DE3752379T2

DE3752379T2 - Verfahren zur Herstellung von Proteinprodukten in Aspergillus-Oryzae und in Aspergillus zu verwendender Promotor

Info

Publication number: DE3752379T2
Application number: DE3752379T
Authority: DE
Inventors: Esper Boel; Christensen Tove; Helle Fabricius Woldike
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1986-03-17
Filing date: 1987-03-16
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2007-03-17
Also published as: EP0238023B1; IE940343L; ATE98993T1; EP1502952A2; EP1502952A3; IE870682L; ATE282093T1; DE3752379D1; CA1341593C; JP3005618B2; DE3788524T2; EP0238023A3; JP3903165B2; DE3788524D1; EP0238023A2; DE3788524T3; ES2061446T3; EP0238023B2; JP2003153696A; FI871144A0

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Promotor für Aspergillus.
In der Vergangenheit sind zahlreiche Verfahren für die Herstellung von Polypeptiden oder Proteinen mittels der rekombinanten DNA-Technologie entwickelt worden. Das Hauptinteresse hat sich auf Bakterien und Hefe, z.B. E. coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae, konzentriert, die gut charakterisierte Spezies in Bezug auf beispielsweise Expressions- und Selektionssysteme sind.
Neben den oben erwähnten Mikroorganismen sind filamentöse Pilze, wie etwa Aspergillus niger, attraktive Kandidaten als Wirtsmikroorganismen für rekombinante DNA-Vektoren, die gut charakterisierte und verbreitet verwendete Mikroorganismen für die kommerzielle Herstellung von Enzymen sind. Die Anstrengungen haben sich insbesondere auf die Entwicklung von Transformationssystemen konzentriert, durch die ein Selektionsmarker, der eine Selektion von Transformanten aus den untransformierten Wirtsorganismen erlaubt, verwendet wird.
In den vergangenen paar Jahren sind verschiedene Selektionsmarker für die Transformation von Aspergillus nidulans beschrieben worden, und es sind kürzlich Verfahren zur integrativen Transformation des filamentösen Pilzes Aspergillus nidulans zum Zwecke einer Untersuchung der genetischen und molekularen Prozesse, welche die Zelldifferenzierung des Pilzes steuern, entwickelt worden.
Eine Transformation von A. nidulans ist unter Verwendung von Plasmiden, die das pyr-4-Gen von Neurospora crassa (Ballance, D.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289, 1983), das amdS-Gen von A. nidulans (Tilburn, J.G. et al., Gene 26, 205-221, 1983), das trpC-Gen von A. nidulans (Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474, 1984) und das argB-Gen von A. nidulans (John, M.A. and Peberdy J., Microb. Technol. 6, 386-389, 1984) enthalten, gezeigt worden. Es wurde festgestellt, daß die transformierende DNA in das Wirtsgenom mit einer ziemlich geringen Häufigkeit (typischerweise <1000 Transformanten/μg DNA) integriert war.
Erst kürzlich wurde eine Transformation von Aspergillus niger mit den amdS-Gen von A. nidulans beschrieben (Kelly, J.M. and Hynes, M.J., EMBO Journal 4, 475-479, 1985), und es wurde gezeigt, daß amdS ein potentieller Selektionsmarker zur Verwendung bei einer Transformation von Aspergillus niger ist, der in Gegenwart von Acetamid als einziger Stickstoffquelle nicht stark wachsen kann. Eine Transformation von Aspergillus niger unter Verwendung des argB-Gens von Aspergillus nidulans ist ebenfalls kürzlich beschrieben worden (Buxton, F. P. et al., Gene 37, 207-214, 1985).
Bisher sind keine Systeme zur Expression fremder Proteine in dem filamentösen Pilz Aspergillus oryzae entwickelt worden, hauptsächlich aufgrund unzureichender Kenntnis darüber, wie die Genexpression in diesem Pilz gesteuert wird und aufgrund des Fehlens geeigneter selektierbarer genetischer Marker in Klonierungsvektoren.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es ist gezeigt worden, daß die oben beschriebenen Transformationstechniken verwendet werden können, um ein hohes Maß an Expression heterologer Proteine zu erhalten oder um die Produktion homologer Proteine in Aspergillus oryzae zu verstärken.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „heterologe Proteine" Proteine, die nicht durch A. oryzae produziert werden, während „homologe Proteine" Proteine bezeichnet, die durch A. oryzae selbst produziert werden.
Genauer ist gezeigt worden, daß eine Selektion von A. oryzae-Stämmen, die mit DNA, die ein gewünschtes Proteinprodukt kodiert, transformiert waren, unter Verwendung der Markergene, die zur Transformation von A. niger und A. nidulans verwendet werden, möglich ist. Aufgrund der phylogenetischen Entfernung zwischen diesen zuletzt genannten Pilzen und A. oryzae (Raper, K.B. and Fennell, D.I, The Genus Aspergillus, 1965) war dies keinesfalls vorherzusehen.
Ein Verfahren zur Expression eines Proteinprodukts in Aspergillus oryzae umfaßt folgende Schritte:

