなお後翻訳により修飾され得る）へのその翻訳、を含む。したがって、タンパク質の発現は、本発明によれば微生物中に存在する遺伝情報からの、タンパク質の生合成を説明する。
さらに、発現コンストラクトは、少なくとも１の核酸配列、好ましくはＤＮＡであって、タンパク質又は補助プロテアーゼをコードする核酸配列の発現のための制御機能を有するもの（いわゆる遺伝子調節配列）を含む。この場合に、遺伝子調節配列は、そのつどの微生物中でその存在がタンパク質又は補助プロテアーゼをコードする核酸配列の転写頻度に影響する、好ましくはこれを高める全ての核酸配列である。好ましくは、遺伝子調節配列はプロモーター配列であり、それというのも、そのような配列は核酸配列の発現にとって本質的であるためである。しかし、本発明の発現コンストラクトは、なお更なる遺伝子調節配列、例えば１以上のエンハンサー配列を含むことができる。したがって、本発明の範囲内で、発現コンストラクトは、遺伝子及びプロモーターからの機能ユニットを少なくとも１つ含む。そのユニットは、必ず必要であるわけではないが、物理的ユニットとして存在できる。
少なくとも１のプロモーターの存在は、本発明の発現コンストラクトにとって本質的である。したがって、プロモーターとは、調節された遺伝子発現を可能にするＤＮＡ配列が理解される。無論、プロモーター配列は、遺伝子の構成要素であり、そして、しばしばその５′末端に、したがってＲＮＡコード領域の前に存在する。好ましくは、プロモーター配列は、本発明の発現コンストラクトにおいてタンパク質又は補助プロテアーゼをコードする核酸配列の５′側に存在する。プロモーターの最も重要な特性は、少なくとも１のＤＮＡ結合タンパク質又はポリペプチドとの特別な相互作用であり、これは遺伝子転写開始をＲＮＡポリメラーゼによって媒介し、そして転写因子と称される。しばしば、複数の転写因子及び／又は更なるタンパク質がＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始時に関与される。したがって、プロモーターは、好ましくはプロモーター活性を有するＤＮＡ配列、すなわち、少なくとも１の転写因子が遺伝子転写の開始のために少なくとも一過的に結合するＤＮＡ配列である。プロモーターの強度は、発現した遺伝子の転写頻度を介して、すなわち、時間単位あたりに生じたＲＮＡ分子、特にｍＲＮＡ分子の数を介して測定可能である。本発明の発現コンストラクトのプロモーターは、微生物の固有プロモーターであってよい。したがって、そのようなプロモーター配列は、天然に微生物中に存在する。代わりに、本発明の発現コンストラクトのプロモーターは、組み換えによって微生物中に導入されていてもよい。本発明の発現コンストラクトのプロモーターは、微生物の固有プロモーターであってよい。
同様のことは、本発明の発現コンストラクトが有することができる全ての更なる遺伝子調節配列にも該当する。
第１の発現コンストラクトはタンパク質をコードする。したがって、このコンストラクトは、前記タンパク質をコードする核酸配列を含む。そのためには、根本的に、前記タンパク質に翻訳できる任意の核酸配列が使用可能である。この場合に、これは、本発明の方法を用いて製造されることが望まれるタンパク質（目的タンパク質）である。これは好ましくは酵素であり、さらに好ましくは以下記載の酵素である。
第２の発現コンストラクトは、補助プロテアーゼをコードする。補助プロテアーゼは、タンパク質とは異なる、すなわち、補助タンパク質とタンパク質は、異なるアミノ酸配列を有する。補助プロテアーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特に好ましくは、補助プロテアーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
核酸配列又はアミノ酸配列の同一性の決定は、配列比較によって行われる。そのような比較は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列中の類似したシークエンスが互いに割り当てされることによって行われる。この配列比較は好ましくは先行技術において確立され、かつ通常利用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムを基礎として行われ（例えば、Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410及びAltschul, Stephan F..Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402頁を参照）、そして原則的に、核酸配列又はアミノ酸配列中のヌクレオチド又はアミノ酸の類似したシークエンスが相互に割り当てられることによって行われる。問題となる位置の表で表した割り当ては、アラインメントと称される。更なる、先行技術において提供可能な更なるアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡアルゴリズムである。配列比較（アラインメント）、特にマルチプル配列比較は、通常はコンピュータープログラムによって作成される。しばしば、例えばクラスター系列（例えば、Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500を参照）、Ｔコーヒー（例えば、Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217を参照）又はこのプログラム又はアルゴリズムを基礎とするプログラムが利用される。本発明の範囲において、配列比較及びアラインメントは好ましくは前述のスタンダード（デフォルト）パラメーターを用いてコンピュータープログラムVector NTI（登録商標） Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, カリフォルニア、米国)を用いて作成される。
そのような比較は、比較される配列の相互の類似性に関する言及を可能にする。それは、通常は、パーセント同一性で、すなわち、同一の又はアラインメントにおいて相互に相応する位置にある、同一ヌクレオチド又はアミノ酸残基の割合で記載される。さらに包括的な概念「ホモロジー」は、アミノ酸配列で保存されたアミノ酸交換、すなわち、類似の特性を有するアミノ酸が考慮に加えられる。それというのも、これらはタンパク質内で大抵は類似の活性又は機能を発揮するからである。したがって、比較される配列の類似性は、パーセントホモロジー又はパーセント類似性とも記載されてよい。同一性の記載及び／又はホモロジーの記載は、全ポリペプチド又は遺伝子にわたり又は個々の領域だけにわたり当てはまることができる。したがって、種々の核酸配列又はアミノ酸配列のホモログの領域又は同一の領域は、配列中の一致によって定義されている。これはしばしば同じか又は類似の機能を有する。これは小さく、そして極めてわずかなヌクレオチド又はアミノ酸だけ含むことがある。しばしば、そのような小さい領域は、タンパク質の全活性にとって本質的な機能を発揮する。したがって、配列一致が、個々の、場合によって小さい領域のみに関することが有用であってよい。しかし、他のことが挙げられていない限りは、本出願において、同一性の記載又はホモロジーの記載は、そのつど記載の核酸配列又はアミノ酸配列の全長に関する。さらに、タンパク質、特に酵素、とりわけプロテアーゼでは、この記載は、他のことが記載されていない限り、そのつど成熟した（mature）タンパク質に関する。したがって、他の記載内容がない限りは、属する遺伝子が、翻訳後にさらに成熟した形態へとプロセッシングされる未成熟な形態をコードする場合であっても、配列考察は常に、成熟した、完全にプロセッシングされたタンパク質に対する。
