DE102004013843A1

DE102004013843A1 - Expression von Nitrilhydratasen im Zwei-Vektor-Expressionssystem

Info

Publication number: DE102004013843A1
Application number: DE102004013843A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Verseck; Steffen Dr. Oßwald; Wai-Yee Pong; Klaus Dr. Liebeton; Jürgen Dr. Eck
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: BRAIN Biotech AG
Priority date: 2004-03-20
Filing date: 2004-03-20
Publication date: 2005-10-13
Also published as: WO2005090577A1; EP1727902A1; ATE407211T1; CA2559361C; DE602005009509D1; CA2559361A1; US20080102496A1; EP1727902B1; DK1727902T3; ZA200607777B

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Expressionssystem für Nitrilhydratase. Die aus Untereinheiten aufgebauten Nitrilhydratasen werden dabei in der Art und Weise gebildet, dass die jeweiligen Untereinheiten auf unterschiedlichen Plasmiden beheimatet sind und gleichzeitig in E. coli exprimiert werden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Expressionsystem für die Herstellung von Nitrilhydratasen. Nitrilhydratasen bestehen aus verschiedenen Untereinheiten. Das gegenständliche System erlaubt die Herstellung der Nitrilhydratasen in gegenüber dem Stand der Technik verbesserter Art und Weise durch die getrennte Expression der Nukleinsäuresequenzen kodierend für diese Untereinheiten auf getrennten Plasmiden.
Die Strukturklassen der Amide und Carbonsäuren gewinnen mehr und mehr an Bedeutung als Vorstufen von Feinchemikalien. Spezielle Aminoamide und (proteinogene und nichtproteinogene) Aminosäuren sind Schlüsselintermediate für die Synthese von pharmazeutischen und agrochemischen Produkten, als auch im Lebensmittelbereich. Insbesondere enantiomerenreine Amide und Aminosäuren spielen eine immer größer werdende Rolle in den oben genannten Anwendungsbereichen.
Aminonitril-Vorstufen, wie sie für die Herstellung der oben angegebenen Verbindungsklassen benötigt werden, sind in racemischer Form leicht über die so genannte Streckersynthese zugänglich. Die so gewonnenen Nitrile können anschließend mittels chemischer oder enzymatischer Verseifung in die entsprechenden Amide und Carbonsäuren überführt werden.

Es sind drei Enzyme bekannt, die an der enzymatischen Hydrolyse von Nitrilen beteiligt sein können. Nitrilasen setzen eine Nitril-Funktion direkt zur Säure um, wohingegen Nitrilhydratasen (E.C. 4.2.1.84) hier das entsprechende Amid bilden. Dieses kann durch eine Amidase (E.C. 3.5.1.4) abschließend in die entsprechende Carbonsäure umgesetzt werden (Schema 1).

Schema 1:

Die Verseifung von Nitrilen zu den entsprechenden Amiden und Säuren mittels isolierter Enzyme oder Ganz-Zell-Katalysatoren hilft große Mengen Salz zu sparen, welche ansonsten bei dem Neutralisierungsschritt nach der chemischen Verseifung von Nitrilen anfallen würden. Aus diesem Grund stellt die enzymatische Verseifung von Nitrilen zu z.B. Aminoamiden und/oder Aminosäuren ein nachhaltigeres Produktionsverfahren dar.

Nitrilhydratasen bestehen in ihrer aktiven Form aus 2 nichthomologen α- und β-Untereinheiten. Diese bilden Heterodimere, Tetramere, und bei Rhodococcus rhodochrous J1 wurden sogar Decamere nachgewiesen. Die α- und β-Untereinheiten besitzen ungefähr die gleiche Größe, haben aber sonst keine Ähnlichkeiten untereinander. Nitrilhydratasen sind Metalloproteine die Fe³⁺ oder Co³⁺ enthalten (Bunch A. W. (1998), Nitriles, in: Biotechnology, Volume 8a, Biotransformations I, Chapter 6, Eds.: Rehm HJ, Reed G, Wiley-VCH, p. 277-324; Shearer J, Kung IY, Lovell S, Kaminsky W, Kovacs JA (2001) Why is there a "inert" metal center in the active site of nitrile hydratase? Reactivity and ligand dissociation from a five-coordinate Co(III) nitrile hydratase model. J Am Chem Soc 123: 463-468; Kobayashi M, Shimizu S (2000) Nitrile hydrolases. Current Opinion in Chemical Biology 4: 95-102).

Eine der größten Herausforderungen bisher ist die heterologe Darstellung von Nitrilhydratasen in einem geeigneten Wirt, bevorzugt in E. coli. Dieses Gram negative Bakterium ist bekannt für seine hohen Expressionsraten heterologer Proteine. Ein weiterer Vorteil ist die Ausbeute an Biomasse in Hoch-Zelldichte-Fermentationen mit E. coli. Hierbei können Produktivitäten von über 100 g Biotrockenmasse (BTM) in 24 bis 44 Stunden erreicht werden (Lee SY (1996) High cell-density culture of Escherichia coli. TIBTECH 14:98-105; Riesenberg D, Guthke R (1999) High-cell-density cultivation of microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol 51:422-430).

Die meisten Nitrilhydratase-Sequenzen der α- und β-Untereinheit sind aus der Gattung Rhodococcus bekannt. Aber gerade die Expression der Nitrilhydratasen aus dieser Gattung in E. coli war bisher nur unter besonderen Schwierigkeiten möglich (Ikehata O, Nishiyama M, Horinouchi S, Beppu T (1989) Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and ist expression in Escherichia coli. Eur J Biochem 181: 563-570).

