DE19920712A1 - Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Proteines - Google Patents
Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten ProteinesInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Proteinen , insbesondere rekombinaten sekretorischen Proteinen, auf ein Verfahren zum Identifizieren von Nukleinsäuremolekülen, deren Expressionsprodukte eine verbesserte Sezernierung eines rekombinaten sekretorischen Proteins ermöglichen, auf die Verwendung von auf diese Weise identifizierten Molekülen zur Verstärkung der Sekretion von heterologen Proteinen sowie auf entsprechende Kit-Systeme. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Verfahren sieht die Expression einer für ein sekretorisches Protein kodierenden Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle zusammen mit einer für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität des eukaryontischen Translations-Initiationsfaktors 4 E und/oder einer für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodierenden Nukleinsäure vor. Es wurde festgestellt, daß die Coexpression des Translations-Initiationsfaktorgenes und/oder des CaM-Kinasegenes zu einer verbesserten Sezernierung eines gewünschten rekombinanten Proteins auf der Zelle führt.
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Herstellen von rekombinanten
Proteinen, insbesondere rekombinanten sekretorischen Proteinen, auf ein Verfahren
zum Identifizieren von Nukleinsäuremolekülen, deren Expressionsprodukte eine verbes
serte Sezernierung eines rekombinanten sekretorischen Proteins ermöglichen, auf die
Verwendung von auf diese Weise identifizierten Molekülen zur Verstärkung der Sekreti
on von heterologen Proteinen sowie auf entsprechende Kit-Systeme.
Heutzutage wird eine Vielzahl von in Medikamenten enthaltenen aktiven Verbindungen
nicht mehr durch chemische Synthese oder Gewinnung und Aufreinigung aus den natür
lichen pflanzlichen oder tierischen Quellen hergestellt, sondern mit Hilfe rekombinanter
DNA-Technologie erzeugt. Diese Technologie bietet u. a. den Vorteil, daß die Proteine in
gut charakterisierten Wirten in praktisch unbegrenzten Mengen erhalten werden können.
Für die Gewinnung von rekombinanten Proteinen ist es von Vorteil, wenn das betreffen
de Protein sezerniert wird, um anschließend aus dem Zellüberstand gewonnen werden
zu können. Dies vereinfacht die Aufbereitung in hohem Maße, da das Protein bereits in
relativ reiner Form vorliegt und die Anzahl aufwendiger Reinigungsschritte reduziert wer
den kann.
Häufig benutzte Organismen, die zur Gewinnung von sekretorischen Proteinen in gro
ßem Maßstab eingesetzt werden, sind Hefen und filamentöse Pilze. Sie bieten den Vor
teil, daß sie relativ einfach in Zellkultur gehalten werden können und zu guten Ausbeuten
an sezernierten Proteinen führen. Darüber hinaus sind sie in der Lage, die produzierten
Proteine posttranslational zu modifizieren, z. B. zu glykosylieren.
Die Expression von rekombinanten DNA-Sequenzen wird im allgemeinen dadurch er
reicht, daß Nukleinsäuresequenzen, die ein Protein von Interesse kodieren, in einen
Vektor kloniert werden, der als funktionelle Elemente einen Promotor und Polyadenylie
rungssignale sowie Terminationselemente enthält. Dieser Vektor wird durch geeignete
Verfahren, wie z. B. Elektroporation, Calcium- oder Liposomen-unterstützte Transfektion
etc. in eine Wirtszelle inseriert. Eine solche DNA-Sequenz kann weiterhin am 5'-Ende ei
ne Sekretions-Leader-Sequenz enthalten, die veranlaßt, daß das rekombinante Transla
tionsprodukt in den sekretorischen Apparat der Wirtszelle dirigiert wird.
Die Insertion von Fremd-DNA in ein solches Expressionssystem garantiert jedoch nicht
eine wirksame Gen-Expression. Häufig auftretende Probleme sind eine ineffiziente
Transkription und/oder Translation, rascher Abbau der Boten-RNA (mRNA) oder Insta
bilität des Protein-Produktes. Das rekombinante Protein kann außerdem inkorrekt
und/oder ungenügend durch die Wirtszelle prozessiert und modifiziert werden. So wer
den z. B. in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae rekombinante Proteine oft sehr
ineffizient sezerniert. Dieses Expressionssystem ist daher für viele Anwendungen unzu
länglich. In solchen Fällen kann die Produktion jedoch unter Umständen durch die
gleichzeitige Erzeugung weiterer Proteine, die eine effiziente Transkription und/oder
Translation, Prozessierung, Stabilisierung, Modifikation und Verteilung in bestimmten
Zellkompartimenten erlauben, verbessert werden. So wurden eine Reihe an S. cerevi
siae-Mutanten hergestellt, die mögliche Engpässe in den von der Translation bis zur Se
zernierung eines rekombinanten Proteins reichenden Prozessen ausräumen können.
Derartige Mutationen sind von Smith et al. z. B. für die Gene ssc1 und ssc2 aus S. cere
visiae und für die Gene rgr1 und ose1 von Sakai et al. 1988, Hinnen et al., 1994 und von
Gellissen und Hollenberg, 1997, beschrieben worden. Ein anderer Ansatz verwendet die
Überexpression von heterologen Genen, die aus anderen Organismen eingeführt wer
den, wie z. B. die Überproduktion der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) oder des Cha
perons BiP oder die Verwendung von Komponenten des Säugersignalpeptidasekomple
xes in Bäckerhefe (Shusta et al. 1998; WO 98/13473).
Es ist bereits bekannt, daß methylotrophe Hefen, d. h. Hefen, die in der Lage sind,
Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen, rekombinante Proteine
weniger stark hyperglykosylieren als S. cerevisiae. Des weiteren bieten methylotrophe
Hefen den Vorteil, daß sie heterologe Proteine relativ effizient sezernieren. Das gleiche
gilt auch z. B. für Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger und Schizosaccharomyces
pombe (Giga-Hama und Kumagai, 1997; Gellissen und Hollenberg, 1997; Hollenberg
und Gellissen, 1997). Selbst die Verwendung von methylotrophen Hefen als Expressi
onswirten läßt jedoch die Produktion und Sezernierung nur einer begrenzten Anzahl von
rekombinanten Proteinen zu. Es besteht daher ein großer Bedarf nach einem System,
das die Möglichkeit bietet, jedes sekretorische Protein von Interesse effizient zu sezer
nieren. Darüber hinaus werden Verfahren benötigt, die es zulassen, rekombinante Pro
teine mit weitgehend korrekten sekundären Modifikationen, d. h. Modifikationen, wie sie
auch nach Produktion des Proteins in seiner natürlichen Wirtszelle beobachtet werden,
zu erzeugen.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Weg für die effiziente Sezernie
rung von rekombinanten Proteinen und gegebenenfalls für die Produktion und/oder Se
zernierung von rekombinanten Proteinen mit sekundären Modifikationen zur Verfügung
zu stellen, welche den im natürlichen Wirt erzeugten sekundären Modifikationen weitge
hend ähnlich sind.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Herstellen eines rekom
binanten sekretorischen Proteins gelöst, welches die folgenden Schritte umfaßt:
- a) Expression einer für das sekretorische Protein kodierenden Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle zusammen mit einer für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor 4E (eIF4E) und/oder für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Ca2+/Calmodulin-abhängigen Pro teinkinase (CaM-Kinase) kodierenden Nukleinsäure, wobei die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E oder CaM-Kinase kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors P1 steht;
- b) Sezernieren des Proteins aus der Zelle und
- c) Gewinnen des sezernierten Proteins.
Der eukaryontische Initiationsfaktor 4E (eIF4E) spielt für die Initiation der Translation eine
wichtige Rolle. Er ist Bestandteil des "Cap-Binding"-Komplexes (eIF4F) und ist für die
Bindung dieses Komplexes und die 5-Cap-Struktur der mRNA (Sonenberg, 1996) ver
antwortlich. Eukaryontische Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinasen (CaM-Kinasen)
vom Typ II phosphorylieren einer Reihe verschiedener Zielproteine und sind dadurch an
der Regulation des Energiestoffwechsels, des Zellzyklus und der Ionenpermeabilität etc.
beteiligt (Schulman, 1993).