さらに、補助プロテアーゼは、タンパク質加水分解活性を有する。したがって、これは触媒活性があり、すなわち、活性のある酵素である。この点に関して、酵素活性の測定は−そのつどの酵素タイプに対して適合されて−当業者に慣用の手法で行われることができる。活性測定方法は、当業者には酵素技術の分野で慣用であり、そして当業者によりルーチン作業で使用される。プロテアーゼ活性の測定方法は、例えばTenside, 第7巻 (1970), 125-132頁に開示されている。さらに、タンパク質加水分解活性は、基質suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-ニトロアニリド（suc-AAPF-pNA）からの発色団パラニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出によって測定されることができる。このプロテアーゼは基質を分解し、そしてｐＮＡを放出する。ｐＮＡの放出は、４１０ｍｍでの吸光度の増加を引き起こし、その時間経過は酵素活性のための尺度である（Del Mar et al., 1979参照）。測定を温度２５℃、ｐＨ８．６、波長４１０ｎｍで行う。測定時間は５分間である。測定間隔は２０ｓ〜６０ｓである。プロテアーゼ活性は好ましくはＰＥ（プロテアーゼ単位）で記載される。
本発明の核酸及び発現コンストラクトは、核酸の変更のためのそれ自体知られている方法を介して生じさせられることができる。そういったものは、例えばFritsch, Sambrook und Maniatis,"Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989といった関連するハンドブックに説明され、当業者にはバイオテクノロジーの分野で慣用である。そのような方法の例は、化学合成又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは任意に更なる分子生物学及び／又は化学又は生化学の標準方法と関連している。
本発明は、特にタンパク質、特に酵素の組み換え製造に適する。そのために、第１の発現コンストラクト及び第２の発現コンストラクトは、好ましくは形質転換によって、１の微生物中へと導入される。この点に関して、そのつどの発現コンストラクト又はその部分の取り込みが、好ましくはベクター、特に発現ベクターを介して行われる。しかし、発現コンストラクトの一部のみ、好ましくはタンパク質又は補助プロテアーゼをコードする少なくとも１の核酸を、完成した発現コンストラクトが初めて微生物中で発生するように、微生物中に導入することも可能である。このことは、例えば、タンパク質のための遺伝子及び／又は補助プロテアーゼのための遺伝子を宿主細胞中で既に存在する遺伝要素、例えば染色体、染色体ＤＮＡ又は他のベクターへと挿入できることを生じさせるベクターによって行われることができ、そのために例えばタンパク質のための遺伝子の発現又は補助プロテアーゼのための遺伝子の発現のための内在プロモーターが利用される。特に、補助プロテアーゼをコードする遺伝子が、そのようにして微生物の内在プロモーターと機能的に連結することができ、こうして第２の発現コンストラクトを構成する。したがって、導入との概念は、発現コンストラクトが完全に微生物中へと導入され、好ましくは形質転換される可能性を含むが、しかし、発現コンストラクトの一部のみ、特に好ましくは補助プロテアーゼをコードする核酸が微生物中へと導入され、好ましくは形質転換され、そして完全な発現コンストラクトが微生物中で初めて発生する可能性も含む。しかし、発現コンストラクトの少なくとも一部は、本発明の範囲内で、微生物中へと常に導入される。
ベクターは当業者にバイオテクノロジーの分野で知られている。ベクターは特に細菌中の使用の際の特殊なプラスミド、すなわち、環状遺伝要素である。本発明の範囲では、発現コンストラクトは好ましくはベクター中にクローニングされている。ベクターには、例えば、細菌性プラスミド、ウィルス又はバクテリオファージから誘導されるもの、又は主として合成ベクター又はプラスミドであって異なる起源の要素を含むようなものが属することがある。更なるそのつど存在する遺伝要素によって、ベクターは微生物において複数の世代にわたり安定なユニットとして確立することが可能になる。この場合に、本発明の意味合いにおいて、ベクターが染色体外に固有のユニットとして確立されるか又は染色体もしくは染色体ＤＮＡに組み込まれるかは重要でない。数多くのシステムのもののうちどれが選択されるかは個々のケースに応じる。決定的であるのは、例えば、達成可能なコピー数、提供される選択システム、特に抗生物質耐性、又はベクター収容能力のある微生物の培養能であってよい。
さらに、発現ベクターは、培養条件の変更、例えば細胞密度又は所定化合物の添加によって制御可能であってよい。そのような化合物の一例は、ガラクトース誘導体イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）であり、これは細菌性ラクトース−オペロン（ｌａｃオペロン）のアクチベーターとして使用される。
本発明の更なる一実施態様において、本発明の方法は、タンパク質が微生物中に天然に存在しない及び／又は補助プロテアーゼは微生物中に天然に存在しないことによって特徴付けられる。
この関連において、天然に存在しない、とは、タンパク質又は補助プロテアーゼが、微生物の固有のタンパク質又は酵素でないことを意味する。したがって、タンパク質又は補助プロテアーゼは、微生物において、その野生型において微生物の染色体ＤＮＡの一部である核酸配列によって発現されることができない。したがって、タンパク質又は補助プロテアーゼ及び／又はそのためにそのつどコードする核酸配列は、微生物の野生型において存在しない及び／又は微生物の野生型から単離されることができない。好ましくは、微生物中に天然に存在しないタンパク質又は微生物中に天然に存在しない補助プロテアーゼ又はそのつどのそれらをコードする核酸は遺伝子工学的手法を用いて微生物中に狙いを定めて導入されており、その結果、微生物はタンパク質又は補助プロテアーゼ又はそのつどのそれらをコードする核酸配列が富化されている。しかし、タンパク質又は補助プロテアーゼは他の微生物中に天然に存在してよい−この考えに関連するのは、本方法中で使用される微生物のみである。