In der Literatur sind Ein-Vektor-Expressionssysteme für Nitrilhydratasen beschrieben deren spezifische Aktivitäten zwischen 4,2 und 12,2 U/mg Gesamtprotein für Co-abhängige Nitrilhydratasen aus R. rhodochrous J1 (Kobayasjhi M, Nishiyama M, Nagasawa T, Horinouchi S, Beppu T, Yamada H (1991) Cloning, nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of two cobalt-containing nitrole hydratase genes from Rhodococcus rhodochrous. Biochim Biophys Acta 1129: 23-33) und 452 U/mg Gesamtprotein für eine eisenabhängige Nitrilhydratase aus Rhodococcus spec. N-771 liegen (Njori M, Yohda M, Odaka M, Matsushita Y, Tsujimura M, Yoshida T, Dohmae N, Takio K Endo I (1999) Functunal expression of Nitrile hydratases in E. coli: Requirement of a nitrile hydratase activator and a post-translational modification of a ligand cysteine. J Biochem 125: 696-704), was ungefähr ca. 248 U/mg BTM (Biotrockenmasse) entspricht (Kalkulation nach Goodsell DS (1991) Inside a cell. TIBS 16: 203-206). Interessanterweise konnte die letztgenannte Aktivität mit Nitrilhydratasen aus R. erythropolis, welche nahe verwandt sind mit Rhodococcus spec. N-711, mit ähnlichen Vektorsystemen und Anordnungen der Strukturgene nicht nachvollzogen werden. Es bestand daher immer noch ein Bedarf an Verfahren und Systemen welche es gestatten, die ins Auge gefassten Enzyme in für technische Maßstäbe ausreichender Art und Weise zur Verfügung zu stellen.

Der Einsatz von Zwei-Vektor-Expressionssystemen für die heterologe Expression rekombinanter Proteine in E. coli ist dem Fachmann bereits bekannt, wie zum Beispiel die Bildung des motorischen Proteins Kinesin (Skowronek K, Kasprzak A (2002) A two-plasmid system for independent genetic manipulation of subunits of homodimeric proteins and selective isolation of chimeric dimers. Analytical Biochemistry 300: 185-191), des Plaminogen-Proaktivator Streptokinase (Yazdani SS, Mukherjee KJ (2002) Continuousculture studies on the stability and expression of recombinant streptokinase in Escherichia coli; stability and expression of streptokinase in continuous culture. Bioprocess and Biosystems Engineering 24(6): 341-346), des Komplexes zweier humaner Proteine (hematopoietic cell tyrosine phosphatase und der mitogen proteine kinase; Kholod N, Mustelin T (2001) Novel vectors for co-expression of two proteins in E. coli. 31: 322-328) oder der humanen Kreatin Kinase CKMB (WO95/12662) zeigen.

Bisher wurden jedoch noch keine heteromeren Enzyme die als Biokatalysatoren in der chemischen Industrie eingesetzt werden, wie z.B. die Nitrilhydratasen, mit einem solchen System exprimiert.

Aufgabe war es daher ein Expressionssystem zu entwickeln, das es erlaubt, effizient sowohl cobalt- als auch eisenabhängige Nitrilhydratasen aktiv in E. coli zu exprimieren. Insbesondere sollte das erfindungsgemäße System in der Lage sein, die ins Auge gefassten Enzyme in gegenüber dem Stand der Technik erhöhter Expressionsrate und ggf. stabileren Formen zur Verfügung zu stellen, um so deren Einsatz im technischen Maßstab unter ökologischen und ökonomischen Gesichtspunkten vorteilhaft zu gestalten.

Diese und weitere nicht näher spezifizierte sich jedoch aus dem Stand der Technik in naheliegenderweise ergebende Aufgaben werden durch die Angabe eines Expressionssystems mit den Merkmalen des gegenständlichen Anspruchs 1 gelöst. Ansprüche 2 bis 8 beziehen sich auf bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Expressionssystems. Ansprüche 9 und 10 sind auf Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratasen bzw. (Amino-)Carbonsäuren oder (Amino-)Carbonsäureamide gerichtet. Anspruch 11 schützt einen mit dem Expressionssystem ausgestatteten Wirtsorganismus.

Dadurch, dass bei einem Expressionssystem für die gleichzeitige Expression der Nukleinsäuresequenzen kodierend für die verschiedenen Untereinheiten einer Nitrilhydratase das Expressionssystem mindestens je ein Plasmid mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz kodierend für die jeweilige Untereinheit aufweist, gelangt man äußerst vorteilhaft und nichts desto weniger völlig überraschend zur Lösung der gestellten Aufgabe. Mit dem vorgeschlagenen Expressionssystem ist es möglich, die heterologe Expression der ins Auge gefassten Nukleinsäuresequenzen in für technische Maßstäbe ausreichender Art und Weise zu bewerkstelligen. Es kann dabei besonders überraschen, dass allein die getrennte Expression der eigentlich in einem Operon organisierten Nukleinsäuresequenzen kodierend für die entsprechenden Untereinheiten der Nitrilhydratasen auf verschiedenen Plasmiden dazu beiträgt, die Aktivität der erhaltenen Nitrilhydratasen um den Faktor > 8 gegenüber der „normalen" Expression zu steigern. Dies war so aus dem Stand der Technik in naheliegender Weise nicht herleitbar.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem kann in allen dem Fachmann für den vorliegenden Zweck in Frage kommenden Wirtsorganismen eingesetzt werden. Als Mikroorganismen sind diesbezüglich Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen zu nennen. Wirtsorganismen, in die die Nukleinsäuresequenzen aufweisende Plasmide kloniert werden können, dienen zur Vermehrung und Gewinnung einer ausreichenden Menge des rekombinanten Enzyms. Die Verfahren hierfür sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10- , HB101, BL21 codon plus, BL21 (DE3) codon plus, BL21, BL21 (DE3), MM294. Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt vorzugsweise in den Wirtsorganismus kloniert wird, sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (s.a. PCT/EP03/07148; s.u.). Ganz besonders bevorzugt ist ein Expressionssystem, das in E. coli BL21 als Wirt vorliegt.