Der Begriff "biologische Aktivität" des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 4E
und der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase bezieht sich dabei auf die in der Li
teratur beschriebenen Aktivitäten der genannten Enzyme. Die biologische Aktivität von
eIF4E wird dabei bestimmt, wie in Altmann & Trachsel (1989) beschrieben, die von CaM-
Kinase, wie in Ohya et al. (1991) beschrieben.
Der Promotor P1 kann jeder beliebige Promotor sein, der in der gewählten Wirtszelle als
Promotor funktioniert. Beispiele solcher Promotoren finden sich im Stand der Technik
reichlich (s. z. B. Sambrook et al., 1989).
Das Verfahren gestattet es, durch die Coexpression der Gene für den Translationsinitia
tionsfaktor 4E und/oder die Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase bzw. Derivaten
davon zusammen mit der Expression eines Genes für ein Protein von Interesse eine ef
fiziente Produktion und Sezernierung des betreffenden Proteins zu erzielen.
Es wurde beobachtet, daß durch die starke Überproduktion eines rekombinanten
Proteins oft die Transkriptions/Translations- und Sezernierungsmaschinerie der Wirtszel
le überlastet ist, so daß sie ihr Wachstum verlangsamt oder gar einstellt. Ein häufiger
Engpaß besteht bei der Initiation der Translation, bei der, wie von den Erfindern festge
stellt, der ATP-abhängige Initiationsfaktor 4E limitierend wirken kann. Durch Coexpressi
on des Genes für diesen Translationsinitiationsfaktor mit einer rekombinanten DNA-
Sequenz kann dieser Engpaß behoben werden. Überraschenderweise wirkt sich die
Coproduktion des Translationsinitiationsfaktors 4E jedoch auch auf die Sekretionseffizi
enz aus: die Erfinder konnten eine stark erhöhte Sezernierung des erwünschten sekre
torischen Proteins beobachten, sobald dieses mit 4E coproduziert wurde. In der vorlie
genden Erfindung wird darüber hinaus zum ersten Mal gezeigt, daß auch die gemeinsa
me Produktion (Pausch et al., 1991; Ohya et al., 1991) von CaM-Kinase mit einem re
kombinanten Protein zu einer effizienten Sezernierung des entsprechenden rekombinan
ten Proteins führt. Der Wirkmechanismus, der zu einer gesteigerten Proteinsezernierung
führt, ist jedoch in beiden Fällen noch ungeklärt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit, auch im Fall stark überproduzierter
Proteine diese wirksam so sezernieren, so daß auch für sekretorische Proteine extrem
hohe Ausbeuten erzielt werden können. Die Produktion kann dabei durch einzelne oder
eine Kombination mehrerer Maßnahmen gesteigert worden sein. So kann bereits durch
die Wahl des Vektors die Kopienzahl pro Zelle beeinflußt werden. Vektoren auf 2 µ-Basis
liegen mit 5 bis über 100 Kopien pro Zelle vor; meistens sind pro Hefezelle 20 bis 40
Kopien vorhanden. Integrative Vektoren können sogar in 80 bis 150 Kopien pro Zelle
vorhanden sein.
Weiter kann durch die Wahl des Selektionssystems Einfluß auf die Kopienzahl des
Vektors genommen werden. Die Verwendung Tryptophan-auxotropher Mutanten, deren
Auxotrophie durch den Selektionsmarker TRP1 auf dem Plasmid komplementiert wird,
führt zur Amplifizierung des Plasmides in der auxotrophen Zelle. Eine Möglichkeit, die
Kopienzahl darüber hinaus zu steigern, bietet die Verwendung von LEU2-auxotrophen
Stämmen und deren Komplementierung mit dem Leu2d-Allel. Das Leu2d-Allel ist ein
LEU2-Gen mit weitgehend deletiertem Promotor und dementsprechend schwacher
Transkription. Der dringende Bedarf der Zelle an LEU2-Protein führt zu einer extremen
Amplifizierung des Plasmides einschließlich eines evtl. darauf lokalisierten Strukturgenes
für ein gewünschtes rekombinantes Protein.
Ein zusätzlicher Faktor, der die Effizienz des Produktionssystemes bestimmt, ist die Stär
ke des jeweils dem Strukturgen für das gewünschte zu exprimierende Gen vorangestell
ten Promotors P2. Dem Fachmann sind unterschiedlich starke, induzierbare und nicht
induzierbare Promotoren bekannt. Siehe dazu das schon erwähnte Handbuch von Sam
brook et al., in dem eine Vielzahl von Promotoren beschrieben ist. Für die Produktion in
Hefe ist es bevorzugt, den GAL1-Promotor oder den PDC1-Promotor zu verwenden.
Die so hergestellten Proteine können leicht aus dem Zellüberstand gewonnen werden,
indem dieser durch Zentrifugation von Zellrückständen befreit wird und durch geeignete
Reinigungsverfahren, wie z. B. durch Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschroma
tographie, Gel-Elektrophorese, etc. weiter aufbereitet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens ist die Nu
kleinsäure, die für das Polypeptid mit der biologischen Aktivität des Translationsinitiati
onsfaktors 4E kodiert, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
- a) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert,
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann.
Dabei sind unter einem "Homolog" solche Proteine zu verstehen, die eine Homologie
von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz des Translationsinitiationsfaktors 4E
aus Saccharomyces cerevisiae (Brenner et al., 1988) besitzen. In bevorzugten Ausfüh
rungsformen beträgt die Homologie 70% oder 80%, besonders bevorzugt sind 90% oder
95%. Am stärksten bevorzugt ist eine Homologie von 98% oder 99%. Die Homologie
wird dabei berechnet, wie in Pearson und Lipman, 1988, dargestellt.
Des weiteren wird die Aufgabe der Erfindung durch ein Verfahren zum Herstellen eines
rekombinanten Proteins gelöst, welches die folgenden Schritte umfaßt:
- a) Exprimieren einer für das rekombinante Protein kodierenden Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle zusammen mit einer für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase (CaM-Kinase) kodieren den Nukleinsäure, wobei die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von CaM-Kinase kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors P1 steht;
- b) Gewinnen des Proteins.
Durch die Coexpression des Genes für ein rekombinantes Protein zusammen mit dem Gen für eine Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase wird das Protein von Interesse effizient produziert und kann entweder aus dem Zellüberstand (im Falle eines sezernierbaren Proteins) oder aus dem Zellumen (im Falle eines nicht se zernierbaren, intrazellulären Proteins) gewonnen werden. Neben der effizienten Produktion bietet die Coexpression des Genes für ein gewünschtes Protein mit dem Gen für CaM-Kinase den großen Vorteil, daß die aus vielen Wirtszellen be kannte Hyperglykosylierung eines rekombinanten Proteins reduziert wird, d. h. das Glykosylierungsmuster des rekombinanten Proteins von Interesse ist dem Glykosy lierungsmuster in seinem natürlichen Wirt wesentlich ähnlicher als z. B. dem Glyko sylierungsmuster nach Produktion in S. cerevisiae ohne die Anwesenheit der über produzierten CaM-Kinase.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Nukleinsäure, die für ein
Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert, ausgewählt aus der
folgenden Gruppe:
- a) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu der in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren kom plementären Sequenz hybridisieren kann.
Geeignete Wirtszellen, in denen die rekombinanten Proteine der oben beschriebenen
Verfahren produziert werden können, sind Pflanzenzellen, Tierzellen, Hefezellen, Pilzzel
len oder Schleimpilzzellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Tierzellen Säuger- oder Insektenzellen.
Als Hefezellen sind Zellen der Gattungen Saccharomvces, Schizosaccharomyces,
Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Schwanniomyces, Candida und Yarrowia wie z. B.