タンパク質も補助プロテアーゼも、微生物中に天然に存在していなくてよい。しかし、他の実施態様において、タンパク質は微生物中に天然に存在し、そして、補助プロテアーゼは微生物中に天然に存在しないでよい。更なる他の実施態様において、タンパク質は微生物中に天然に存在しないでよく、そして、補助プロテアーゼは微生物中に天然に存在してよい。
本発明の更なる一実施態様において、本発明の方法は、補助プロテアーゼが少なくとも１の染色体コードしたプロテアーゼを微生物中で置き換えることを特徴としている。この場合に、少なくとも１の存在する染色体プロテアーゼは、本発明の補助プロテアーゼとして機能する異種プロテアーゼによって交換される。好ましくは、補助プロテアーゼをコードする核酸配列は、微生物のプロテアーゼをコードする染色体核酸配列中へと挿入される。それによって、染色体コードされたプロテアーゼは機能的に不活性化される。染色体コードされたプロテアーゼの代わりに、微生物は補助プロテアーゼを発現する。補助プロテアーゼの発現には、当初の、染色体コードされたプロテアーゼのために利用されたプロモーターが使用でき、その結果、第２の発現コンストラクトは、この場合に、補助プロテアーゼをコードする核酸配列の他に、染色体コードされたプロテアーゼのプロモーター配列、すなわち、微生物の天然のプロモーター配列を含む。代わりに、補助プロテアーゼに固有に備わったプロモーターが使用されることができ、その結果、この場合に、第２の発現コンストラクトは、この場合に、補助プロテアーゼをコードする核酸配列の他に、染色体コードされたプロテアーゼのプロモーター配列を含まない。好ましくは、この場合に、第２の発現コンストラクトは、天然でない微生物プロモーター配列を含む。補助プロテアーゼに固有に備わったプロモーターが使用される限りは、これは好ましくは、補助プロテアーゼをコードする核酸配列と一緒に、微生物のプロテアーゼをコードする染色体核酸配列へと挿入されている。他の代替的な実施態様において、補助プロテアーゼの発現のために、染色体コードされたプロテアーゼのために利用されたプロモーターも、補助プロテアーゼに固有に備わったプロモーターも使用できる。
本発明の更なる実施態様において、本発明の方法は、染色体によってコードされたプロテアーゼに加えて、補助プロテアーゼが、微生物中で発現されることを特徴としている。この場合に、微生物では、本発明の補助プロテアーゼとして機能する異種プロテアーゼによって、追加のタンパク質加水分解活性が提供される。したがって、第２の発現コンストラクトは、好ましくは少なくとも、補助プロテアーゼをコードする核酸配列並びに補助プロテアーゼの発現のために備わったプロモーターを含む。好ましくは、この場合に、第２の発現コンストラクトは、天然でない微生物プロモーター配列を含む。
特に好ましい一実施態様において、本発明の方法は、補助プロテアーゼが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１の染色体コードされたプロテアーゼを微生物中で置き換えることによって特徴付けられている。特に好ましくは、染色体によってコードされたプロテアーゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、特に好ましくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特に好ましくは、そのようなプロテアーゼは、細菌、特にバチラス属、特に好ましくはバチラス・リシエニフォルミスである微生物において置き換えられる。
本発明の更なる実施態様において、本発明の方法は、タンパク質の発現が補助プロテアーゼの発現によって強化されることを特徴とする。既に上述のように、好ましい本発明の実施態様において、補助プロテアーゼの発現は、タンパク質の生成物収率を増加させることを引き起こす。このことは、増加した発現、すなわち、微生物による増加したタンパク質合成によって達成される。補助プロテアーゼは、基質タンパク質の加水分解に関与し、そして、場合によっては更なる染色体コードした微生物プロテアーゼと一緒に、微生物にその培養の間に提供される基質タンパク質の改善された分解を引き起こす。それによって、タンパク質の合成により多くの必要な前駆体分子、特にアミノ酸が提供される。
この事情は、タンパク質をコードする核酸配列の転写頻度及び所望のタンパク質へのその翻訳、すなわち、単位時間あたりに生成したタンパク質の数を介して算出される。翻訳工程は、発現の決定において加えられる。比較として、本発明の方法とは補助プロテアーゼの不在の点で異なる方法が利用される。そのような比較は、本発明によれば、測定の比較能を保証するため、同種の微生物において、かつ、同じ条件下で行われる。
本発明の更なる一実施態様において、本方法は、タンパク質が酵素、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、タンナーゼ、キシラナーゼ、キサンタナーゼ、キシログルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、カラギーナーゼ、ペルヒドロラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ又はリパーゼであることを特徴とする。特にとりわけ好ましくは、タンパク質はプロテアーゼである。生産すべきプロテアーゼ（＝目的プロテアーゼ）は、そうすると、同時に、タンパク質基質の加水分解にも関与し、そして、好ましくは再度改善された基質タンパク質分解を引き起こすことができる。
例えば、本発明の方法を用いて以下に挙げる酵素が好ましく製造されることができる。
プロテアーゼとは好ましくはスブチリシン（Subtilisine）である。そのための例は、スブチリシンBPN'及びカールスバーグ（Carlsberg）、プロテアーゼPB92、スブチリシン147及び309、バチラス・レンタス（Bacillus lentus）からのアルカリ性プロテアーゼ、スブチリシンDY及びスブチラーゼ（Subtilase）であり、しかしもはやより狭い意味合いでスブチリシンに帰属させるべき酵素ターミターゼ（Thermitase）、プロテイナーゼ（Proteinase）Ｋ及びプロテアーゼTW3及びTW7でない。スブチリシンカールスバーグは、商品名Alcalase（登録商標）で、Novozymes A/S, Bagsvasrd, デンマークから入手される更に開発された形態にある。スブチリシン147及び309は、商品名Esperase（登録商標）又はSavinase（登録商標）で、Novozymes社から販売される。バチラス・レンタスDSM 5483からのプロテアーゼから、名称BLAP（登録商標）で呼ばれるプロテアーゼ変異体が誘導される。さらに、更なる好ましいプロテアーゼは、例えば名称PURで呼ばれる酵素である。さらに、更なるプロテアーゼは、商品名Durazym（登録商標）、Relase（登録商標）、Everlase（登録商標）、Nafizym（登録商標）、Natalase（登録商標）、Kannase（登録商標）及びOvozyme（登録商標）（Novozymes社）、商品名Purafect（登録商標）、Purafect（登録商標） OxP、Purafect（登録商標）Prime、Excellase（登録商標）及びProperase（登録商標）（Genencor社）、商品名Protosol（登録商標）（Advanced Biochemicals Ltd.,社 Thane,インド）、商品名Wuxi（登録商標）（Wuxi Snyder Bioproducts Ltd.,社、中国）、商品名Proleather（登録商標）及びProtease P（登録商標）（Amano Pharmaceuticals Ltd.,社、日本、名古屋）及び商品名Proteinase K-16（Kao Corp.,社、東京、日本）から入手される酵素である。さらに、好ましくは、バチラス・ギブソニ（Bacillus gibsonii）及びバチラス・プミラス（Bacillus pumilus）からのプロテアーゼでもあり、これらは国際特許出願WO2008/086916及びWO2007/131656に開示されている。
