Aufgabe
war es daher ein Expressionssystem zu entwickeln, das es erlaubt,
effizient sowohl cobalt- als auch eisenabhängige Nitrilhydratasen aktiv
in E. coli zu exprimieren. Insbesondere sollte das erfindungsgemäße System
in der Lage sein, die ins Auge gefassten Enzyme in gegenüber dem
Stand der Technik erhöhter
Expressionsrate und ggf. stabileren Formen zur Verfügung zu
stellen, um so deren Einsatz im technischen Maßstab unter ökologischen
und ökonomischen
Gesichtspunkten vorteilhaft zu gestalten.
Diese
und weitere nicht näher
spezifizierte sich jedoch aus dem Stand der Technik in naheliegenderweise
ergebende Aufgaben werden durch die Angabe eines Expressionssystems
mit den Merkmalen des gegenständlichen
Anspruchs 1 gelöst.
Ansprüche
2 bis 8 beziehen sich auf bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Expressionssystems.
Ansprüche
9 und 10 sind auf Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratasen
bzw. (Amino-)Carbonsäuren
oder (Amino-)Carbonsäureamide
gerichtet. Anspruch 11 schützt
einen mit dem Expressionssystem ausgestatteten Wirtsorganismus.
Dadurch,
dass bei einem Expressionssystem für die gleichzeitige Expression
der Nukleinsäuresequenzen
kodierend für
die verschiedenen Untereinheiten einer Nitrilhydratase das Expressionssystem
mindestens je ein Plasmid mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz
kodierend für
die jeweilige Untereinheit aufweist, gelangt man äußerst vorteilhaft
und nichts desto weniger völlig überraschend
zur Lösung
der gestellten Aufgabe. Mit dem vorgeschlagenen Expressionssystem
ist es möglich,
die heterologe Expression der ins Auge gefassten Nukleinsäuresequenzen
in für
technische Maßstäbe ausreichender
Art und Weise zu bewerkstelligen. Es kann dabei besonders überraschen,
dass allein die getrennte Expression der eigentlich in einem Operon
organisierten Nukleinsäuresequenzen
kodierend für
die entsprechenden Untereinheiten der Nitrilhydratasen auf verschiedenen
Plasmiden dazu beiträgt,
die Aktivität
der erhaltenen Nitrilhydratasen um den Faktor > 8 gegenüber der „normalen" Expression zu steigern. Dies war so
aus dem Stand der Technik in naheliegender Weise nicht herleitbar.
Das
erfindungsgemäße Expressionssystem
kann in allen dem Fachmann für
den vorliegenden Zweck in Frage kommenden Wirtsorganismen eingesetzt
werden. Als Mikroorganismen sind diesbezüglich Organismen wie z.B. Hefen
wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae,
Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie
Säugerzellen,
Insektenzellen oder Pflanzenzellen zu nennen. Wirtsorganismen, in
die die Nukleinsäuresequenzen
aufweisende Plasmide kloniert werden können, dienen zur Vermehrung
und Gewinnung einer ausreichenden Menge des rekombinanten Enzyms.
Die Verfahren hierfür
sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und
Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York). Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen.
Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109,
JM105, RR1, DH5α,
TOP 10- , HB101, BL21 codon plus, BL21 (DE3) codon plus, BL21, BL21
(DE3), MM294. Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende
Genkonstrukt vorzugsweise in den Wirtsorganismus kloniert wird,
sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (s.a. PCT/EP03/07148; s.u.). Ganz
besonders bevorzugt ist ein Expressionssystem, das in E. coli BL21
als Wirt vorliegt.