Promotoren sind DNA-Sequenzbereiche, von denen aus die Transkription eines Gens oder Operons gesteuert wird. Die für die Ausführung der Erfindung besonders vorteilhaften Promotoren, welche insbesondere in E. coli einzusetzen sind, sind dem Fachmann bekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York ). Es hat sich jetzt als vorteilhaft erwiesen, wenn die Expression der Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten unter der Kontrolle von jeweils dem gleichen Promotor steht, damit die Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten in möglichst gleicher Geschwindigkeit exprimiert werden können. Geeignete Promotoren können solche ausgewählt aus der Gruppe T7, lac, tac, trp, ara oder rhamnose induzierbare sein. Weitere sind in (Cantrell, SA (2003) Vectors fort he expression of recombinant proteins in E. coli. Methods in Molecular biology 235: 257-275; Sawers, G; Jarsch, M (1996) Alternative principles for the production of recombinant proteins in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology 46(1): 1-9) genannt. Ganz besonders bevorzugt ist der Einsatz des so genannten T7-Promotors im erfindungsgemäßen Expressionssystem (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89; oder Broschüren der Firmen Novagen oder Promega).

Es hat sich als für die Funktionsfähigkeit des erfindungsgemäßen Expressionssystems nützlich erwiesen, dass auf den entsprechenden Plasmiden bestimmte Nukleinsäuresequenzen vorhanden sind, die für als Helferproteine bekannte Peptidsequenzen kodieren und deren Funktionen bisher weitgehend unbekannt sind. Diese sind dem Fachmann im Hinblick auf die Erzeugung aktiver Nitrilhydratasen bekannt (Nojiri M; Yohda M; Odaka M; Matsushita Y; Tsujimura M; Yoshida T; Dohmae N; Takio K; Endo I (1999) Functional expression of nitrile hydratase in Escherichia coli: requirement of a nitrile hydratase activator and post-translational modification of a ligand cysteine. Journal of biochemistry 125(4): 696-704). Ganz besonders bevorzugt ist ein Expressionssystem, bei dem pro eingesetztem Plasmidsatz mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein solches Helferprotein, insbesondere das p47K- (Seq. ID No. 33) oder p12K-Protein (Seq. ID No. 31), vorhanden ist. Ein Plasmidsatz bezeichnet dabei die Plasmide die erfindungsgemäß notwendig sind, eine aktive Nitrilhydratase aufzubauen.

Wie Eingangs näher erläutert sind Nitrilhydratasen aus verschiedenen Organismen bekannt (s.a. PCT/EP04/00338; Diss. s.o.). Vorzugsweise werden in dem erfindungsgemäßen Expressionssystem jedoch solche Nukleinsäuresequenzen verwendet, die für Untereinheiten von Nitrilhydratasen kodieren, welche ihren Ursprung in Nitrilhydratasen aus Rhodococcus-Stämmen haben. Die eingesetzten Nukleinsäuresequenzen können dabei gegenüber den Ursprungssequenzen aus Rhodococcus durch Mutagenese auf chemischer oder molekularbiologischer Basis verändert sein. Es kommen dabei insbesondere solche Nukleinsäuresequenzen in Betracht, die für Untereinheiten kodieren, die gegenüber den Wildtypsequenzen im Hinblick auf Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität verbessert sind. Die Verbesserung der Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität bedeutet erfindungsgemäß, dass die ins Auge gefassten Enzyme aktiver und/oder selektiver bzw. weniger selektiv oder unter den verwendeten Reaktionsbedingungen stabiler sind. Während die Aktivität und die Stabilität der Enzyme für die technische Anwendung naturgemäß möglichst hoch sein sollte, ist in Bezug auf die Selektivität dann von einer Verbesserung die Rede, wenn entweder die Substratselektivität abnimmt, die Enantioselektivität der Enzyme jedoch gesteigert ist.

Die Vorgehensweise zur Verbesserung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. der durch sie codierten Polypeptide durch Mutagenese-Methoden ist dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Mutagenese-Methoden kommen alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Methoden in Frage. Insbesondere sind dies die Sättigungsmutagenese, die Random-Mutagenesis, in vitro-Rekombinations-Methoden sowie Site-Directed-Mutagenesis (Eigen, M. und Gardiner, W. (1984), Evolutionary molecular engineering based on RNA replication, Pure Appl. Chem. 56, 967-978; Chen, K. und Arnold, F. (1991), Enzyme engineering for nonaqueous solvents: random mutagenesis to enhance activity of subtilisin E in polar organic media. Bio/Technology 9, 1073- 1077; Horwitz, M. und Loeb, L. (1986), Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7405-7409; Dube, D. und L. Loeb (1989), Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 28, 5703-5707; Stemmer, P.C. (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370, 389-391 und Stemmer, P.C. (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 10747-10751).

Besonders bevorzugt stammen die Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten der Nitrilhydratasen aus Rhodococcus-Stämmen, insbesondere R. erythropolis 870-AN019.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die eingesetzten Nukleinsäuresequenzen dahingehend verändert, dass sie der „codon usage" von E. coli besonders gut entsprechen. Es hat sich gezeigt, dass je mehr der Codon-Gebrauch des zu exprimierenden Gens dem von E. coli entspricht, die Ausbeuten der gewonnenen Enzyme weiter gesteigert werden können. Besonders bevorzugt ist es deshalb, die Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten der Nitrilhydratasen entsprechend der „codon usage" von E. coli zu modifizieren. Unter „codon usage" wird die Tatsache verstanden, dass unterschiedliche Organismen unterschiedliche Basentripletts, welche für die gleichen Aminosäuren kodieren (Degeneration des genetischen Code), in unterschiedlicher Ausprägung gebrauchen.

Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Plasmide, mit denen die die Nukleinsäuresequenzen aufweisenden Genkonstrukte kodierend für die Untereinheiten in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden können, sind: pUC18/19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen). Ganz besonders bevorzugt ist ein Expressionssystem auf Basis von Plasmide der pET-Reihe. Äußerst bevorzugt ist der Einsatz von Plasmiden der gleichen Reihe sowohl für die Expression der Nukleinsäuresequenz kodierend für die α- und β-Untereinheit.

In einer weiteren Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratasen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es unter Verwendung eines wie oben dargestellten erfindungsgemäßen Expressionssystems durchgeführt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchgeführt, dass die Expression bei Inkubationstemperaturen von kleiner 30 Grad Celsius, bevorzugt kleiner 25 Grad Celsius und ganz besonders bevorzugt ≤ 20 Grad Celsius durchgeführt wird. Weiterhin vorteilhaft ist die Ausgestaltung, bei der während der Expression zum Medium Alkohole, insbesondere Ethanol, in einer Konzentration von kleiner 10% (w/w), bevorzugt kleiner 5% (w/w) und ganz besonders bevorzugt 2-4% (w/w) zugegeben wird. Durch diese Maßnahmen wird erreicht, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Nitrilhydratasen unlösliche Proteine (inclusion bodies), welche keine Aktivität entfalten, nicht oder nur in vermindertem Maße gebildet werden.

In einer nächsten Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Wirtsorganismus aufweisend ein erfindungsgemäßes Expressionssystem. Wie weiter oben schon angedeutet können die Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten von Nitrilhydratasen in wie oben geschilderter erfindungsgemäßer Art und Weise in Plasmide integriert und in Wirtsorganismen transformiert werden. Zusätzlich kann neben dem erfindungsgemäßen Expressionssystem in dem Wirtsorganismus auch klonierte Gene für eine ggf. stereoselektiv arbeitende Amidase (z.B. die aus WO2004/005517 oder EP 1318193 ) vorhanden sein. Ein so hergestellter Ganzzellkatalysator kann vorteilhafterweise beide am Nitril-Abbau beteiligten Enzyme produzieren, womit sichergestellt ist, dass das eingesetzte Nitril sofort zur entsprechenden Carbonsäuren umgewandelt wird. Ganzzellkatalysatoren, welche mehrere an einer Reaktionskaskade beteiligte Enzyme enthalten, sind bereits bekannt ( EP1216304 ). Deren Einsatz in der gegenständlichen Erfindung erfolgt in äquivalenter Art und Weise.

Werden Rhamnose indizierbare Promotoren verwendet so sollte ein Organismus wie in der DE10155928 genannt als Wirtsorganismus oder Ganzzellkatalysator eingesetzt werden. Weiterhin vorteilhaft ist der Einsatz eines E. coli BL21 codon plus, der ggf. gemäß dem der DE10155928 in äquivalenter Weise modifiziert ist.

Um die Expression der Enzyme im Hinblick auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten abzustimmen, können die jeweils für die Nitrilhydratase und die Amidase codierenden Nukleinsäuresequenzen entsprechend ihren Umsetzungsraten in unterschiedliche Plasmide mit unterschiedlichen Kopienzahlen kloniert und/oder unterschiedlich starke Promotoren für eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise eine Akkumulation einer ggf. inhibierend wirkenden Zwischenverbindung nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE19920712 ).

Die Herstellung eines derartigen Ganzzellkatalysators ist dem Fachmann ebenfalls bekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. und Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli, Methods Enzymol. 185, 14-37; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205-225, Butterworth, Stoneham).

Eine weitere Ausgestaltung der gegenständlichen Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von, ggf. enantiomerenangereicherten, (Amino-)Carbonsäuren oder (Amino-)Carbonsäureäureamiden. Auch dieses Verfahren wird unter Verwendung eines wie oben dargestellten Wirtsorganismus durchgeführt. Das bedeutet, dass die an der Herstellung der Carbonsäuren oder Carbonsäureamiden beteiligten Nitrilhydratasen durch ein wie eben dargestellten Wirtsorganismus gewonnen werden.

Für die Anwendung können die betrachteten Enzyme in freier Form als homogen auf gereinigte Verbindungen oder als rekombinant (rec-) hergestelltes Enzym verwendet werden. Weiterhin können die Enzyme auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.

Möglich ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Sharma B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialiern – Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of ☐-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009-5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971-1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375-378).

Äußerst bevorzugt ist die Immobilisierung an Eupergit^® , insbesondere Eupergit C^® und Eupergit 250L^® (Röhm) (Eupergit.RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir, E.; Kraemer, D. M. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000), 10(1-3), 157-176.).

Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung an Ni-NTA in Kombination mit dem His-Tag (Hexa-Histidin) ergänzten Polypeptid (Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Bornhorst, Joshua A.; Falke, Joseph J. Methods in Enzymology (2000), 326, 245-254).Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380-383).

Durch diese Maßnahmen kann es gelingen aus Polypeptiden (Enzymen), welche durch organische Solventien instabil werden, solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln bzw. ganz in Organik stabil sind und arbeiten können.

In den nachstehenden Experimenten werden folgende Stämme verwendet:
Liste der Verwendeten Stämme. (Brandão PFB, Clapp JP and Bull AT (2002). Discrimination and taxonomy of geographically diverse strains of nitrile-metabolising actinomycetes using chemometric and molecular sequencing techniques. Environmental Microbiology 4, 262-276; s.a. PCT/EP04/00338).

Tabelle 1:

Für die blunt-end Klonierung der Nitrilhydratasen und des p47K Proteins (Seq. ID No. 33) in pUC18/19 (xSmaI) (1) aus den oben genannten Stämmen wurden folgende Primer benutzt:

Die ersten Expressionsexperimente im Ein-Vektor-Expressionssystem mit Nitrilhydratasen aus den R. erythropolis-Stämmen 870-AN019, 871-AN042 und ENG-AN033 wurden mit Plasmiden der pUC18/19 Reihe in verschiedenen E. coli-Stämmen durchgeführt. Um den optimalen Expressionswirt ermitteln zu können wurden die pUC18/19 Konstrukte mit den Nitrilhydratasen aus R. erythropolis-Stämmen 870-AN019, 871-AN042 und ENG-AN033 in verschiedene E. coli's transformiert und unter der Kontrolle des lac-Promotors exprimiert. Es handelte sich dabei um folgende E. coli-Stämme: JM109, DH5α, BL21 codon plus, BL21, HB101, MM294 und XL1blue.