アミラーゼの例は、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）から、バチラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）から、又はバチラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）からのα−アミラーゼであり、並びに特に、洗浄剤又は清浄化剤における使用のためのその改善された開発形態でもある。バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）からの酵素は、名称Termamyl（登録商標）でNovozymes社から、そして、名称Purastar（登録商標）STでDanisco/Genencor社から入手される。このα−アミラーゼの開発形態は、名称Duramyl（登録商標）及びTermamyl（登録商標）ultraでNovozymes社から、名称Purastar（登録商標）OxAmでDanisco/Genencorから、そして、Keistase（登録商標）としてDaiwa Seiko Inc.,（東京、日本）社から入手される。バチラス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）からのα−アミラーゼは、Novozymes社から名称BAN（登録商標）で販売され、そして、バチラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）からのα−アミラーゼの誘導された変異体は名称BSG（登録商標）及びNovamyl（登録商標）で、同様にNovozymes社から販売される。さらに、バチラス種Ａ７−７（DSM 12368）からのα−アミラーゼ及びバチラス・アガラドヘレンス（Bacillus agaradherens）（DSM 9948）からのシクロデキストリン−グルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）を挙げることができる。同様に、全ての前述の分子の融合生成物が使用可能である。さらに、Novozymes社からの名称Fungamyl（登録商標）で得られる、アスペルギラス・ニガ−（Aspergillus niger）及びＡ．オリザエ（A. oryzae）からのα−アミラーゼの更なる開発形態が適している。更なる好ましい市販生成物は、例えば、Danisco/Genencor社からのAmylase Powerase（登録商標）及びAmylasen Amylase-LT（登録商標）、Stainzyme（登録商標）及びStainzyme plus（登録商標）（Novozymes社）である。点突然変異によっても得られるこの酵素の変異体もまた本発明により製造されることができる。更なる好ましいアミラーゼは、国際公開公報WO 00/60060、WO 03/002711、WO 03/054177及びWO07/079938に開示され、したがってその開示は明示をもって参照され、又はしたがって、その開示内容は明示をもって本特許出願に組み込まれる。本発明により製造すべきアミラーゼは、さらに好ましくはα−アミラーゼである。
リパーゼ（Lipase）又はクチナーゼ（Cutinase）のための例は、本来はフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）（Thermomyces lanuginosus）から得られるか、あるいは更に開発したリパーゼ、特にアミノ交換D96Lを備えるものである。それらは、例えば、商品名Lipolase（登録商標）, Lipolase（登録商標）Ultra, LipoPrime（登録商標）, Lipozyme（登録商標）及びLipex（登録商標）でNovozymes社から販売される。さらに、例えば、当初フザリウム・ソラニ ピシ（Fusarium solani pisi）及びフミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から単離されているクチナーゼ（Cutinase）が製造可能である。Danisco/Genencor社からは、例えば、リパーゼ又はクチナーゼが製造可能であり、その出発酵素は当初にシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）及びフザリウム・ソラニ（Fusarium solanii）から単離されたものである。更なる重要な市販製品として、当初Gist-Brocades社（現在はDanisco/Genencor）から販売される調製物M1 Lipase（登録商標）及びLipomax（登録商標）及びMeito Sangyo KK社（日本）から名称Lipase MY-30（登録商標）, Lipase OF（登録商標）及びLipase PL（登録商標）で販売される酵素を挙げることができ、さらに、Danisco/Genencor社の製品Lumafast（登録商標）である。
セルラーゼ（エンドグルカナーゼ、ＥＧ）の例は、真菌のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）リッチなセルラーゼ調製物又はその開発形態の系列を含み、これは商品名Celluzyme（登録商標）でNovozymes社から販売される。同様に、Novozymes社から入手される製品Endolase（登録商標）及びCarezyme（登録商標）は、フミコラ・インソレンスDSM 1800からの50 kD-EG又は43 kD-EGを基礎とする。これらの会社の更なる製造可能な市販製品は、Cellusoft（登録商標）, Renozyme（登録商標）及びCelluclean（登録商標）である。更に製造可能であるのは、例えばAB Enzymes社（フィンランド）から商品名Ecostone（登録商標）及びBiotouch（登録商標）で入手可能なセルラーゼであり、そして、この少なくとも一部はメラノカルパス（Melanocarpus）からの20 kD-EGを基礎とする。AB Enzymes社の更なるセルラーゼは、Econase（登録商標）及びEcopulp（登録商標）である。更なる適したセルラーゼは、バチラス種CBS 670.93及びCBS 669.93からのものであり、ここでバチラス種CBS 670.93はDanisco/Genencor社から商品名Puradax（登録商標）で入手可能である。Danisco/Genencor社の更なる製造可能な市販製品は、"Genencor detergent cellulase L"及びlndiAge（登録商標）Neutraである。