Promotoren
sind DNA-Sequenzbereiche, von denen aus die Transkription eines
Gens oder Operons gesteuert wird. Die für die Ausführung der Erfindung besonders
vorteilhaften Promotoren, welche insbesondere in E. coli einzusetzen
sind, sind dem Fachmann bekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und
Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York ). Es hat sich jetzt als vorteilhaft erwiesen, wenn die
Expression der Nukleinsäuresequenzen
kodierend für
die Untereinheiten unter der Kontrolle von jeweils dem gleichen
Promotor steht, damit die Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten
in möglichst
gleicher Geschwindigkeit exprimiert werden können. Geeignete Promotoren können solche
ausgewählt
aus der Gruppe T7, lac, tac, trp, ara oder rhamnose induzierbare
sein. Weitere sind in (Cantrell, SA (2003) Vectors fort he expression
of recombinant proteins in E. coli. Methods in Molecular biology
235: 257-275; Sawers, G; Jarsch, M (1996) Alternative principles
for the production of recombinant proteins in Escherichia coli.
Applied Microbiology and Biotechnology 46(1): 1-9) genannt. Ganz
besonders bevorzugt ist der Einsatz des so genannten T7-Promotors
im erfindungsgemäßen Expressionssystem
(Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.;
(1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned
genes, Methods Enzymol. 185, 61-89; oder Broschüren der Firmen Novagen oder
Promega).
Es
hat sich als für
die Funktionsfähigkeit
des erfindungsgemäßen Expressionssystems
nützlich
erwiesen, dass auf den entsprechenden Plasmiden bestimmte Nukleinsäuresequenzen
vorhanden sind, die für
als Helferproteine bekannte Peptidsequenzen kodieren und deren Funktionen
bisher weitgehend unbekannt sind. Diese sind dem Fachmann im Hinblick
auf die Erzeugung aktiver Nitrilhydratasen bekannt (Nojiri M; Yohda
M; Odaka M; Matsushita Y; Tsujimura M; Yoshida T; Dohmae N; Takio
K; Endo I (1999) Functional expression of nitrile hydratase in Escherichia
coli: requirement of a nitrile hydratase activator and post-translational
modification of a ligand cysteine. Journal of biochemistry 125(4):
696-704). Ganz besonders bevorzugt ist ein Expressionssystem, bei
dem pro eingesetztem Plasmidsatz mindestens eine Nukleinsäuresequenz
kodierend für
ein solches Helferprotein, insbesondere das p47K- (Seq. ID No. 33)
oder p12K-Protein (Seq. ID No. 31), vorhanden ist. Ein Plasmidsatz
bezeichnet dabei die Plasmide die erfindungsgemäß notwendig sind, eine aktive
Nitrilhydratase aufzubauen.
Wie
Eingangs näher
erläutert
sind Nitrilhydratasen aus verschiedenen Organismen bekannt (s.a. PCT/EP04/00338;
Diss. s.o.). Vorzugsweise werden in dem erfindungsgemäßen Expressionssystem
jedoch solche Nukleinsäuresequenzen
verwendet, die für
Untereinheiten von Nitrilhydratasen kodieren, welche ihren Ursprung
in Nitrilhydratasen aus Rhodococcus-Stämmen haben. Die eingesetzten
Nukleinsäuresequenzen können dabei
gegenüber
den Ursprungssequenzen aus Rhodococcus durch Mutagenese auf chemischer
oder molekularbiologischer Basis verändert sein. Es kommen dabei
insbesondere solche Nukleinsäuresequenzen in
Betracht, die für
Untereinheiten kodieren, die gegenüber den Wildtypsequenzen im
Hinblick auf Aktivität und/oder
Selektivität
und/oder Stabilität
verbessert sind. Die Verbesserung der Aktivität und/oder Selektivität und/oder
Stabilität
bedeutet erfindungsgemäß, dass
die ins Auge gefassten Enzyme aktiver und/oder selektiver bzw. weniger
selektiv oder unter den verwendeten Reaktionsbedingungen stabiler
sind. Während
die Aktivität
und die Stabilität
der Enzyme für
die technische Anwendung naturgemäß möglichst hoch sein sollte, ist in
Bezug auf die Selektivität
dann von einer Verbesserung die Rede, wenn entweder die Substratselektivität abnimmt,
die Enantioselektivität
der Enzyme jedoch gesteigert ist.