Die Aktivitäten (Units pro g Zelltrockenmasse) der rekombinanten Nitrilhydratasen in den verschiedenen Wirten lassen sich wie folgt zusammenfassen: Es zeigte sich, dass die höchste Aktivität mit E. coli BL21 codon plus RIL (Firma Stratagen) erhalten wurde, in dem die Kopienzahl der für E. coli seltenen t-RNA's für Arginin (AGA/AGG), Isoleucin (AUA) und Leucin (CUA) erhöht vorliegen. Dieser Wirtsorganismus ist konstruiert worden, um speziell Gene mit einer an einen hohen GC-Gehalt angepassten „codon-usage" zu exprimieren, wie z.B. die aus Rhodococcen (72% GC).

Die Nitrilhydratase aus R. erythropolis 870-AN019 in E. coli BL21 codon plus zeigt mit großem Abstand die höchste Aktivität von 100 U/g BTM, gefolgt von Nitrilhydratasen 870-AN019 in DH5α (8 U/g BTM) und Nitrilhydratasen ENG-AN033 in BL21 codon plus (7 U/g BTM).

Die Aktivitäten aller anderen rekombinanten Organismen lagen unter 2 U/g BTM oder waren nicht nachweisbar. Unter optimierten Bedingungen wurde sogar für die Nitrilhydratase 870-AN019 eine Aktivität von 280 U/g BTM erreicht.

Im folgenden wurde die Expression von eisenabhängigen Nitrilhydratasen im Zwei-Vektor-Expressionssystem durchgeführt, wobei α- und β-Untereinheiten getrennt auf je einem Plamid vorlagen. Vorteil dieses Systems ist es, dass die beiden Untereinheiten jeweils direkt unter der Kontrolle des ggf. eingesetzten T7-Promoters liegen und somit die Transkripte für die Gene gleich stark gebildet werden. Das p47K-Helferprotein (Seq. ID No. 33) war von Fall zu Fall einem der beiden Untereinheiten nachgeschaltet. Als Expresssionsvektoren dienten Plasmide der pET-Reihe (pET22b und pET26b) der Firma Stratagene. es wurde die Expression der Nitrilhydratase aus R. erythropolis 870-AN019 (Seq. Nr. 1 und 3) angestrebt.

Für die Klonierung der beiden Untereinheiten und des p47K Proteins (Seq. ID No. 33) wurden folgende Primer benutzt:

Für die α- und β-Untereinheit wurden Primer von der Nitrilhydratasesequenz aus R. erythropolis 870-AN019 abgeleitet (Brandao PFB, Clapp JP, Bull AT (2003) Diversity of nitrile hydratase and amidase enzyme genes in Rhodococcus erythropoli recovered from geographically distinct habitats. Applied and Environmental Microbiology 69(10): 5754-5766; s.a. PCT/EP04/00338), welche mit Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen NdeI (N-Terminal) bzw: BamHI (α-Untereinheit) oder EcoRI (β-Untereinheit) C-Terminal versehen waren. Die Primer für p47K wurden ebenfalls von diesem Organismus abgeleitet und enthielten die Schnittstellen für BamHI (N-terminal) bzw. HinDIII (C-terminal). Die β-Untereinheit wurde in pET26b, die α-Untereinheit und p47K zusammen in pET22b kloniert. Es resultierten folgende Plasmide, welche in E. coli BL21 Codon (+) RIL transformiert wurden (siehe auch Abb. 2/3).

Verglichen wurden die Aktivitäten der Nitrilhydratase aus R., erythropolis 870-AN019 in den E. coli-Stämmen BL21 und BL21 codon plus RIL (siehe oben). Mit dem oben beschriebenen Expressionssystem wurden Aktivitäten von ca. 1750 U/g BTM mit E. coli BL21 erreicht und 2750 U/g BTM mit mit E. coli BL21 codon (+) (bezogen auf Benzonitril als Substrat). Dies bedeutet eine Steigerung gegenüber den Ein-Vektor-Expressionssystemen um den Faktor 5,3 bis 8,3.

50% des rekombinanten Proteins in der Zelle lagen hier allerdings als sogenannte „inclusion bodies" vor. Zur weiteren Verbesserung der Aktivitäten der Nitrilhydratasen wurden Parameter wie IPTG-Konzentration, Temperatur während der heterologen Expression und Zusatz von Additiven ins Medium untersucht. Die Verminderung der IPTG-Konzentration hatte keinen Einfluss auf die Löslichkeit der rekombinanten Nitrilhydratasen. Daher wurden alle weiteren Experimente mit 1 mM IPTG durchgeführt. Den größten Effekt auf die Verminderung der „inclusion body"-Bildung hatte die Absenkung der Inkubationstemperatur.

Durch die Reduktion der Temperatur bis auf 20°C nach Induktion der heterologen Expression konnte ein großer Anteil des Enzyms in die lösliche Fraktion überführt werden. Ein zusätzlichen positiven Effekt hatte die Zugabe von 3% Ethanol zum Medium. Unter diesen Bedingungen (1 mM IPTG, 20°C Inkubationstemperatur, 3% Ethanolzusatz) konnte eine Aktivität von 6480 U/g BTM erreicht werden.