点突然変異によって得られるこの酵素の変異体もまた、本発明により製造可能である。特に好ましいセルラーゼは、国際公開公報WO 98/12307に開示されているチエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）セルラーゼ誘導体、メラノカルパス、特にメラノカルパス・アルボミセス（Melanocarpus albomyces）からのセルラーゼ（国際公開公報WO 97/14804に開示されている）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）からのEGIIIタイプのセルラーゼ（ヨーロッパ特許出願EP 1 305 432に開示されている）又はそれから得られる誘導体、特にヨーロッパ特許出願EP 1240525及びEP 1305432に開示されているもの、並びに、国際公開公報WO 1992006165, WO 96/29397及びWO 02/099091に開示されているものである。したがって、それぞれの開示は明示的に参照されるか、又はしたがってこれに関する開示内容は明示的に本特許出願に取り込まれる。
さらに、ヘミセルラーゼとの概念にまとめられる更なる酵素が製造されることができる。それには、例えば、マンナナーゼ、キサンタンリアーゼ、キサンタナーゼ、ペクチンリアーゼ（＝ペクチナーゼ）、ペクチンエステラーゼ、ペクタートリアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、プルランナーゼ及びβ−グルカナーゼである。これに関して適した酵素は、例えば名称Gamanase（登録商標）, Pektinex AR（登録商標）及びPectaway（登録商標）でNovozymes社から、名称Rohapec（登録商標） B1 LでAB Enzymes社から、そして名称Pyrolase（登録商標）でDiversa Corp., San Diego, CA, USA社から入手できる。バチラス・サチラスから獲得したβ−グルカナーゼは名称Cereflo（登録商標）でNovozymes社から入手可能である。本発明によれば特に好ましいヘミセルラーゼはマンナナーゼであり、これは例えばNovozymes 社から商品名Mannaway（登録商標）で又はGenencor社から商品名Purabrite（登録商標）で販売される。
さらに、オキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばハロ−、クロロ−、ブロモ−、リグニン−、グルコース−又はマンガンペルオキシダーゼ、ジオキシゲナーゼ又はラッカーゼ（フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ）が製造されてもよい。好適な市販製品として、Novozymes社のDenilite（登録商標） 1及び2を挙げることができる。更なる酵素は、国際特許出願WO 98/45398, WO 2005/056782, WO 2004/058961並びにWO 2005/124012に開示されている。
本発明の更なる実施態様において、本方法は、微生物が細菌であることを特徴とする。
細菌は、本発明の方法において好ましい微生物である。細菌は、短い世代時間及び培養条件の少ない要求によって特徴付けられる。それによって、コスト安な培養方法又は製造方法が確立できる。加えて、当業者は、細菌で発酵技術において豊富な経験則を提供する。グラム陰性細菌もグラム陽性細菌も適してよい。
グラム陰性細菌、例えば大腸菌（Escherichia coli）は、多数のタンパク質を周辺質室中へと分泌し、すなわち、両方の細胞を包含する膜の間のコンパートメント中へと分泌する。このことは特殊な適用にとって好ましくてよい。さらに、グラム陰性細菌は、発現したタンパク質が周辺質室のみでなく、細菌を取り囲む媒体へと排出されるように構成されていてもよい。それに対して、グラム陽性細菌、例えばバチルス又は微生物、例えば放線菌類（Actinomycete）又は他の放線菌目は、外側膜を有さず、そのため、分泌されたタンパク質は同時に細菌を包囲する媒体、通常は栄養媒体中へと放出され、ここから発現したタンパク質は精製される。これは、媒体から直接的に単離されるか又は更にプロセッシングされることができる。
本発明により好ましい細菌は、エシェリキア （Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、バチラス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebakterium）属、アルトロバクター（Arthrobacter）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属及びビブリオ（Vibrio）属の群から選択されている。さらに好ましくは、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、バークホルデリア・グルメ（Burkholderia glumae）、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラス・レンタス（Bacillus lentus）、バチラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチラス・サチラス（Bacillus subtilis）、バチラス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチラス・グロビニ（Bacillus globigii）、バチラス・ギブソニ（Bacillus gibsonii）、バチラス・パミラス（Bacillus pumilus）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、アルトロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxidans）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）及びビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）の群から選択されているものである。特にとりわけ好ましくは、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）である。