Die
Vorgehensweise zur Verbesserung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
bzw. der durch sie codierten Polypeptide durch Mutagenese-Methoden
ist dem Fachmann hinlänglich
bekannt. Als Mutagenese-Methoden kommen alle dem Fachmann für diesen
Zweck zur Verfügung
stehenden Methoden in Frage. Insbesondere sind dies die Sättigungsmutagenese,
die Random-Mutagenesis, in vitro-Rekombinations-Methoden sowie Site-Directed-Mutagenesis
(Eigen, M. und Gardiner, W. (1984), Evolutionary molecular engineering
based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 56, 967-978; Chen, K.
und Arnold, F. (1991), Enzyme engineering for nonaqueous solvents:
random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar
organic media. Bio/Technology 9, 1073- 1077; Horwitz, M. und Loeb, L. (1986),
Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci
USA 83, 7405-7409;
Dube, D. und L. Loeb (1989), Mutants Generated By The Insertion
Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase
Gene, Biochemistry 28, 5703-5707; Stemmer, P.C. (1994), Rapid evolution
of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370, 389-391 und
Stemmer, P.C. (1994), DNA shuffling by random fragmentation and
reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc
Natl Acad Sci USA 91, 10747-10751).
Besonders
bevorzugt stammen die Nukleinsäuresequenzen
kodierend für
die Untereinheiten der Nitrilhydratasen aus Rhodococcus-Stämmen, insbesondere
R. erythropolis 870-AN019.
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsformen
werden die eingesetzten Nukleinsäuresequenzen dahingehend
verändert,
dass sie der „codon
usage" von E. coli
besonders gut entsprechen. Es hat sich gezeigt, dass je mehr der
Codon-Gebrauch des
zu exprimierenden Gens dem von E. coli entspricht, die Ausbeuten
der gewonnenen Enzyme weiter gesteigert werden können. Besonders bevorzugt ist
es deshalb, die Nukleinsäuresequenzen
kodierend für
die Untereinheiten der Nitrilhydratasen entsprechend der „codon
usage" von E. coli
zu modifizieren. Unter „codon
usage" wird die
Tatsache verstanden, dass unterschiedliche Organismen unterschiedliche
Basentripletts, welche für
die gleichen Aminosäuren
kodieren (Degeneration des genetischen Code), in unterschiedlicher
Ausprägung
gebrauchen.
Als
Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen
Zweck zur Verfügung stehenden
Ausführungsformen
in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und
Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff
J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression
of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89) oder den Broschüren der
Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco
BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden
werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach,
Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt,
D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors
and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990),
Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185,
3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular
cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York. Plasmide, mit denen die
die Nukleinsäuresequenzen
aufweisenden Genkonstrukte kodierend für die Untereinheiten in ganz
bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden können, sind:
pUC18/19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche
Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3
(Stratagene) oder pET (Novagen). Ganz besonders bevorzugt ist ein
Expressionssystem auf Basis von Plasmide der pET-Reihe. Äußerst bevorzugt ist der Einsatz
von Plasmiden der gleichen Reihe sowohl für die Expression der Nukleinsäuresequenz
kodierend für
die α- und β-Untereinheit.
In
einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf ein Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratasen. Das Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, dass es unter Verwendung eines wie oben
dargestellten erfindungsgemäßen Expressionssystems
durchgeführt
wird.