Pichia pastoris, Pichia pinus, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha und Candida
boidinii bevorzugt. Die erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugten Pilzzellen gehören den
Gattungen Aspergillus, z. B. Aspergillus niger, Neurospora, Rhizopus und Trichoderma
an. Eine als Expressionswirt besonders bevorzugte Schleimpilzzelle ist eine Zelle der
Gattung Dictyostelium.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung findet die
Expression der Gene für das Polypeptid und das Protein mit der biologischen Aktivität
von eIF4E und/oder CaM-Kinase unter der Kontrolle eines Promotors P1, der ein starker
Promotor ist, statt.
Dabei ist besonders bevorzugt, daß der Promotor P1 induzierbar ist. Ein Beispiel für ei
nen solchen Promotor ist der GAL1-Promotor (Johnston & Davis, 1984), der durch die
beiden Zucker Glukose und Galaktose reguliert werden kann. Wenn das Medium, in
oder auf dem die Wirtszellen wachsen, Glukose enthält, wird die Promotor-Aktivität von
Genen, die unter der Kontrolle des GAL1-Promotors stehen, induziert, so daß relativ viel
mRNA als Transkriptionsprodukt entsteht. In der Anwesenheit von Galaktose im Medium
hingegen ist die Promotor-Aktivität nur sehr gering, was bedeutet, daß nur relativ wenige
mRNA-Moleküle hergestellt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das sekretorische Protein das
Enzym Phytase. Phytase ist ein pflanzliches Enzym, das Myo-Inosit aus Phytinsäure ab
spaltet. Myo-Inosit wird aufgrund seiner lipotrophen Wirkung medizinisch in der Leber
therapie eingesetzt. Wenn Phytase dem Futter von monogastrischen Tieren (z. B. Geflü
gel und Schweinen) zugesetzt wird, ermöglicht es den Tieren, Phosphat effektiv aus der
Nahrung aufzunehmen und reduziert gleichzeitig die Menge an ausgeschiedenem
Phosphat. Dies bedeutet, daß bei Phosphat-armen Diäten dem Futter weniger oder gar
kein Phosphat künstlich zugesetzt werden muß und daß der anfallende Tiermist auf
grund des reduzierten Phosphatgehalts weniger umweltschädlich ist.
In weiteren Ausführungsformen werden amylolytische Enzyme, z. B. α-Amylase oder
Glukoamylase, oder Hormone erzeugt. In bevorzugten Ausführungsformen wird das re
kombinante Protein überproduziert. Wie bereits oben beschrieben, kann die Produktion
durch mehrere Faktoren, wie verwendeter Vektor, Selektionssystem und Promotor, be
einflußt werden. Erfindungsgemäß ist bevorzugt, die Produktion unter die Kontrolle star
ker und/oder induzierbarer Promotoren zu stellen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens einer
Nukleinsäure zum Steigern der Sekretion eines rekombinanten sekretorischen Proteins
aus einer Wirtszelle, wobei diese Nukleinsäure ausgewählt ist aus der folgenden Grup
pe:
- a) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäurese quenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann;
- f) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- g) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert;
- h) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- i) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- j) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann.
Die Coexpression einer der oben aufgeführten Nukleinsäuren mit der für ein gewünsch
tes Protein kodierenden Nukleinsäure ermöglicht die effiziente Sezernierung des ge
wünschten Proteins.
Rekombinante Proteine, die aus Wirtsorganismen sezerniert werden, welche eine oder
mehrere der oben genannten Nukleinsäuren beinhalten, bieten den Vorteil, daß das ge
wünschte Protein effizienter sezerniert wird und damit einfacher aufgereinigt werden
kann. Dadurch sinken die Produktionskosten. So gewonnene Proteine können z. B. als
Medikamente, Nahrungsmittelzusätze oder in der Kosmetikindustrie verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die oben erwähnten Nukleinsäuren (i) bis
(x) in einen Vektor integriert vor. Dabei sollte der Vektor neben einem Promotor P1, der
funktionell mit der betreffenden Nukleinsäure verbunden ist, Polyadenylierungs- und
Translationsterminationssignale enthalten.
Neben den obengenannten Verfahren stellt die vorliegende Erfindung weiterhin ein Ver
fahren zum Identifizieren eines Nukleinsäuremoleküls zur Verfügung, das für ein Protein
kodiert, welches eine verbesserte Sezernierung eines rekombinanten sekretorischen
Proteins aus einer eukaryontischen Zelle ermöglicht und die folgenden Schritte umfaßt:
- a) Bereitstellen von rekombinanten Wirtszellen, die eine für ein sekretorisches Marker protein kodierende Nukleinsäure in funktioneller Verbindung mit einem Promotor P3 enthalten, wobei das Wachstum der Wirtszellen bei gegebener Produktion des se kretorischen Markerproteins inhibiert ist, und die weiter einen Expressionsvektor enthalten, in dem DNA-Fragmente aus einem beliebigen Organismus unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors P1 stehen;
- b) Wachsenlassen der rekombinanten Wirtszellen unter Bedingungen, die die Selekti on auf die Anwesenheit des Expressionsvektors erlauben;
- c) Selektion von Wachstums-dereprimierten Kolonien;
- d) Analyse der in dem Expressionsvektor enthaltenen DNA aus dem beliebigen Orga nismus aus den Wachstums-dereprimierten Kolonien;
- e) Identifizieren der Nukleinsäuresequenzen, die nach Expression in der rekombinan ten Wirtszelle eine Derepression der Wachstums-Inhibition ermöglichen.
Der Promotor P3 ist dabei jeder beliebige Promotor, der die Expression des Genes für
das sekretorische Markerprotein in der gegebenen Wirtszelle ermöglicht. Die Wahl eines
starken Promotors kann dabei vorteilhaft sein.
Das erfindungsgemäße Screening-Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß durch ex
treme Überexpression einer geeigneten Nukleinsäure, die für ein sezerniertes Protein
kodiert, der für die Sezernierung zuständige Zellapparat überlastet wird. Als Folge des
sen "verstopfen" das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat durch rekom
binantes Protein und die Zelle stellt Wachstum und Proteinsezernierung ein. Wird in ei
ner solchen Zelle nun ein weiteres rekombinantes Protein hergestellt, welches den bei
der Sezernierung auftretenden Engpaß überwinden kann, beginnt die Zelle wieder zu
wachsen und sich zu teilen. Durch Austesten einer möglichst großen Anzahl an ver
schiedenen rekombinanten Proteinen können mit dem hier erstmals beschriebenen Ver
fahren Proteine bzw. für diese Proteine kodierende Nukleinsäuresequenzen identifiziert
werden, die einen Zellwachstumsstop verhindern bzw. wieder rückgängig machen kön
nen.
Die Wirtszellen des oben genannten Verfahrens können Pflanzenzellen, Tierzellen, He
fezellen, Pilzzellen oder Schleimpilzzellen sein. Dabei sind Säuger- und Insektenzellen
bevorzugte Tierzeilen, und Zellen der Gattungen Saccharomyces, Schizosaccharomy
ces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Schwanniomyces, Candida und Yarrowia, be
vorzugte Hefezellen. Besonders bevorzugte Hefezellen sind Hefezellen der Gattung
Hansenula polymorpha. Erfindungsgemäß bevorzugte Pilzzellen sind Zellen der Gattun
gen Aspergillus, z. B. Aspergillus niger. Neurospora, Rhizopus und Trichoderma. Des
weiteren ist zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens eine Zelle der Gattung
Dictyostelium als besonders bevorzugte Schleimpilzzelle mit umfaßt.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist der die Produktion des Markerproteins
kontrollierende Promotor ein induzierbarer Promotor, bevorzugt ein starker Promotor. Ein
Beispiel eines induzierbaren Promotors ist der PDC1-Promotor. Es empfiehlt sich, die
rekombinanten Wirtszellen in Schritt b) des Verfahrens unter induzierten Bedingungen
wachsen zu lassen, d. h. bei der Verwendung eines Expressions-Vektors mit PDC1-
Promotor werden die Wirtszellen in einem Glukose-haltigen Medium in Abwesenheit von
Galaktose herangezogen.