しかし、微生物は、細胞核を有することを特徴とする真核細胞であってもよい。原核細胞とは対照的に、真核細胞は、形成されたタンパク質を後翻訳によって修飾することができる。そのような例は、真菌、例えば放線菌類（Actinomycete）又は酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyce）又はクルイベロマイセス（Kluyveromyce）である。これは、例えば、タンパク質がその合成に関連して、そのような系が可能にする特殊な修飾を経ることが望ましい場合に特に好ましくてよい。タンパク質合成と関連して原核系が特に実施する修飾には、例えば低分子量化合物、例えば膜アンカー又はオリゴサッカリドの結合が属する。そのようなオリゴサッカリド修飾は、例えば、発現したタンパク質のアレルゲン性の低下のために所望されてよい。天然にその種の細胞によって形成された酵素、例えばセルラーゼ又はリパーゼとの共発現もまた、好ましくあってよい。さらに、例えば高温真菌発現系が、温度抵抗性のタンパク質又は変異体の発現に特に適することができる。
本発明により使用すべき微生物は、その培養条件の要求に関して変動されてよいし、他の又は追加の選択マーカーを有してよく、又はさらに他の又は追加のタンパク質を発現してよい。これは特に、複数の目的タンパク質をトランスジェニックに発現する微生物であってもよい。好ましくは、本発明の微生物は微生物を取り囲む媒体中へと、タンパク質（目的タンパク質）を分泌する。
本発明の方法において使用される微生物は、通常どおりに培養され、そして発酵され、これは例えば不連続的又は連続的な系においてである。第１の場合には、適した栄養媒体が微生物で接種され、そしてタンパク質は実験によって算出される期間の後に媒体から回収される。連続的な発酵は、比較的長期の期間にわたり細胞は部分的に死ぬが、しかし成長もし、そして同時に、形成されたタンパク質が媒体から取り出されることができる流れ平衡（Fliessgleichgewicht）の達成によって特徴付けられる。
本発明の方法は好ましくは発酵法である。発酵法は、それ自体先行技術から知られており、かつ、本来の大工業的な製造工程であり、通常は製造されたタンパク質の好適な精製法がその後に続く。本発明のタンパク質の製造方法が基づいている全ての発酵方法は、この発明の主題の実施形態である。
発酵が供給ストラテジーによって実施されることを特徴とする発酵方法は、特に考慮される。この場合に、進行性の培養によって消費される媒体成分が供給される。それによって、少なからぬ増加が細胞密度においても細胞材料又は乾燥材料においても達成できる。さらに、発酵は、不所望な代謝生成物がフィルター除去されるか、又は緩衝液又はそのつど適当な対イオンの添加によって中和されるように構成されることもできる。
製造されたタンパク質は発酵媒体から回収できる。そのような発酵方法は、微生物からのタンパク質の単離、すなわち、細胞材料（乾燥材料）からの生成物後処理に対して、好ましい。このことは、例えば、適した微生物又は１又は複数の適した分泌マーカー又は−機構及び／又は輸送系の提供によって達成されることができ、それによって微生物はタンパク質を発酵媒体へと分泌する。分泌がない場合には、代わりに、宿主細胞からのタンパク質の単離、すなわち、細胞材料からのその精製は、例えば硫酸アンモニウム又はエタノールを用いた沈殿、又はクロマトグラフィによる精製によって行われることができる。
本発明の更なる主題は、次の方法工程を含む方法によって入手される微生物である：
（ａ）タンパク質をコードする第１の発現コンストラクトを微生物中に導入する工程、
（ｂ）前記タンパク質とは異なり、かつ、配列番号１（＝ Ｂｌａｐ Ｓ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む補助プロテアーゼをコードする第２の発現コンストラクトを前記微生物中に導入する工程、ここで補助プロテアーゼはタンパク質加水分解活性を有する。
この場合に、したがって、これは本発明の方法の主題であってよい全ての微生物である。本発明の方法について記載している全ての事情、主題及び実施態様は、この発明の主題に対しても適用可能である。したがって、この箇所で、この開示は本発明の微生物にも該当するとの示唆を伴って、相応する箇所の開示が明示的に参照される。
本発明の微生物の特に好ましい実施態様は、
（ａ）タンパク質は微生物中に天然に存在しない、及び／又は
（ｂ）補助プロテアーゼは微生物中に天然に存在しない、及び／又は
（ｃ）補助プロテアーゼは少なくとも１の染色体コードされたプロテアーゼを微生物において置き換えるか、又は補助プロテアーゼは微生物において染色体コードされたプロテアーゼに追加して発現される、及び／又は
（ｄ）補助プロテアーゼの発現はタンパク質の発現を強化する、及び／又は
（ｅ）微生物は、細菌、好ましくはエシェリキア （Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、バチラス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebakterium）属、アルトロバクター（Arthrobacter）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属及びビブリオ（Vibrio）属の群から選択されている細菌、特に好ましくは大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、バークホルデリア・グルメ（Burkholderia glumae）、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラス・レンタス（Bacillus lentus）、バチラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチラス・サチラス（Bacillus subtilis）、バチラス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチラス・グロビニ（Bacillus globigii）、バチラス・ギブソニ（Bacillus gibsonii）、バチラス・パミラス（Bacillus pumilus）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、アルトロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxidans）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）及びビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）の群から選択されている細菌である、
ことを特徴とする。特に好ましくはバチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）である。
本発明の微生物は、好ましくは、タンパク質を製造するための、本発明の方法において使用される。したがって当然の帰結として、本発明の更なる主題は、タンパク質、特に酵素を製造するための本発明の微生物の使用である。