In
einer bevorzugten Ausführungsformen
wird das erfindungsgemäße Verfahren
so durchgeführt,
dass die Expression bei Inkubationstemperaturen von kleiner 30 Grad
Celsius, bevorzugt kleiner 25 Grad Celsius und ganz besonders bevorzugt ≤ 20 Grad Celsius
durchgeführt
wird. Weiterhin vorteilhaft ist die Ausgestaltung, bei der während der
Expression zum Medium Alkohole, insbesondere Ethanol, in einer Konzentration
von kleiner 10% (w/w), bevorzugt kleiner 5% (w/w) und ganz besonders
bevorzugt 2-4% (w/w) zugegeben wird. Durch diese Maßnahmen
wird erreicht, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung
der Nitrilhydratasen unlösliche
Proteine (inclusion bodies), welche keine Aktivität entfalten,
nicht oder nur in vermindertem Maße gebildet werden.
In
einer nächsten
Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Wirtsorganismus aufweisend
ein erfindungsgemäßes Expressionssystem.
Wie weiter oben schon angedeutet können die Nukleinsäuresequenzen
kodierend für
die Untereinheiten von Nitrilhydratasen in wie oben geschilderter
erfindungsgemäßer Art
und Weise in Plasmide integriert und in Wirtsorganismen transformiert
werden. Zusätzlich kann
neben dem erfindungsgemäßen Expressionssystem
in dem Wirtsorganismus auch klonierte Gene für eine ggf. stereoselektiv
arbeitende Amidase (z.B. die aus WO2004/005517 oder
EP 1318193 ) vorhanden sein. Ein so
hergestellter Ganzzellkatalysator kann vorteilhafterweise beide
am Nitril-Abbau beteiligten Enzyme produzieren, womit sichergestellt
ist, dass das eingesetzte Nitril sofort zur entsprechenden Carbonsäuren umgewandelt
wird. Ganzzellkatalysatoren, welche mehrere an einer Reaktionskaskade
beteiligte Enzyme enthalten, sind bereits bekannt (
EP1216304 ). Deren Einsatz in der gegenständlichen
Erfindung erfolgt in äquivalenter
Art und Weise.
Werden
Rhamnose indizierbare Promotoren verwendet so sollte ein Organismus
wie in der
DE10155928 genannt
als Wirtsorganismus oder Ganzzellkatalysator eingesetzt werden.
Weiterhin vorteilhaft ist der Einsatz eines E. coli BL21 codon plus,
der ggf. gemäß dem der
DE10155928 in äquivalenter
Weise modifiziert ist.
Um
die Expression der Enzyme im Hinblick auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten
abzustimmen, können
die jeweils für
die Nitrilhydratase und die Amidase codierenden Nukleinsäuresequenzen
entsprechend ihren Umsetzungsraten in unterschiedliche Plasmide
mit unterschiedlichen Kopienzahlen kloniert und/oder unterschiedlich
starke Promotoren für
eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen verwendet
werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise
eine Akkumulation einer ggf. inhibierend wirkenden Zwischenverbindung
nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit
ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (Gellissen,
G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo,
R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996), Recombinant Hansenula
polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate
oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.;
Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.;
DE19920712 ).
Die
Herstellung eines derartigen Ganzzellkatalysators ist dem Fachmann
ebenfalls bekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T.
(1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. und Bolivar,
F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors
in E.coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, R.L. und Denhardt,
D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors
and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham).
Eine
weitere Ausgestaltung der gegenständlichen Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zur Herstellung von, ggf. enantiomerenangereicherten,
(Amino-)Carbonsäuren
oder (Amino-)Carbonsäureäureamiden.
Auch dieses Verfahren wird unter Verwendung eines wie oben dargestellten
Wirtsorganismus durchgeführt.
Das bedeutet, dass die an der Herstellung der Carbonsäuren oder
Carbonsäureamiden
beteiligten Nitrilhydratasen durch ein wie eben dargestellten Wirtsorganismus
gewonnen werden.
Für die Anwendung
können
die betrachteten Enzyme in freier Form als homogen auf gereinigte
Verbindungen oder als rekombinant (rec-) hergestelltes Enzym verwendet
werden. Weiterhin können
die Enzyme auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt
werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig
hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.