Eine weitere Erhöhung der Aktivität wurde durch die Nutzung eines synthetischen Gens der Nitrilhydratase 870-AN019 erreicht. Hergestellt wurden die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen kodierend für die α- und β-Untereinheiten unter Berücksichtigung der „codon usage" von E. coli und unter Beibehaltung der Aminosäureabfolge der beiden Gene. Vorteil dieser synthetischen Gene sollte sein, dass die DNA-Sequenz optimal für eine Expression in E. coli angepasst ist und somit auch die Nutzung des sogenannten „codon plus" Stammes entfallen kann. Die Untereinheiten wurden dann wie schon zuvor beschrieben getrennt in pET-Vektoren kloniert und unter den oben optimierten Bedingungen in E. coli BL21 exprimiert. Mit diesem Stamm wurde eine Aktivität von ca. 10.000 U/g BTM erreicht. Somit ist er mehr als doppelt so aktiv wie der Wildtyp R. erythropolis 870-AN019, der eine Aktivität von ca. 4760 U/g BTM mit Benzonitril als Substrat besitzt. Eine Zusammenfassung über die erreichten Aktivitäten gibt die Tabelle 2.

Die synthetischen Nitrilhydratase macht in dem E. coli-Wirt ca. 50% des gesamten gebildeten Zellproteins aus, wobei ca. 20% als gelöstes rekombinantes Protein vorliegen.

Tabelle 2: Übersicht über die gemessenen Nitrilhydratase-Aktivitäten mit den unterschiedlichen Expressionssystemen.

Abschließend wurde die Expression von cobaltabhängigen Nitrilhydratasen im Zwei-Vektor-Expressionssystem untersucht. Die cobaltabhängige Nitrilhydratase aus Rhodococcus rhodochrous M8 (Pogorelva TE, Ryabchenko LE, Sunzov NI, Yanenko AS (1996) Cobalt-dependent transcription of nitrile hydratase gene in Rhodococcus rhodochrous M8. FEMS Microbiology Letters 144: 191-195) wurde kloniert und mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionssystem hergestellt.

Die Sequenz der Nitrilhydratase (Seq. ID No. 13 und 15) ist bei GenBank (DNA Datenbank von DDBJ, EMBL und NCBI) unter der Kennung X86737 hinterlegt und frei zugänglich. Zur Klonierung der einzelnen Untereinheiten und des p12K-Proteins aus R. rhodochrous M8 (Seq. ID No. 31) wurden folgende Primer benutzt:

Für die α- und β-Untereinheit wurden Primer von der Nitrilhydratasesequenz aus M8 abgeleitet, welche mit Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen NdeI (N-Terminal) bzw: BamHI (C-Terminal) versehen waren. Die Primer für p12K wurden von der Sequenz von R. rhodochrous J1 abgeleitet und enthielten die Schnittstellen für BamHI (N-terminal) bzw. SacI (C-terminal). Die β-Untereinheit (Seq. ID No. 15) wurde in pET26b, die α-Untereinheit (Seq. ID. No. 13) und p12K (Seq. ID No. 31) in pET22b kloniert. Es resultierten folgende Plasmide, welche in E. coli BL21 Codon(+) RIL transformiert wurden (Abb. 4/5).

Im Gegensatz zur Expression von eisenabhängigen Nitrilhydratasen in E. coli, musste im Fall der cobaltabhängigen Nitrilhydratase die Zellen über mehrere Generationen vorkultiviert werden, um diese an das toxische Cobalt (0,5 mM eingesetzt) zu gewöhnen.

In Tabelle 3 sind die Aktivitäten der rekombinanten cobaltabhängigen (R. rhodochrous M8) und eisenabhängigen (R. erythropoli 870-AN019) Nitrilhydratasen im Vergleich dargestellt.

Tabelle 3: Gemessene Aktivitäten der cobalt- und eisenabhängigen Nitrilhydratase nach erfindungsgemäßer Expression mit Acrylamid als Substrat.

Damit konnte gezeigt werden, dass das erfindungsgemäße Expressionssystem sowohl für cobalt- als auch für eisenabhängige Nitrilhydratasen im vorteilhafter Art und Weise zu gebrauchen ist. Es können insbesondere darmatische Aktivitätssteigerungen erzielt werden, wenn die Expressionssysteme und/oder Sequenzen entsprechend optimiert werden. Durch die erfolgreiche getrennte Expression der Untereinheiten der Nitrilhydratase ist es darüber hinaus möglich neue Kombinationen von Untereinheiten verschiedener Nitrilhydratasen zu untersuchen, was die Diversifikation der Nitrilhydratasen und damit deren Eigenschaften steigern hilft. Dies war so aus dem Stand der Technik zum Zeitpunkt der Erfindung in naheliegender Weise nicht ableitbar.

Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen in >50 mol-% verstanden.

Unter dem Begriff Nukleinsäuresequenzen werden alle Arten von einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA als auch RNA oder Gemische derselben subsumiert.

Die Organismen 870-AN019, ENG-AN033 und 871-AN042 wurden bei der Deutsche Sammlung für Mikroorgansimen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 4, 38124 Braunschweig gemäß dem Budapester Vertrag durch die Anmelderin am 22.10.2002 hinterlegt.

Der organismus Rhodococcus rodochrous M8 ist in der All-Russian National Collection of Microorganisms unter der Nummer VKPM-S-926 hinterlegt. Die entsprechenden Sequenzen können der Gendatenbank (s.o.) entnommen werden.

Der terminus Expressionssystem wird erfindungsgemäß so verstanden, dass es sich dabei um biologisches Material auf Nukleinsäurebasis handelt, welches im Stande ist, in Organismen die Expression der ihm innewohnenden Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Nitrilhydratase-Unterheiten zu bewerkstelligen. Insbesondere sind dies Plasmide und Vektoren.

Im Rahmen der Erfindung werden die Ausdrücke Protein und Polypeptid synonym benutzt.

Beschreibung der Abbildungen:

1: Die Vektorkarte zeigt die allgemeine Anordnung der α- und β-Untereinheiten der Nitrilhydratase bzw. des Orf's p47K im Plasmid pUC18 in einem Expressionssystem mit einem Vektor.