本発明の方法又は微生物について記載している全ての事情、主題及び実施態様は、この発明の主題に対しても適用可能である。したがって、この箇所で、この開示は本発明の使用にも該当するとの示唆を伴って、相応する箇所の開示が明示的に参照される。
実施例
全ての分子生物学的作業工程は、標準方法、例えばHandbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989に、又は匹敵する関連研究に記載されているものに従う。酵素、モジュール（キット）及び装置を、そのつどの製造者の指示に従い使用した。
実施例１：
配列番号２に記載のプロテアーゼをコードする遺伝子（aprE）の、配列番号１に記載の補助プロテアーゼをコードする遺伝子による、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）における置換
以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した（５′→３′配置として記載）：
この交換を、まずaprE遺伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子tetに対して交換した中間工程を用いて行った。tet遺伝子に対するaprE遺伝子の置換のために、プライマーaprE1及びaprE2並びにプライマーaprE3及びaprE4を用いて、aprE遺伝子の１０３３ｂｐ又は１０１５ｂｐ上流及び下流の配列断片を増幅した（隣接領域（Flank）Ａ及びＢ）。プライマーaprE2及びaprE3の相応するオーバーハングのために、融合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、外側プライマーaprE1及びaprE4を用いて両方の隣接領域が融合された。２０１８ｂｐの融合ＰＣＲ産物を、ベクターpE194の切断箇所PstI及びXbaIでクローニングした（Horinouchi & Weisblum, J.Bacteriol. (150), 804頁〜(1982)）。tet遺伝子を、プラスミドpBC16（Bernhard et al., J.Bacteriol. (133), 897頁〜(1978)）からのプライマーtet5及びtet6を用いて増幅し、そして、融合したaprE隣接領域の中心の切断箇所BamHI及びHindIIIにクローニングした（図１参照）。得られたプラスミドpRK25を、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）中に形質転換した。選択を、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンと、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを用いて３０℃で行った。４２℃での培養後に、組み込んだベクターを有するクローンを、成長によって０．３μｇ／ｍｌのエリスロマイシンで同定した。しかし、４２℃で新たな培養後に、エリスロマイシンの使用なしに、テトラサイクリン耐性に関して及びＰＣＲを用いてtet遺伝子に対するaprE遺伝子の成功した交換に関してスクリーニングしたクローンが得られた（バチラス・リシエニフォルミスΔaprE::tet、図２参照）。
配列番号１に記載の補助プロテアーゼをコードする遺伝子に対するtet遺伝子の置換のために、プライマーaprE1及びaprE7並びにプライマーaprE8及びaprE4を用いて、aprE遺伝子の１０６１ｂｐ又は１０５８ｂｐ上流及び下流の配列断片を増幅した（隣接領域Ｃ及びＤ）。配列番号１に記載の補助プロテアーゼをコードする遺伝子を、プラスミドpCB76R49CKからのプライマーziel9及びziel10を用いて増幅した。プライマーaprE7及びziel9又はaprE8及びziel0の相応するオーバーハングのために、融合ＰＣＲによって、外側プライマーaprE1及びaprE4を用いて両方の隣接領域と補助プロテアーゼＰＣＲ産物が融合された。３７０４ｂｐの融合ＰＣＲ産物を、ベクターpRK25の切断箇所PstI及びNdeIでクローニングした（図１参照）。得られたプラスミドpRK19を、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）ΔaprE::tet（上記参照）中に形質転換した。選択を、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを用いて３０℃で行った。４２℃での培養後に、組み込んだベクターを有するクローンを、成長によって０．３μｇ／ｍｌのエリスロマイシンで同定した。しかし、４２℃で新たな培養後に、抗生物質の使用なしに、ＰＣＲを用いて配列番号１に記載の補助プロテアーゼをコードする遺伝子に対するtet遺伝子の成功した交換に関してクローンが得られ、スクリーニングされた（バチラス・リシエニフォルミスΔaprE::補助プロテアーゼ、図２参照）。
実施例２：
製造株バチラス・リシエニフォルミスΔaprE::補助プロテアーゼを用いたプロテアーゼ（目的タンパク質）の発酵による製造
バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）出発株並びに置換突然変異体ΔaprE::補助プロテアーゼを、プロテアーゼ（目的タンパク質）のための製造プラスミドで形質転換した。生じる製造株を、標準発酵方法において使用し、そして、得られたプロテアーゼ活性を決定した。出発株と比較すると、２リットルの実験室発酵器中で収率は６５％増加していた（図３参照）。測定したプロテアーゼ活性は、実質的に目的プロテアーゼの活性に基づく。それというのも、目的プロテアーゼの発現が顕著に高められたためである。このことは、ネイティブポリアクリルアミド−ゲル電気泳動を用いたバチラス・リシエニフォルミスΔaprE::補助プロテアーゼ／目的プロテアーゼの培養物の発酵上清の分泌分析によって、証明された（参照図４；ｔは培養時間を指し、AP103は補助プロテアーゼ（２本のバンド）、AP217は目的プロテアーゼである）。目的プロテアーゼと比較して、極めて少量の補助プロテアーゼだけが、培養上清中に存在する。

Claims (10)

  1. 以下の方法工程
    （ａ）タンパク質をコードする第１の発現コンストラクトを微生物中に導入する工程、
    （ｂ）前記タンパク質とは異なり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む補助プロテアーゼをコードする第２の発現コンストラクトを前記微生物中に導入する工程、ここで前記補助プロテアーゼはタンパク質加水分解活性を有する、
    （ｃ）前記タンパク質及び前記補助プロテアーゼを前記微生物中で発現させる工程
    を含む、微生物によるタンパク質の製造方法。