Möglich ist
ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Sharma
B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialiern – Techniken
und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt
die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick,
J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of ☐-Chymotrypsin Dissolved
in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010;
Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside
hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous
organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.;
Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between
chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme
in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291-305). Ganz besonders
bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven
Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol
(PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.;
Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase
complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech.
11, 375-378).
Äußerst bevorzugt
ist die Immobilisierung an Eupergit® ,
insbesondere Eupergit C® und Eupergit 250L® (Röhm) (Eupergit.RTM.
C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential.
Katchalski-Katzir, E.; Kraemer, D. M. Journal of Molecular Catalysis
B: Enzymatic (2000), 10(1-3),
157-176.).
Gleichfalls
bevorzugt ist die Immobilisierung an Ni-NTA in Kombination mit dem
His-Tag (Hexa-Histidin) ergänzten
Polypeptid (Purification of proteins using polyhistidine affinity
tags. Bornhorst, Joshua A.; Falke, Joseph J. Methods in Enzymology
(2000), 326, 245-254).Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar
(St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound
cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew.
Chem. Int. Ed. 39, 380-383).
Durch
diese Maßnahmen
kann es gelingen aus Polypeptiden (Enzymen), welche durch organische Solventien
instabil werden, solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen
und organischen Lösungsmitteln
bzw. ganz in Organik stabil sind und arbeiten können.
In
den nachstehenden Experimenten werden folgende Stämme verwendet:
Liste
der Verwendeten Stämme.
(Brandão
PFB, Clapp JP and Bull AT (2002). Discrimination and taxonomy of geographically
diverse strains of nitrile-metabolising actinomycetes using chemometric
and molecular sequencing techniques. Environmental Microbiology
4, 262-276; s.a. PCT/EP04/00338).
Für die blunt-end
Klonierung der Nitrilhydratasen und des p47K Proteins (Seq. ID No.
33) in pUC18/19 (xSmaI) (
1) aus den oben genannten Stämmen wurden
folgende Primer benutzt:
Die
ersten Expressionsexperimente im Ein-Vektor-Expressionssystem mit Nitrilhydratasen
aus den R. erythropolis-Stämmen
870-AN019, 871-AN042 und ENG-AN033 wurden mit Plasmiden der pUC18/19
Reihe in verschiedenen E. coli-Stämmen durchgeführt. Um
den optimalen Expressionswirt ermitteln zu können wurden die pUC18/19 Konstrukte
mit den Nitrilhydratasen aus R. erythropolis-Stämmen 870-AN019, 871-AN042 und ENG-AN033
in verschiedene E. coli's
transformiert und unter der Kontrolle des lac-Promotors exprimiert. Es
handelte sich dabei um folgende E. coli-Stämme: JM109, DH5α, BL21 codon
plus, BL21, HB101, MM294 und XL1blue.
Die
Aktivitäten
(Units pro g Zelltrockenmasse) der rekombinanten Nitrilhydratasen
in den verschiedenen Wirten lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Es zeigte sich, dass die höchste
Aktivität
mit E. coli BL21 codon plus RIL (Firma Stratagen) erhalten wurde,
in dem die Kopienzahl der für
E. coli seltenen t-RNA's
für Arginin
(AGA/AGG), Isoleucin (AUA) und Leucin (CUA) erhöht vorliegen. Dieser Wirtsorganismus
ist konstruiert worden, um speziell Gene mit einer an einen hohen
GC-Gehalt angepassten „codon-usage" zu exprimieren,
wie z.B. die aus Rhodococcen (72% GC).
Die
Nitrilhydratase aus R. erythropolis 870-AN019 in E. coli BL21 codon
plus zeigt mit großem
Abstand die höchste Aktivität von 100
U/g BTM, gefolgt von Nitrilhydratasen 870-AN019 in DH5α (8 U/g BTM) und Nitrilhydratasen
ENG-AN033 in BL21 codon plus (7 U/g BTM).