In einer weiteren Ausführungsform liegt die für ein sekretorisches Markerprotein
kodierende Nukleinsäure auf einem Plasmid mit hoher Kopienzahl pro Wirtszelle vor.
Dies kann z. B. durch die Anwesenheit des LEU2d-Gens erzielt werden.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß die in Schritt a) des oben erwähnten Verfahrens
verwendeten DNA-Fragmente aus einer cDNA-Genbank stammen. Besonders bevor
zugt ist dabei eine cDNA-Genbank aus S. cerevisiae, z. B. die von Liu et al. (1992) be
schriebene Genbank, die in dem Basisvektor pRS316 (CEN/ARS-Plasmid) (Sikorski und
Hieter, 1989) errichtet wurde.
In einer weiteren Ausführungsform können die im Schritt a) verwendeten DNA-
Fragmente auch aus einer genomischen Genbank stammen, z. B. eine Genbank des S.
cerevisiae-Genoms.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Expressions-Vektor aus Schritt
a), in dem DNA-Fragmente aus einem beliebigen Organismus enthalten sind, der
CEN/ARS-Vektor pRS316 (Sikorski and Hieter, 1989).
Weiterhin besonders bevorzugt ist, daß das sekretorische Marker-Protein das Enzym
Glukoamylase (EC 3.2.1.3; Glukoamylase mit Debranching-Aktivität) ist (Dohmen, 1990).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die für Glukoamylase kodierende
Nukleinsäuresequenz in dem obengenannten Verfahren die GAM1-Sequenz aus S. oc
cidentalis.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung einer rekombinanten Wirts
zelle, die eine für ein sekretorisches Marker-Protein kodierende Nukleinsäure unter der
Kontrolle eines Promotors enthält, zum Identifizieren von Nukleinsäuresequenzen, wel
che nach Expression eine Derepression der Wachstums-Inhibition ermöglichen, wobei
das Wachstum der Wirtszelle bei gegebener Expression der Gene für das Marker-
Protein inhibiert ist.
Weiterhin ist eine Wirtszelle von der vorliegenden Erfindung umfaßt, die eine durch ein
rekombinantes Verfahren in die Zelle eingeschleuste Nukleinsäure in ihrem Chromosom
enthält, welche aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
- a) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) und iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann;
- f) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- g) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert;
- h) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- i) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- j) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann.
Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung einen Kit, der eine zur Sezernierung
von Proteinen geeignete Wirtszelle und einen Expressionsvektor enthält, wobei der
Expressionsvektor in funktioneller Verbindung mit einem Promotor eine Nuklein
säure umfaßt, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E ko
diert, und aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
- a) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33),
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann.
Der Expressionsvektor kann episomal innerhalb der Wirtszelle vorliegen oder als ge
trenntes Präparat zur Verfügung gestellt werden.
Durch die Verwendung dieses Kits soll dem Anwender ermöglicht werden, auf einfache
Weise ein Protein von Interesse effizient aus einer eukaryontischen Wirtszelle sezemie
ren zu lassen, um es schneller und in größeren Mengen als bisher möglich ernten zu
können.
Des weiteren umfaßt die Erfindung einen Kit, der eine zur Sezernierung und/oder Glyko
sylierung von Proteinen geeignete Wirtszelle und einen Expressionsvektor enthält, wo
bei der Expressionsvektor in funktioneller Verbindung mit einem Promotor eine Nuklein
säure umfaßt, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase ko
diert und aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
- a) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Frag ment mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann.
Dieser Kit bietet dem Anwender den Vorteil, daß er im Falle eines sezernierbaren Pro
teins neben einer effizienten Sezernierung dieses Proteins auch gleichzeitig eine Glyko
sylierung des rekombinanten Proteins erzielen kann, die dem Glykosylierungsmuster in
der natürlichen eukaryontischen Wirtszelle des Proteins stark ähnelt, d. h. eine häufig
auftretende Hyperglykosylierung vermieden bzw. reduziert wird.
Die Erfindung enthält weiterhin einen Kit, der eine zur Sezernierung und/oder Glykosylie
rung von Proteinen geeignete Wirtszelle sowie einen Expressionsvektor enthält, der in
funktioneller Verbindung mit dem entsprechenden Promotor Nukleinsäuren umfaßt, die
für Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase und eines eIF4E kodie
ren und aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
- a) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- e) einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäu ren komplementären Sequenz hybridisieren kann;
- f) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- g) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert
- h) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- i) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Pöly peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- j) ein Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsäuren kom plementären Sequenz hybridisieren kann.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält ein erfindungsge
mäßer Kit weiterhin einen leeren Expressionsvektor, der zum Hineinklonieren einer Nu
kleinsäure geeignet ist, welche ein rekombinantes und/oder rekombinantes sezernierba
res Protein kodiert. Diese Kit-Ausstattung soll die einfache Handhabung für einen An
wender ermöglichen, der eine bestimmte Nukleinsäure schnell und sicher in einem ge
eigneten Wirt exprimieren möchte, um eine effiziente Sezernierung und/oder reduzierte
Hyperglykosylierung des entsprechenden rekombinanten Proteins zu erzielen.
Des weiteren wird von der vorliegenden Erfindung ebenfalls ein Kit zur Verfügung ge
stellt, der eine wie oben erwähnte Wirtszelle enthält, welche die zur Steigerung der Se
zernierung notwendigen Sequenzen nicht auf einem Vektor, sondern in ihrem Genom
trägt, in Verbindung mit einem leeren Expressionsvektor, der zum Hineinklonieren einer
Nukleinsäure geeignet ist, welche ein rekombinantes und/oder rekombinantes sezernier
bares Protein kodiert. Dieser Kit erlaubt es, durch Transformation der ebenfalls vom Kit
zur Verfügung gestellten Wirtszelle mit dem Expressionsvektor die effektive Produktion
und gegebenenfalls Sezernierung eines Proteins von Interesse zu erzielen.
Die folgenden Abbildungen und Beispiele sollen dazu dienen, die verschiedenen
Aspekte der vorliegenden Erfindung zu beschreiben und zu erläutern. Die Auswahl der
genutzten genetischen Komponenten und DNA-Sequenzen soll das Grundprinzip der
Erfindung veranschaulichen. In diesem Sinne werden die aufgeführten Beispiele nicht als
beschränkend aufgefaßt.
Abb. 1 zeigt eine Plasmidkarte des Plasmids pMF23. Das Plasmid ist ein E. coli/S.
cerevisiae Shuttle-Vektor. Es trägt die folgenden funktionellen Einheiten: einen Replikati
onsursprung (oriR) und das β-Lactamase-Gen (bla) zur Propagierung und Selektion in
E. coli und die gesamte 2 µ-DNA für die Propagierung in S. cerevisiae. Markersequenzen
für die Selektion in Hefe sind das TRP1-Gen und das LEU2d-Allel. Das Plasmid pMF23
enthält das von S. occidentalis stammende GAM1-Gen einschließlich des Terminators
unter der Kontrolle des aus S. cerevisiae stammenden PDCI-Promotors.
pMF25 ist wie pMF23 aufgebaut, enthält jedoch bei im wesentlichen gleicher kodierender
Sequenz ein C-terminales Hämagglutinin-Epitop aus einem Influenzavirus.
Abb. 2 zeigt die subzelluläre Lokalisation von Gam1p-Protein in verschiedenen
S. cerevisiae-Stämmen in Abhängigkeit von der Expressionsstärke. Das GAM1-Gen
wurde entweder von dem "single copy plasmid" pMF28 oder dem "multi copy plasmid"
pMF25 exprimiert. Das Plasmid pMF28 ist ein CEN-Vektor, der das URA3+-Gen als Se
lektionsmarker und die mit einer für das Hämagglutinin kodierenden Sequenz fusionierte
GAM1-Sequenz enthält. Die Zellen wurden in 100 ml Minimalmedium, ohne Uracil
(pMF28) oder ohne Tryptophan (pMF25), mit Galaktose oder Glukose (wie angegeben)
als einziger Kohlenstoffquelle herangezogen oder sie wurden für 30 Stunden in einem
Leucin-freien Minimalmedium in ihrem Wachstum arretiert. Zellfraktionen wurden durch
Zentrifugation mit einem linearen Saccharosegradienten (7-47%) aufgetrennt und auf ih
rem Gehalt an Gam1p-Protein durch SDS-PAGE und Western Blot unter Verwendung
von spezifischen Anti-Hämagglutinin-Antikörpern untersucht. Die subzellulären Kompar
timente wurden durch die Anwesenheit von spezifischen Marker-Proteinen identifiziert.