  2. 前記タンパク質は前記微生物中に天然に存在しない、及び／又は、前記補助プロテアーゼは前記微生物中に天然に存在しないことを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 前記補助プロテアーゼは少なくとも１の染色体コードされたプロテアーゼを前記微生物において置き換えるか、又は、前記補助プロテアーゼは前記微生物において染色体コードされたプロテアーゼに追加して発現されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記補助プロテアーゼは、配列番号２に記載のアミノ酸と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１の染色体コードされたプロテアーゼを前記微生物において置き換えることを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. 前記タンパク質の発現は前記補助プロテアーゼの発現によって強化されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
  6. 前記タンパク質は、酵素、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、タンナーゼ、キシラナーゼ、キサンタナーゼ、キシログルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、カラギーナーゼ、ペルヒドロラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ又はリパーゼであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
  7. 微生物が細菌、好ましくはエシェリキア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、バチラス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebakterium）属、アルトロバクター（Arthrobacter）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属及びビブリオ（Vibrio）属の群から選択されている細菌、特に好ましくは大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、バークホルデリア・グルメ（Burkholderia glumae）、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラス・レンタス（Bacillus lentus）、バチラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチラス・サチラス（Bacillus subtilis）、バチラス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチラス・グロビニ（Bacillus globigii）、バチラス・ギブソニ（Bacillus gibsonii）、バチラス・パミラス（Bacillus pumilus）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、アルトロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxidans）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）及びビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）の群から選択されている細菌であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
  8. 以下の方法工程
    （ａ）タンパク質をコードする第１の発現コンストラクトを微生物中に導入する工程、
    （ｂ）前記タンパク質とは異なり、かつ、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む補助プロテアーゼをコードする第２の発現コンストラクトを前記微生物中に導入する工程、ここで前記補助プロテアーゼはタンパク質加水分解活性を有する、
    を含む方法によって得られる微生物。
  9. （ａ）前記タンパク質は前記微生物中に天然に存在しない、及び／又は
    （ｂ）前記補助プロテアーゼは前記微生物中に天然に存在しない、及び／又は
    （ｃ）前記補助プロテアーゼは少なくとも１の染色体コードされたプロテアーゼを前記微生物において置き換えるか、又は前記補助プロテアーゼは前記微生物において染色体コードされたプロテアーゼに追加して発現される、及び／又は
    （ｄ）前記補助プロテアーゼの発現は前記タンパク質の発現を強化する、及び／又は
    （ｅ）前記微生物は、細菌、好ましくはエシェリキア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、バチラス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebakterium）属、アルトロバクター（Arthrobacter）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属及びビブリオ（Vibrio）属の群から選択されている細菌、特に好ましくは大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、バークホルデリア・グルメ（Burkholderia glumae）、バチラス・リシエニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラス・レンタス（Bacillus lentus）、バチラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチラス・サチラス（Bacillus subtilis）、バチラス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチラス・グロビニ（Bacillus globigii）、バチラス・ギブソニ（Bacillus gibsonii）、バチラス・パミラス（Bacillus pumilus）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、アルトロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxidans）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）及びビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）の群から選択されている細菌である
    ことを特徴とする請求項８記載の微生物。
  10. タンパク質、特に酵素を製造するための、請求項８又は９記載の微生物の使用。
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