Die
Aktivitäten
aller anderen rekombinanten Organismen lagen unter 2 U/g BTM oder
waren nicht nachweisbar. Unter optimierten Bedingungen wurde sogar
für die
Nitrilhydratase 870-AN019 eine Aktivität von 280 U/g BTM erreicht.
Im
folgenden wurde die Expression von eisenabhängigen Nitrilhydratasen im
Zwei-Vektor-Expressionssystem durchgeführt, wobei α- und β-Untereinheiten getrennt auf
je einem Plamid vorlagen. Vorteil dieses Systems ist es, dass die
beiden Untereinheiten jeweils direkt unter der Kontrolle des ggf.
eingesetzten T7-Promoters liegen und somit die Transkripte für die Gene
gleich stark gebildet werden. Das p47K-Helferprotein (Seq. ID No.
33) war von Fall zu Fall einem der beiden Untereinheiten nachgeschaltet.
Als Expresssionsvektoren dienten Plasmide der pET-Reihe (pET22b
und pET26b) der Firma Stratagene. es wurde die Expression der Nitrilhydratase
aus R. erythropolis 870-AN019 (Seq. Nr. 1 und 3) angestrebt.
Für die Klonierung
der beiden Untereinheiten und des p47K Proteins (Seq. ID No. 33)
wurden folgende Primer benutzt:
Für die α- und β-Untereinheit
wurden Primer von der Nitrilhydratasesequenz aus R. erythropolis 870-AN019
abgeleitet (Brandao PFB, Clapp JP, Bull AT (2003) Diversity of nitrile
hydratase and amidase enzyme genes in Rhodococcus erythropoli recovered
from geographically distinct habitats. Applied and Environmental
Microbiology 69(10): 5754-5766; s.a. PCT/EP04/00338), welche mit
Schnittstellen für
die Restriktionsendonukleasen NdeI (N-Terminal) bzw: BamHI (α-Untereinheit) oder
EcoRI (β-Untereinheit)
C-Terminal versehen waren. Die Primer für p47K wurden ebenfalls von
diesem Organismus abgeleitet und enthielten die Schnittstellen für BamHI
(N-terminal) bzw. HinDIII (C-terminal).
Die β-Untereinheit
wurde in pET26b, die α-Untereinheit und
p47K zusammen in pET22b kloniert. Es resultierten folgende Plasmide,
welche in E. coli BL21 Codon (+) RIL transformiert wurden (siehe
auch Abb. 2/3).
Verglichen
wurden die Aktivitäten
der Nitrilhydratase aus R., erythropolis 870-AN019 in den E. coli-Stämmen BL21
und BL21 codon plus RIL (siehe oben). Mit dem oben beschriebenen
Expressionssystem wurden Aktivitäten
von ca. 1750 U/g BTM mit E. coli BL21 erreicht und 2750 U/g BTM
mit mit E. coli BL21 codon (+) (bezogen auf Benzonitril als Substrat).
Dies bedeutet eine Steigerung gegenüber den Ein-Vektor-Expressionssystemen
um den Faktor 5,3 bis 8,3.
50%
des rekombinanten Proteins in der Zelle lagen hier allerdings als
sogenannte „inclusion
bodies" vor. Zur
weiteren Verbesserung der Aktivitäten der Nitrilhydratasen wurden
Parameter wie IPTG-Konzentration, Temperatur während der heterologen Expression
und Zusatz von Additiven ins Medium untersucht. Die Verminderung
der IPTG-Konzentration hatte keinen Einfluss auf die Löslichkeit
der rekombinanten Nitrilhydratasen. Daher wurden alle weiteren Experimente
mit 1 mM IPTG durchgeführt.
Den größten Effekt
auf die Verminderung der „inclusion
body"-Bildung hatte
die Absenkung der Inkubationstemperatur.