Als Marker-Proteine wurden Dolichol-Phosphat-Mannose-Syntase (Dpm1p - Endoplas
matisches Retikulum), Oligosaccharyltransferase (Och1p - früher Golgi), ATPase (Pmr1p
- medialer Golgi), Endoprotease (Kex2p - später Golgi) verwendet.
Abb. 3 zeigt die im Kulturüberstand und der Zellwandfraktion von S. cerevisiae-
Stämmen bestimmte Gam1p-Aktivität. Die Zellen wurden in 20 ml SG-Medium ohne
Tryptophan oder ohne Tryptophan und ohne Leucin, inokuliert. Supertransformanden, die
zusätzlich Plasmid mit der für CDC33 kodierenden DNA enthielten, wurden ohne Uracil
kultiviert. Die Zellen wurden bis zur stationären Phase wachsen gelassen, und dann die
Glukoamylase-Aktivität, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Die gemessenen Aktivi
täten sind Durchschnittswerte von mindestens drei unabhängigen Bestimmungen.
Abb. 4 zeigt die Bestimmung der Gam1p-Aktivität im Kulturüberstand und der Zell
wandfraktion von S. cerevisiae-Stämmen. Alle Bedingungen waren mit den in Abb.
3 beschrieben Bedingungen identisch. Als Vergleich wurde ein Stamm benutzt, der mit
dem für CMK2 kodierenden Plasmid supertransformiert war.
Abb. 5 zeigt das Ausmaß der Glykosylierung von Gam1p in GMK2- und CDC33-
überexprimierenden S. cerevisiae-Stämmen. Die Stämme wurden wie in Abb. 2 be
schrieben kultiviert und subzelluläre Fraktionen auf ihren Gehalt an Gam1p überprüft. In
CMK2-überexprimierenden Stämmen ist ein großer Anteil des Gam1p-Protein nicht hy
perglykosyliert.
Abb. 6 zeigt das Ausmaß der Glykosylierung von Phytase in CMK2-überexpri
mierenden Hansenula polymorpha-Stämmen. H. polymorpha Zellen, die Phytase her
stellten, wurden mit einem Plasmid supertransformiert, welche das von S. cerevisiae
stammende CMK2-Gen unter der Kontrolle des GAL1-Promotors aus S. cerevisiae ent
hielten. Der Phytase herstellende Stamm und repräsentative Beispiele der Supertrans
formanden wurden in Glycerin-Medium (5% Glycerin, 0,1 M PO4, pH 5,0) kultiviert. Das
sezernierte Phytase-Protein wurde mittels SDS-PAGE analysiert und mit dem sezernier
ten und durch Behandlung mit Endo H deglykosylierten Produkt verglichen. Die Abbil
dung zeigt Phytase-Protein, welches von dem ursprünglichen Phytase-
Produktionsstamm sezerniert wird, im Vergleich zu Phytase, die von einem supertrans
formierten Stamm hergestellt wurde, welcher zusätzlich ein GAL1-Promotor-CMK2-
Konstrukt trägt. In den Supertransformanden ist das Ausmaß an Hyperglykosylierung re
duziert, so daß distinkte Polypeptidbanden beobachtet werden können.
Die Spuren 2, 4, 6, 8, 10 entsprechen Phytaseproben, die mit Endo H behandelt wurden;
die Proben der Spuren 1, 3, 5, 7 und 9 wurden nicht vorbehandelt. Aufgetragen wurden
in den Spuren
1 bis 4: von supertransformierten Zellen sezernierte Phytase (zwei Kulturüberstände); in den Spuren
5 bis 10: vom ursprünglichen Produktionsstamm sezernierte Phytase (drei Kulturüber stände), und in der Spur
11: Molekulargewichtsstandard: die obere Bande entspricht 66,3 kDa, die untere Bande entspricht 55,4 kDa.
1 bis 4: von supertransformierten Zellen sezernierte Phytase (zwei Kulturüberstände); in den Spuren
5 bis 10: vom ursprünglichen Produktionsstamm sezernierte Phytase (drei Kulturüber stände), und in der Spur
11: Molekulargewichtsstandard: die obere Bande entspricht 66,3 kDa, die untere Bande entspricht 55,4 kDa.
Abb. 7 zeigt die Plasmid-Ausstattung einer Wirtszelle, die zur effizienten Sezernie
rung bzw. Reduktion der Hyperglykosylierung eines rekombinanten Proteins von Interes
se geeignet ist (A) und einer Wirtszelle, die zum Identifizieren von Nukleinsäuremolekü
len geeignet ist, welche eine Wachstumsinhibition des Wirtes dereprimieren können (B).
Im S. cerevisiae Stamm JD52 wurde durch homologe Rekombination mit einem funktio
nellen LEU2-Fragment der LEU2-ORF wieder hergestellt. Das funktionelle LEU2-
Fragment wurde als SalI-XhoI Fragment aus pUC/LEU#5 erhalten. Das wiederhergestell
te LEU2-Gen wurde anschließend im Bereich -407 bis +748 deletiert. Der resultierende
Stamm wurde anschließend nach der Methode von Erhart und Hollenberg (1983) von
der endogenen 2µ-DNA bereinigt, wodurch der Stamm MF9 entstand.
Saccharomyces cerevisiae-Medien:
Vollmedium YPD: 1% Hefeextrakt; 2% Pepton; 2% Glukose
Vollmedium YPGaI: 1% Hefeextrakt; 2% Pepton; 2% Galaktose
Minimalmedium SD: 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base w/o Aminosäuren; 2% Gluko se; 50 mM Citrat pH 4,5
Je nach Selektion wurden Histidin und Methionin je 0,01 g/l; Arginin 0,02 g/l,; Lysin
zusätzlich zugegeben und Tryptophan 0,04 g/l; Threonin; 0,05 g/l; Leucin, Iso leucin und Phenylalanin 0,06 g/l; Uracil 40 mg/l, Adenin 20 mg/l
Minimalmedium SG: wie SD, jedoch 2% Galaktose statt 2% Glukose
Vollmedium YPD: 1% Hefeextrakt; 2% Pepton; 2% Glukose
Vollmedium YPGaI: 1% Hefeextrakt; 2% Pepton; 2% Galaktose
Minimalmedium SD: 6,7 g/l Yeast Nitrogen Base w/o Aminosäuren; 2% Gluko se; 50 mM Citrat pH 4,5
Je nach Selektion wurden Histidin und Methionin je 0,01 g/l; Arginin 0,02 g/l,; Lysin
zusätzlich zugegeben und Tryptophan 0,04 g/l; Threonin; 0,05 g/l; Leucin, Iso leucin und Phenylalanin 0,06 g/l; Uracil 40 mg/l, Adenin 20 mg/l
Minimalmedium SG: wie SD, jedoch 2% Galaktose statt 2% Glukose
Feste Nährböden enthielten zusätzlich 1,8% Agar, gegebenenfalls wurde 0,5% lösliche
Stärke nach Zulkowsky (Merck) zugegeben. Die Anzucht der Hefen erfolgte bei 30°C,
wenn nicht anders vermerkt.