2/3: Die Vektorkarten zeigen die Anordnung der α- und β-Untereinheiten der Nitrilhydratase bzw. des Orf's p47K aus R. erythropolis 870-AN019 in Plasmiden der pET-Reihe in einem Expressionssystem mit zwei Vektoren.

4/5: Die Vektorkarten zeigen die Anordnung der α- und β-Untereinheiten bzw. des Orf's p12K aus R. rhodochrous M8 in Plasmiden der pET-Reihe in einem Expressionssystem mit zwei Vektoren.

Experimenteller Teil:
Kultivierung von Mikroorganismen
Die Kultivierung der E. coli Zellen und deren Aufbewahrung erfolgte nach Sambrock et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
Zur Kultivierung der Rhodococcen wurde ein Chelatmineralmedium (CMM) nach Heald et al. 2001, (Heald S. C., P. F. B. Brandao, R. Hardicre and A. T. Bull, 2001: Physiology, biochemistry and taxonomy of deep-sea nitrile metabolising Rhodococcus strains. Antonie van Leeuwenhoek 80, 169-183) eingesetzt. Das CM-Medium wird mit 5 g/l Glucose supplementiert. Für Stämme mit cobaltabhängigen Enzymen wird 2, 4 mg/l CoCl₂·6 H₂O, für Stämme mit eisenabhängigen Enzymen 50 mg/l FeSO₄·7 H₂O eingesetzt.
Die aus der Kultur entnommene Probe wurden mit entsprechend der Kultivierung eingesetztem Kaliumphosphatpuffer (6 ml/l einer 200 g/l K₂HPO₄-Lösung und 4 ml/l einer 157,5 g/l KH₂PO₄-Lösung) so verdünnt, dass der Meßbereich zwischen 0,05 und 0,3 lag. Als Referenz diente der Puffer. Gemessen wurde bei 600 nm.
PCR
Zur Amplifikation von DNA-Fragmenten aus Rhodococcen wurden pro 50 μl Ansatz folgende Komponenten zusammenpipettiert:

100 ng Chromosomale DNA

1 μl dNTP -Mix (alle 10 mM)

5 μl Puffer

2 μl DMSO

0,5 μl Herculase (2,5 U)

ad 50 μl H₂O
Der Thermocycler wurde folgendermaßen programmiert:

A. 3 min 98°C
B. 40 sec 98°C
C. 40 sec X°C
D. Y min 72°C
E. 5 min 72°C
F. 4°C

Die Schritte B, C, D wurden 30 mal wiederholt. Die Annealingtemperatur X (C)errechnet sich aus der Schmelztemperatur der verwendeten Primer und die Inkubationsdauer Y (D) aus der Länge des zu amplifizierenden Genes (1 kb DNA gleich 1 Minute-Regel).
Verdau mit Restriktionsenzymen
Die zu schneidende DNA wird mit 5 U Restriktionsenzym und den zugehörigen Puffer versehen und wenn nicht anders erforderlich bei 37°C inkubiert. Der Verdau chromosomaler DNA erfolgt mit 10 U Enzym. Die Inkubationsdauer beträgt 1,5 – 2,5 Stunden.
Behandlung mit alkalischer Phosphatase
Um zu verhindern, dass Vektoren, welche nur mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten wurden, mit sich selbst religieren, wird mit Hilfe der alkalischen Phosphatase der am 5'-Ende überhängende Phosphatrest entfernt. Nur durch Insertion eines DNA-Fragments kann wieder zirkuläre DNA entstehen.
Der mit einer Restriktionsendonuklease geschnittene Vektor wird 15 min bei 65°C inkubiert, um die Restriktionsendonuklease abzustoppen. Anschließend wird der Dephosphorylierungspuffer zugegeben und mit 1 U alkalischer Phosphatase aus Schrimps wird 10 min bei 37°C inkubiert. Das Enzym wird durch eine anschließende Gelelektrophorese von der Vektor-DNA abgetrennt.
Behandlung mit T4-DNA-Ligase
Für die Ligation werden Vektor und Insert im Verhältnis 1:3 eingesetzt. Das Volumen wird möglichst gering gewählt (7-20 μl) Der Ansatz wird in Ligationspuffer und in Anwesenheit von 1 U Ligase bei 16 °C über Nacht inkubiert.
Transformation
Zum Ligationsansatz werden 100 μl kompetente Zellen pipettiert und der Ansatz durch wiederholtes Aufziehen der Pipette gemischt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wird ein Hitzeschockschritt bei 42 °C für 45 sec durchgeführt und wieder 2 min auf Eis inkubiert. Es werden 120-900 μl SOC-Medium zugegeben und der Ansatz wird 45 min bei 37°C unter Agitation inkubiert. Anschließend wird der Ansatz ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert.
Expression der verschiedenen Nitrilhydratasen (Tabelle 1) im Ein-Vektor-Expressionssystem
Folgendes Protokoll wurde zur Expression verwendet: 50 ml LB_amp100-Medium mit 2 mM Fe-Citrat wurde 1%ig mit einer Übernachtkultur angeimpft. Nach Erreichen einer OD₆₀₀ von ca. 0,5 wurde mit 1 mM IPTG (Isopropylthiogalactosid) die Expression der Nitrilhydratasen in den verschiedenen E. colis induziert. Die Ernte der Zellen erfolgte ca. 24 Stunden nach Induktion. Die Expression der Nitrilhydratasen in Stamm DH5α erfolgte konstitutiv, da dieser Stamm den lac-Repressor nicht überexprimiert. Dadurch entfällt hier der Induktionsschritt mit IPTG.
Aktivitätsnachweis mit Benzonitril als Substrat:
Die Biotransformation wurde im 10 ml Maßstab durchgeführt mit ca. 100 mg Biofeuchtmasse (OD₆₀₀ = 5) im Kaliumphosphatpuffer (100 mM) pH 7,0. Die Inkubation erfolgte bei 30°C und die Substratkonzentration betrug ca. 5 mM Benzonitril. Die Probennahme erfolgte alle 5 – 10 min über einen Zeitraum von maximal 1 Stunde. Das Probenvolumen betrug 100 μl und die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl 50%ige Phosphorsäure gestoppt.