Durch
die Reduktion der Temperatur bis auf 20°C nach Induktion der heterologen
Expression konnte ein großer
Anteil des Enzyms in die lösliche
Fraktion überführt werden.
Ein zusätzlichen
positiven Effekt hatte die Zugabe von 3% Ethanol zum Medium. Unter
diesen Bedingungen (1 mM IPTG, 20°C
Inkubationstemperatur, 3% Ethanolzusatz) konnte eine Aktivität von 6480
U/g BTM erreicht werden.
Eine
weitere Erhöhung
der Aktivität
wurde durch die Nutzung eines synthetischen Gens der Nitrilhydratase
870-AN019 erreicht. Hergestellt wurden die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen
kodierend für
die α- und β-Untereinheiten unter
Berücksichtigung
der „codon
usage" von E. coli
und unter Beibehaltung der Aminosäureabfolge der beiden Gene.
Vorteil dieser synthetischen Gene sollte sein, dass die DNA-Sequenz
optimal für
eine Expression in E. coli angepasst ist und somit auch die Nutzung
des sogenannten „codon
plus" Stammes entfallen
kann. Die Untereinheiten wurden dann wie schon zuvor beschrieben
getrennt in pET-Vektoren
kloniert und unter den oben optimierten Bedingungen in E. coli BL21
exprimiert. Mit diesem Stamm wurde eine Aktivität von ca. 10.000 U/g BTM erreicht.
Somit ist er mehr als doppelt so aktiv wie der Wildtyp R. erythropolis
870-AN019, der eine
Aktivität
von ca. 4760 U/g BTM mit Benzonitril als Substrat besitzt. Eine
Zusammenfassung über
die erreichten Aktivitäten
gibt die Tabelle 2.
Die
synthetischen Nitrilhydratase macht in dem E. coli-Wirt ca. 50%
des gesamten gebildeten Zellproteins aus, wobei ca. 20% als gelöstes rekombinantes
Protein vorliegen.
Tabelle
2: Übersicht über die
gemessenen Nitrilhydratase-Aktivitäten mit
den unterschiedlichen Expressionssystemen.
Abschließend wurde
die Expression von cobaltabhängigen
Nitrilhydratasen im Zwei-Vektor-Expressionssystem untersucht. Die
cobaltabhängige
Nitrilhydratase aus Rhodococcus rhodochrous M8 (Pogorelva TE, Ryabchenko
LE, Sunzov NI, Yanenko AS (1996) Cobalt-dependent transcription
of nitrile hydratase gene in Rhodococcus rhodochrous M8. FEMS Microbiology
Letters 144: 191-195) wurde kloniert und mit dem oben beschriebenen
erfindungsgemäßen Expressionssystem
hergestellt.
Die
Sequenz der Nitrilhydratase (Seq. ID No. 13 und 15) ist bei GenBank
(DNA Datenbank von DDBJ, EMBL und NCBI) unter der Kennung X86737
hinterlegt und frei zugänglich.
Zur Klonierung der einzelnen Untereinheiten und des p12K-Proteins aus R. rhodochrous
M8 (Seq. ID No. 31) wurden folgende Primer benutzt:
Für die α- und β-Untereinheit
wurden Primer von der Nitrilhydratasesequenz aus M8 abgeleitet,
welche mit Schnittstellen für
die Restriktionsendonukleasen NdeI (N-Terminal) bzw: BamHI (C-Terminal) versehen
waren. Die Primer für
p12K wurden von der Sequenz von R. rhodochrous J1 abgeleitet und
enthielten die Schnittstellen für
BamHI (N-terminal)
bzw. SacI (C-terminal). Die β-Untereinheit
(Seq. ID No. 15) wurde in pET26b, die α-Untereinheit (Seq. ID. No.
13) und p12K (Seq. ID No. 31) in pET22b kloniert. Es resultierten
folgende Plasmide, welche in E. coli BL21 Codon(+) RIL transformiert
wurden (Abb. 4/5).