Escherichia coli-Medien:
LB-Medium: 1% Trypton; 0,5% Hefeextrakt; 1% NaCl
SOC-Medium: 2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt; 20 mM Glu kose, 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; pH 7,5
M9 Minimalmedium: Na2HPO4 × 7 H2O 12,8 g/l, KH2PO4 3 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4Cl 1 g/l
LB-Medium: 1% Trypton; 0,5% Hefeextrakt; 1% NaCl
SOC-Medium: 2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt; 20 mM Glu kose, 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; pH 7,5
M9 Minimalmedium: Na2HPO4 × 7 H2O 12,8 g/l, KH2PO4 3 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4Cl 1 g/l
Feste Nährböden enthielten zusätzlich 1,8% Agar. Zur Selektion plasmidhaltiger Zellen
wurde dem Medium 120 mg/l Ampicillin zugesetzt. Die Bakterien wurden bei einer Tem
peratur von 37°C kultiviert.
Aus den Plasmiden pJDaG-15 und pJDB219 wurde ein 2 µ Plasmidderivat, welches mit
pMF23 bezeichnet wurde, hergestellt (Dohmen, 1989; Beggs, 1981). Das resultierende
Plasmid ist in Abb. 1 dargestellt und enthält neben der gesamten 2 µ-DNA eine aus S.
occidentalis abstammende GAM9-Sequenz, welche an ein PDC9-Promotorelement fu
sioniert ist. Ferner enthält das Plasmid die Selektionsmarker TRP9 und das LEU2d. Bei
LEU2d handelt es sich um ein Allel des LEU2-Gens, bei dem der Großteil des Promotors
deletiert ist und das daher schwach exprimiert wird. Die Verwendung dieser beiden Se
lektionsmarker gestattet es, den Selektionsdruck zu variieren und die Kopienzahl der in
den S. cerevisiae-Stamm MF9 (trp1, leu2, cir°) eingeführten Plasmide zu beeinflussen.
Unter LEU2d Selektionsbedingungen wird eine extrem hohe Kopienzahl des eingeführ
ten Plasmids erhalten, während unter Selektionsbedingungen für TRP1 eine zwar hohe,
aber im Vergleich der LEU2d-Selektion geringere Kopienzahl erzielt wird. So enthalten
rekombinante Stämme, die nach Transformation mit dem oben beschriebenen Plasmid
erhalten wurden, unter LEU2d Selektionsbedingungen relativ viele Kopien des GAM1-
Gens, dessen Transkription durch den PDC1-Promotor reguliert wird. Wachstum auf
Glukose-haltigem Medium erzielt eine hohe PDC1-Promotor-Aktivität, während Wachs
tum auf Galaktose zu einer geringeren Aktivität führt. Transformanden, die unter LEU2d-
Selektionsbedingungen herangezogen wurden, sind weder in der Lage, auf Glukose
noch auf Galaktose-haltigem Medium zu wachsen. Ein Vergleich dieser Zellen mit
Transformanden aus Kontrolltransformationen, bei denen Plasmide verwendet werden,
die für enzymatisch inaktive Glukoamylase kodieren, zeigte, daß die unter LEU2d-
Selektionsbedingungen beobachtete Wachstumsinhibition dadurch verursacht wurde,
daß für das rekombinante Enzym ein zu hoher Sekretionsdruck bestand. Die Wachs
tumsinhibition wurde nicht durch die enzymatische Aktivität der Glukoamylase verur
sacht. Dies wurde durch die Beobachtung bestätigt, daß Gam1p-Produktion unter weni
ger stringenten Bedingungen zu einer Akkumulierung des Enzyms in dem Endoplasma
tischen Retikulum und dem cis-Golgi führte (Abb. 2).
Derartige Transformanden wurden benutzt, um sie mit den klonierten DNA-Sequenzen
der S. cerevisiae-cDNA Genbank zu retransformieren. Dazu wurde eine cDNA-Genbank
aus S. cerevisiae verwendet, die unter der Kontrolle des GAL1-Promotors in einen
CEN/ARS-Vektor kloniert wurde (Liu et al. 1992; Ausubel et al., 1987). Die S. cerevisiae-
Stämme wurden entweder auf nicht selektivem Medium (YPD) oder auf einem Minimal
medium wachsen gelassen. Stämme, die die Fähigkeit, die Glukoamylase unter den
oben beschriebenen stringenten Bedingungen zu sezernieren und dann zu wachsen,
wiedererlangt hatten, hatten DNA-Fragmente aufgenommen, welche dazu führten, daß
die beobachtete Wachstumsinhibition und damit die Limitierung der Sekretion überwun
den werden konnten. Plasmide aus solchen Transformanden, die eine Suppression der
Wachstumsinhibition des Gam1p-überproduzierenden Wirtsstammes zeigten, wurden
durch DNA-Sequenzierung analysiert.
Eine Analyse des unter erfindungsgemäßen Bedingungen erhaltenen Glukoamylase-
Proteins und sein Vergleich mit Standard-Isolaten, d. h. Isolaten, die unter Verwendung
gleicher Randbedingungen mit der Ausnahme erhalten wurden, daß statt der CMK2
und/oder CDC33 enthaltenden Vektoren entsprechende Leervektoren verwendet wur
den, ermöglichten es weiterhin, sekundäre Modifikationen, wie z. B. das Glykosylie
rungsmuster des sezernierten Produktes, zu beurteilen.
Der Stamm MF9: pMF23 wurde mit der oben beschriebenen cDNA-Genbank transfor
miert. 420.000 Transformanden wurden für zwei Tage auf SG-Platten ohne Tryptophan
und Uracil wachsen gelassen. Die so erhaltenen Kolonien wurden auf SG-Platten ohne
Leucin, Tryptophan und Uracil durch Replika-Plattierung repliziert. 320 Leucin-proto
trophe Klone wurden erhalten, von denen 66 ein Wachstum in Abhängigkeit von der
Kohlenstoffquelle (Wachstum auf Galaktose, kein Wachstum auf Glukose) zeigten. Alle
erhaltenen Klone sezernierten Glukoamylase. Die cDNA-Inserts der 55 am besten wach
senden Klone wurden durch PCR-Amplifikation analysiert. Acht verschiedene cDNA-
Größen konnten unterschieden werden, wobei 3 Größen mehrmals vertreten waren. Ins
gesamt 13 Plasmide wurden isoliert und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Die Fä
higkeit der isolierten DNA-Sequenzen, eine Wachstumsinhibition zu dereprimieren, wur
de durch Retransformation der einzelnen Sequenzen in den Stamm MF9 : pMF23 bestä
tigt. Die Identität der erhaltenen Sequenzen wurde durch Vergleich mit Daten aus Se
quenzbanken bestimmt. Unter diesen DNA-Sequenzen war die CDC33-Sequenz 4 mal
vertreten, während die CMK2-Sequenz 3 mal auftrat. CDC33 kodiert einen wesentlichen
Teil des "cap binding complex" durch Binden der 5' cap-Struktur von mRNAs
(Sonenberg, 1996). Die Sekretionseffizienz von Gam1p wurde mit der des ursprünglich
Gam1p sezernierenden Wirtsstammes verglichen und das sezernierte Produkt wurde
auf seine Glykosylierung hin überprüft.
Der rekombinante Stamm MF9 : pMF23 wurde mit dem Plasmid pCDC33, welches die
CDC33-kodierende Sequenz aus S. cerevisiae unter der Kontrolle des GAL1-Promotors
enthält, retransformiert. Der ursprüngliche Stamm und der retransformierte Stamm wur
den in SG-Medium entweder ohne Tryptophan (TRP1-Selektion) oder ohne Tryptophan
und ohne Leucin (TRP1- und LEU2d-Selektion) in 20 ml bei 30°C wachsen gelassen, bis
die stationäre Phase erreicht war.