Die Konzentrationen von Benzonitril und Benzamid wurden dann mittels HPLC bestimmt:

Säule:	RP18-Säule Phenomenex Hypersil ODS 5μ (mit Vorsäule)
Fließmittel:	10 mM K2HPO4, (pH 2.3)
Flußrate:	1 ml/min
Wellenlänge:	202 nm
Injektionsvolumen:	20 μl
Dauer HPLC Lauf:	12-15 min

Die Berechnung der Aktivität erfolgte über die Kalkulation von einem μmol Umsatz nach einer Minute, was einem U (Unit entspricht). Spezifische Aktivitäten werden in U pro g BTM oder mg Protein angegeben.
Expression der Nitrilhydratase aus R. erythropolis 870-AN019 im Zwei-Vektor-Expressionssystem
Die Expression der Konstrukte mit T7 Promotoren erfolgte nach folgendem Protokoll:
50 ml LB_amp100-Medium mit 2 mM Fe-Citrat und jeweils 50 μg/ml Kanamycin & Ampicillin wurde 1%ig mit einer Übernachtkultur angeimpft. Nach Erreichen einer OD₆₀₀ von ca. 0,5 wurde mit 1 mM IPTG (Isopropylthiogalactosid) die Expression der Nitrilhydratasen induziert. Die Ernte der Zellen erfolgte ca. 24 Stunden nach Induktion bei 26°C.
Expression der Nitrilhydratase aus R. rhodochrous M8 im Zwei-Vektor-Expressionssystem
Die Expression der Konstrukte mit T7-Promotoren erfolgte nach folgendem Protokoll: 50 ml LB_amp100-Medium mit 0,5 mM CoCl₂ und jeweils 50 μg/ml Kanamycin & Ampicillin wurde 1%ig mit einer Übernachtkultur angeimpft. Nach Erreichen einer OD₆₀₀ von ca. 0,5 wurde mit 1 mM IPTG (Isopropylthiogalactosid) die Expression der NHasen induziert. Das Medium wurde zusätzlich mit 3% (w/v) Ethanol versetzt. Die Ernte der Zellen erfolgte ca. 24 Stunden nach Induktion bei 26°C.
Aktivitätsbestimmung
Die Biotransformation zur Aktivitätsbestimmung mit den rekombinanten Nitrilhydratasen R. rhodochrous M8 und R. erythropolis 870-AN019 in E. coli erfolgte in kleinem Maßstab. Die Biotransformation wird in einem 1,5 ml Eppendorfcup bei 20°C durchgeführt. Im Biotransformationsansatz wurde eine OD von 0,4 eingesetzt. 500 μl einer 4 % Acrylnitril-Lösung in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 sowie der Puffer werden bei 20 °C vorinkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe der Zellen gestartet. Dabei beträgt die Summe des Puffer- und Zellvolumens 500 μl. Sofort nach Mischung des Ansatzes werden 100 μl entnommen und zu 1,5 μl vorgelegter konzentrierter HCl pipettiert. Nach Mischung wird die Probe 2 min bei 13000 rpm in der Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert und 70 μl des Überstands zur Analyse mittels HPLC aufbewahrt bei –20°C. Die Probennahme erfolgte alle 5 – 10 min über einen Zeitraum von maximal 2 Stunden.

Analyse von Acrylnitril, Acrylamid und Acrylsäure Mit der nachfolgend beschriebenen HPLC Methode ist es möglich Acrylnitril, Acrylamid und Acrylsäure in kurzer Zeit zu analysieren und die Konzentartion dieser Substanzen zu bestimmen:

Säule:	Synergi 4μ Hydro-RP mit Vorsäule
Fließmittel:	0,1 % H₃PO₄ in 10 % Acetonitril, 90 % H₂O
Flußrate:	0,5 ml/min
Wellenlänge:	202 nm
Injektionsvolumen:	5 μl
Dauer HPLC Lauf:	10 min, letzter Peak nach 5,5 min

Die Berechnung der Aktivität erfolgte über die Kalkulation von einem μmol Umsatz nach einer Minute, was einem U (Unit entspricht). Spezifische Aktivitäten werden in U pro g BTM oder mg Protein angegeben.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Expressionssystem für die gleichzeitige Expression der Nukleinsäuresequenzen kodierend für die verschiedenen Untereinheiten einer Nitrilhydratase, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressionssystem mindestens je ein Plasmid mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz kodierend für die jeweilige Untereinheit aufweist.
Expressionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieses in E. coli als Wirt vorliegt.
Expressionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten unter der Kontrolle von jeweils dem gleichen Promotor steht.
Expressionssystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein T7-Promotor ist.
Expressionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass pro eingesetztem Plasmidsatz mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend für das p47K- oder p12K-Protein vorhanden ist.
Expressionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten der Nitrilhydratasen aus Rhodococcus-Stämmen stammen.
Expressionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Nukleinsäuresequenzen kodierend für die Untereinheiten der Nitrilhydratasen entsprechend der „codon usage" von E. coli modifiziert einsetzt.
Expressionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als Plasmide solche der pET-Reihe benutzt.
Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratasen unter Verwendung eines Expressionssystems gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8.
Wirtsorganismus aufweisend ein Expressionssystem gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8.
Verfahren zur Herstellung von, ggf. enantiomerenangereicherten, (Amino-)Carbonsäuren oder (Amino-)Carbonsäureäureamiden unter Verwendung eines Wirtsorganismus gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8.