Im
Gegensatz zur Expression von eisenabhängigen Nitrilhydratasen in
E. coli, musste im Fall der cobaltabhängigen Nitrilhydratase die
Zellen über
mehrere Generationen vorkultiviert werden, um diese an das toxische
Cobalt (0,5 mM eingesetzt) zu gewöhnen.
In
Tabelle 3 sind die Aktivitäten
der rekombinanten cobaltabhängigen
(R. rhodochrous M8) und eisenabhängigen
(R. erythropoli 870-AN019) Nitrilhydratasen im Vergleich dargestellt.
Tabelle
3: Gemessene Aktivitäten
der cobalt- und eisenabhängigen
Nitrilhydratase nach erfindungsgemäßer Expression mit Acrylamid
als Substrat.
Damit
konnte gezeigt werden, dass das erfindungsgemäße Expressionssystem sowohl
für cobalt-
als auch für
eisenabhängige
Nitrilhydratasen im vorteilhafter Art und Weise zu gebrauchen ist.
Es können
insbesondere darmatische Aktivitätssteigerungen
erzielt werden, wenn die Expressionssysteme und/oder Sequenzen entsprechend
optimiert werden. Durch die erfolgreiche getrennte Expression der
Untereinheiten der Nitrilhydratase ist es darüber hinaus möglich neue
Kombinationen von Untereinheiten verschiedener Nitrilhydratasen
zu untersuchen, was die Diversifikation der Nitrilhydratasen und
damit deren Eigenschaften steigern hilft. Dies war so aus dem Stand
der Technik zum Zeitpunkt der Erfindung in naheliegender Weise nicht
ableitbar.
Unter
optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten)
Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen
Antipode im Gemisch mit der anderen in >50 mol-% verstanden.
Unter
dem Begriff Nukleinsäuresequenzen
werden alle Arten von einzelsträngiger
oder doppelsträngiger
DNA als auch RNA oder Gemische derselben subsumiert.
Die
Organismen 870-AN019, ENG-AN033 und 871-AN042 wurden bei der Deutsche
Sammlung für Mikroorgansimen
und Zellkulturen, Mascheroder Weg 4, 38124 Braunschweig gemäß dem Budapester
Vertrag durch die Anmelderin am 22.10.2002 hinterlegt.
Der
organismus Rhodococcus rodochrous M8 ist in der All-Russian National
Collection of Microorganisms unter der Nummer VKPM-S-926 hinterlegt.
Die entsprechenden Sequenzen können
der Gendatenbank (s.o.) entnommen werden.
Der
terminus Expressionssystem wird erfindungsgemäß so verstanden, dass es sich
dabei um biologisches Material auf Nukleinsäurebasis handelt, welches im
Stande ist, in Organismen die Expression der ihm innewohnenden Nukleinsäuresequenzen
kodierend für
die Nitrilhydratase-Unterheiten
zu bewerkstelligen. Insbesondere sind dies Plasmide und Vektoren.
Im
Rahmen der Erfindung werden die Ausdrücke Protein und Polypeptid
synonym benutzt.
Beschreibung der Abbildungen:
1:
Die Vektorkarte zeigt die allgemeine Anordnung der α- und β-Untereinheiten
der Nitrilhydratase bzw. des Orf's
p47K im Plasmid pUC18 in einem Expressionssystem mit einem Vektor.
2/3:
Die Vektorkarten zeigen die Anordnung der α- und β-Untereinheiten
der Nitrilhydratase bzw. des Orf's
p47K aus R. erythropolis 870-AN019 in Plasmiden der pET-Reihe in
einem Expressionssystem mit zwei Vektoren.
4/5:
Die Vektorkarten zeigen die Anordnung der α- und β-Untereinheiten
bzw. des Orf's p12K
aus R. rhodochrous M8 in Plasmiden der pET-Reihe in einem Expressionssystem
mit zwei Vektoren.