Die von den rekombinanten Stämmen sezernierte Glukoamylaseaktivität wurde anhand
der neu erworbenen Fähigkeit der Hefezellen, Stärke degradieren zu können, gemes
sen. Diese Zellen wurden daher auf Platten aufgebracht, die 0,5% lösliche Stärke
(gemäß Zulkowski, Merck, Darmstadt) enthielten. Nach dem Zellwachstum wurden die
Platten mit Iodkristallen jodiert. Die Menge an sezernierter Glukoamylase wurde aus dem
Durchmesser der farblosen Höfe auf dem rot gefärbten Hintergrund bestimmt. Für eine
genauere Bestimmung der Glukoamylaseaktivitäten verschiedener Stämme wurden die
se in die wie oben beschriebenen Medium wachsen gelassen und die Glukosebildung
aus einem Stärkesubstrat gemessen (Dohmen et al., 1990; Gellissen et al., 1991). Für
die Glukosebestimmung wurden die Komponenten des "glucose test kits" (Merck,
Darmstadt) gemäß den Instruktionen des Herstellers verwendet. Glukoamylase-Aktivität
wurde in Proben der Kulturüberstände und Zellwandfraktionen gemessen. Zusätzlich
wurde die Enzym-Aktivität in Gesamtzellextrakten bestimmt, welche aus Zellen gewon
nen wurden, die sich in der exponentiellen Wachstumsphase befanden. Die Aktivitäten
wurden jeweils in mindestens drei unabhängigen Messungen bestimmt.
Überexpression des CDC33-Gens führte zu einem 2,5-fachen Anstieg in der Produktion
an sezernierter Glukoamylase im Falle von TRP1-Selektion und zu einem 7-fachen An
stieg im Falle von LEU2d-Selektion (siehe Abb. 3).
Der rekombinante Stamm MF9 : pMF23 wurde mit dem Plasmid pCMK2, welches die
CMK2-kodierende Sequenz aus S. cerevisiae unter der Kontrolle des GAL1-Promotors
enthält, wie oben beschrieben retransformiert. Der ursprüngliche Stamm und der
retransformierte Stamm wurden in SG-Medium entweder ohne Tryptophan (TRPI-
Selektion) oder ohne Tryptophan und ohne Leucin (TRP1 und LEU2d Selektion) in 50 ml
bei 30°C wachsen gelassen, bis die stationäre Phase erreicht war. Die Glukoamylase-
Aktivität wurde wie vorher beschrieben in Proben der Kulturüberstände und der Zell
wandfraktionen gemessen. Zusätzlich wurde Enzymaktivität in Proben von Gesamt
zellextrakten bestimmt, die aus Zellen gewonnen wurden, welche sich in der stationären
Phase befanden. Die Aktivitäten wurden jeweils in mindestens drei unabhängigen Mes
sungen bestimmt.
Überexpression des CMK2-Gens führte zu einem 3-fachen Anstieg in der Produktion
von sezernierter Glukoamylase im Fall von TRP1-Selektion und zu einem 6,4-fachen
Anstieg im Falle von LEU2d Selektion (siehe Abb. 4).
Das Gam1p-Protein ist ein Enzym mit einem Molekulargewicht < 140 kDa. Das errechne
te Molekulargewicht der Aminosäuresequenz ist 104 kDa. Der Unterschied zwischen ap
parentem und errechnetem Molekulargewicht ist auf die Anwesenheit von N- und O-
Glykosylierung zurückzuführen. Die Behandlung von Gam1p mit dem Enzym PNGase F,
das N-gekoppelte Zuckereinheiten spezifisch entfernt, führt zu einer Reduktion des Mo
lekulargewichtes auf 120 kDa. Der verbleibende Unterschied zwischen 120 kDa und
dem errechneten Molekulargewicht von 104 kDa ist auf O-gekoppelte Zuckereinheiten
zurückzuführen. In diesem Beispiel wird das in dem ursprünglichen S. cerevisiae-Stamm
hergestellte Gam1p-Protein mit dem in CDC33- und CMK2-Supertransformanden her
gestellten Gam1p-Protein verglichen. Für diesen Zweck wurde eine Glukoamylase mit
einem C-terminalen HA-Marker für die immunologische Identifizierung der heterologen
Enzyme aus Zellfraktionen mit Hilfe der Western Blot-Analyse hergestellt. Durch scho
nende Homogenisierung wurden Zellextrakte hergestellt, und Zellfraktionen durch Zentri
fugation in einem Saccharose-Dichte-Gradienten erhalten. Mit Hilfe von Marker-
Enzymen, die spezifisch für bestimmte subzelluläre Fraktionen sind, wurden verschiede
ne zelluläre Kompartimente identifiziert (siehe Abb. 2). Die Anwesenheit und die Größe
des heterologen Gam1p-Proteins wurde durch SDS-PAGE gemäß Laemmli bestimmt
(Laemmli, 1970). Die aufgetrennten Polypeptide wurden auf PVDF-Membranen
(Schleicher und Schuell) transferiert und mit spezifischen Antikörpern gegen das HA-
Epitop (BabCo) behandelt. In den Stämmen, die das CMK2-Gen überexprimierten, be
stand die Population an Gam1p-Proteinen aus Molekülen mit einem Molekulargewicht
von 140 kDa und 104 kDa. Daraus wird ersichtlich, daß die Expression des CMK2-Gens
zur Erzeugung von rekombinanten Proteinen beiträgt, deren Molekulargewicht dem Mo
lekulargewicht der nicht modifizierten Aminosäurekette entspricht. Dieser Effekt wurde in
CDC33-überexprimierenden Stämmen nicht beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigen, daß CMK2-Überexpression sowohl zu einer Verbesserung der
Sekretion als auch zu einer Reduktion der Glykosylierung führt. Überexpression von
CDC33 führt dagegen ausschließlich zu einem Anstieg der Sekretion. Das Ausmaß der
Glykosylierung wird in diesem Fall nicht beeinflußt (siehe Abb. 5).
Der Einfluß des CMK2-Gens auf die Glykosylierung von heterologen Proteinen wurde in
einem Phytase-herstellenden H. polymorpha-Stamm untersucht, wie von Mayer et al.,
1999, beschrieben. Der Stamm enthält 40 in das Genom integrierte Kopien eines Phyta
se-Expressionsplasmids, in dem die kodierende Sequenz für Phytase an ein aus
H. polymorpha stammendes FMD-Promotorelement zur Expressionskontrolle fusioniert
ist. Die betreffende Phytase-Variante besteht aus einer Aminosäurekette mit einem er
rechneten Molekulargewicht von 55 kDa. Hyperglykosylierung führt zu Proteinen in ei
nem Bereich zwischen 60 kDa und 110 kDa. Der Produktionsstamm wurde mit einem
Plasmid, welches das aus S. cerevisiae stammende CMK2-Gen entweder unter der
Kontrolle des ebenfalls aus S. cerevisiae stammenden GAL1-Promotors oder unter der
Kontrolle des das H. polymorpha stammenden FMD-Promotors trägt, supertransformiert.
Beispiele für Anwendungen des FMD-Promotors sind in EP 299108 veröffentlicht. Die
resultierenden Supertransformanden wurden auf das Ausmaß an Glykosylierung der se
zernierten Phytase durch vergleichende SDS-PAGE untersucht. In beiden Fällen wurde
gefunden, daß die Hyperglykosylierung reduziert war. Anstatt einer Vielzahl von Protein
banden mit unterschiedlichen Molekulargewichten wurden Banden mit distinkten Größen
sichtbar (Fig. 6).
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WO 98/13473
Claims (37)
1. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten sekretorischen Proteins, umfassend
die folgenden Schritte:
- a) Exprimieren einer für das sekretorische Protein kodierenden Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle zusammen mit einer für ein Polypeptid mit der biologischen Ak tivität des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor 4E (eIF4E) und/oder für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinki nase (CaM-Kinase) kodierenden Nukleinsäure, wobei die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E oder CaM-Kinase kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors P1 steht;
- b) Sezernieren des Proteins aus der Zelle und
- c) Gewinnen des sezernierten Proteins.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure, die für
ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert, ausgewählt ist aus der
folgenden Gruppe:
- a) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert,
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleotidaustausch von der in i) ab ii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren kom plementären Sequenz hybridisieren kann.
3. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Proteins, umfassend die folgenden
Schritte:
- a) Exprimieren einer für das rekombinante Protein kodierenden Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle zusammen mit einer für ein Polypeptid mit der biologischen Ak tivität einer Ca2+/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase (CaM-Kinase) kodierenden Nukleinsäure, wobei die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von CaM- Kinase kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors P1 steht;
- b) Gewinnen des Proteins.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-
Kinase kodiert, ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:
- a) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Aktivi tät einer CaM-Kinase kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addition und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure abgeleite ten Nukleinsäure mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren kom plementären Sequenz hybridisieren kann.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die geeignete Wirtszelle eine Pflanzenzelle, Tierzelle, Hefezelle, Pilzzelle oder
Schleimpilzzelle ist.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Tierzelle eine Säuger- oder Insektenzelle ist.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Hefezelle eine Zelle der Gattung Saccharomyces, Schizosaccharomyces,
Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Schwanniomyces, Candida oder Yarrowia ist.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Pilzzelle eine Zelle der Gattung Aspergillus, Neurospora, Rhizopus oder Tricho
derma ist.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Schleimpilzzelle eine Zelle der Gattung Dictyostelium ist.
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeich
net, daß der Promotor P1 ein starker Promotor ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der
Promotor induzierbar ist.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeich
net, daß das sekretorische Protein aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
Phytase, Glukoamylase, Phosphatase, Wachstumsfaktoren.
Phytase, Glukoamylase, Phosphatase, Wachstumsfaktoren.
13. Verwendung mindestens einer Nukleinsäure zum Steigern der Sekretion eines re
kombinanten sekretorischen Proteins aus einer Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der folgenden Gruppe:
- a) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- e) einer Nukleinsäuresequenz, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäure sequenzen komplementären Sequenz hybridisieren kann;
- f) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- g) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert;
- h) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität ei ner CaM-Kinase kodiert;
- i) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- j) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann.
14. Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
die Nukleinsäure in einen Vektor integriert ist.
15. Verfahren zum Identifizieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert,
das eine verbesserte Sezernierung eines rekombinanten sekretorischen Proteines aus
einer eukaryontischen Zelle ermöglicht, umfassend die Schritte:
- a) Bereitstellen von rekombinanten Wirtszellen, die eine für ein sekretorisches Markerprotein kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines in funktioneller Verbindung mit einem Promotor P2 enthalten, wobei das Wachstum der Wirtszel len bei gegebener Expression des Genes für das sekretorische Markerprotein in hibiert ist, und die weiter einen Expressionsvektor enthalten, in dem DNA- Fragmente aus einem beliebigen Organismus unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors stehen;
- b) Wachsenlassen der rekombinanten Wirtszellen unter Bedingungen, die Selektion auf die Anwesenheit des Expressionsvektors erlauben;
- c) Selektion von Wachstums-dereprimierten Kolonien;
- d) Analyse der in dem Expressionsvektor enthaltenen DNA aus dem beliebigen Or ganismus aus den Wachstums-dereprimierten Kolonien;
- e) Identifizieren der Nukleinsäuresequenz, die nach Expression in der rekombinanten Wirtszelle eine Derepression der Wachstums-Inhibition ermöglicht.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante
Wirtszelle eine Pflanzenzelle, Tierzelle, Hefezelle, Pilzzelle oder Schleimpilzzelle ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Tierzelle eine Säu
ger- oder Insektenzelle ist.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefezelle eine
Zelle der Gattung Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula,
Pichia, Schwanniomyces, Candida oder Yarrowia ist.
19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Pilzzelle eine Zelle
der Gattung Aspergillus, Neurospora, Rhizopus oder Trichoderma ist.
20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Schleimpilzzelle
eine Zelle der Gattung Dictyostelium ist.
21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekenn
zeichnet, daß der die Expression des für das Markerprotein kodierenden Genes kontrol
lierende Promotor ein induzierbarer Promotor ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der induzierbare Pro
motor der PDC1-Promotor ist.
23. Verfahren nach Anspruch 21 und/oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß das
Wachsenlassen der rekombinanten Wirtszellen unter induzierten Bedingungen erfolgt.
24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekenn
zeichnet, daß die für ein sekretorischen Markerprotein kodierende Nukleinsäure auf ei
nem Plasmid mit hoher Kopienzahl vorliegt.
25. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekenn
zeichnet, daß die in Schritt a) von Anspruch 15 verwendeten DNA-Fragmente einer
cDNA-Genbank entstammen.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Genbank
aus S. cerevisiae stammt.
27. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekenn
zeichnet, daß die in Schritt a) von Anspruch 15 verwendeten DNA-Fragmente einer ge
nomischen Genbank entstammen.
28. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 27, dadurch gekenn
zeichnet, daß der in Schritt a) von Anspruch 15 genannte Expressionsvektor, in dem
DNA-Fragmente aus einem beliebigen Organismus enthalten sind, der CEN/ARS-Vektor
ist.
29. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 28, dadurch gekenn
zeichnet, daß das sekretorische Markerprotein Glucoamylase ist.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Glucoamy
lase kodierende Nukleinsäuresequenz die GAM1P-Sequenz aus S. occidentalis ist.
31. Verwendung einer rekombinanten Wirtszelle, die eine für ein sekretorisches Marker
protein kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors P2 enthält, wobei
das Wachstum der Wirtszelle bei gegebener Expression des für das Markerprotein ko
dierenden Genes inhibiert ist, zum Identifizieren von Nukleinsäuresequenzen, welche
nach Expression eine Derepression der Wachstums-Inhibition ermöglichen.
32. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine durch ein rekombinantes Verfah
ren in die Zelle eingeschleuste Nukleinsäure enthält, die aus der folgenden Gruppe aus
gewählt ist:
- a) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomvces cerevisiae kodiert (CDC33);
- b) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- c) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- e) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann;
- f) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomvces cerevisiae kodiert (CMK2);
- g) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert;
- h) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- i) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase;
- j) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann.
33. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:
- a) einen Expressionsvektor, umfassend in funktioneller Verbindung mit einem Promo tor eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
- b) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33);
- c) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- e) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- f) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann,
- a) eine zur Sezernierung von Proteinen geeignete Wirtszelle.
34. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:
- a) einen Expressionsvektor, umfassend in funktioneller Verbindung mit einem Promo tor eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
- b) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- c) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert;
- d) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- e) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- f) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann,
- a) eine zur Sezernierung und/oder Glykosylierung von Proteinen geeignete Wirtszelle.
35. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:
- a) mindestens einen Expressionsvektor, umfassend mindestens eine Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM- Kinase und/oder eIF4E kodiert, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
- b) einer Nukleinsäure, die für eIF4E aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CDC33);
- c) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog von eIF4E mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- d) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in i) oder ii) genannten Nukleinsäure ab geleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität von eIF4E kodiert;
- e) einem Fragment einer der in i) bis iii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität eines eIF4E kodiert;
- f) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in i) bis iv) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann;
- g) einer Nukleinsäure, die für CaM-Kinase aus Saccharomyces cerevisiae kodiert (CMK2);
- h) einer Nukleinsäure, die für ein Homolog einer CaM-Kinase mit der biologischen Ak tivität einer CaM-Kinase kodiert;
- i) einer durch Degeneration des genetischen Codes, durch Deletion, Insertion, Addi tion und/oder Nukleotidaustausch von der in vi) oder vii) genannten Nukleinsäure abgeleiteten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- j) einem Fragment einer der in vi) bis viii) genannten Nukleinsäuren, das für ein Poly peptid mit der biologischen Aktivität einer CaM-Kinase kodiert;
- k) einer Nukleinsäure, die mit einer zu den in vi) bis ix) genannten Nukleinsäuren komplementären Sequenz hybridisieren kann;
- l) eine zur Sezernierung und/oder Glykosylierung von Proteinen geeignete Wirtszelle.
36. Kit nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin einen leeren Ex
pressionsvektor, der zum Hineinklonieren einer Nukleinsäure geeignet ist, welche ein re
kombinantes und/oder rekombinantes sezernierbares Protein kodiert, umfaßt.
37. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Wirtszelle nach Anspruch 32 und einen
leeren Expressionsvektor, der zum Hineinklonieren einer Nukleinsäure geeignet ist, wel
che ein rekombinantes und/oder rekombinantes sezernierbares Protein kodiert, umfaßt.
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