(a) Bereitstellen eines rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystems, das zur Integration in das Genom eines Aspergillus oryzae-Wirts in einer oder mehreren Kopien fähig ist, und das folgendes umfaßt: DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, die eine Genexpression erleichtern; einen geeigneten Marker zur Selektion von Transformanten; und eine DNA-Sequenz, die das gewünschte Proteinprodukt kodiert;
(b) Transformieren des Aspergillus oryzae-Wirts, der ein funktionelles Gen für den, mit dem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem aus Schritt (a) ausgewählten Marker nicht beherbergt; und
(c) Kultivieren des transformierten Aspergillus oryzae-Wirts in einem geeigneten Kulturmedium.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein hocheffizienter Promotor zur Expression eines Proteinprodukts in Aspergillus, insbesondere in Aspergillus oryzae und Aspergillus niger, verfügbar gemacht, wobei der Promotor als der TAKA-Amylase-Promotor, dargestellt in 1, charakterisiert ist, dem wahlweise aktivierende Sequenzen stromaufwärts vorangehen.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinprodukts in Aspergillus oryzae umfaßt ein Transformieren von Aspergillus oryzae mit einem rekombinanten DNA-Klonierungsvektorsystem, wie oben beschrieben, und ein Kultivieren in einem geeigneten Kulturmedium und ein Gewinnen des Produkts aus dem Kulturmedium.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die beigefügten Zeichnungen, in denen:
1 die DNA-Sequenz des TAKA-Amylase-Promotors und stromaufwärts gelegenen Promotor-Regionen, die Präregion und den 5'-Teil des strukturellen Gens für die TAKA-Amylase zeigt;
2 eine Endonuklease-Restriktionskarte des Plasmids pTAKA17 zeigt;
3 die Konstruktion des Plasmids p285'proC veranschaulicht;
4a und 4b die DNA-Sequenz der präpro-Aspartat-Proteinase-cDNA von Rhizomucor miehei zusammen mit der deduzierten Aminosäuresequenz, angegeben durch Drei-Buchstaben-Abkürzungen, zeigt;
5 die Konstruktion des Plasmids pRMP veranschaulicht;
6 die Endonuklease-Restriktionskarte des Plasmids pCAMG91 zeigt;
7a die Konstruktion des Plasmids pICAMG/Term veranschaulicht;
7b die Konstruktion des Plasmids p686 veranschaulicht;
8 die Konstruktion des Plasmids pRMPAMGTerm veranschaulicht;
9a die Konstruktion des Plasmids pB408.3 veranschaulicht;
9b die Konstruktion des Plasmids p778 veranschaulicht;
10 die Konstruktion des Plasmids p719 veranschaulicht;
11 die Konstruktion des Plasmids p777 veranschaulicht;
12 die cDNA-Sequenz der präpro-Lipase von Rhizomucor miehei zusammen mit der deduzierten Aminosäuresequenz, angegeben durch Drei-Buchstaben-Abkürzungen, zeigt;
13a die Konstruktion des Plasmids pB544 veranschaulicht;
13b die Konstruktion des Plasmids p787 veranschaulicht;
14 die DNA-Sequenz eines synthetischen RML 5'-Fragments zeigt;
15a die Konstruktion des Plasmids pTOC51 veranschaulicht; und
15b die Konstruktion des Plasmids pTOC56 veranschaulicht.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Bei der verwendeten Transformationstechnik handelte es sich um ein Verfahren, das von den Verfahren zur Transformation von A. nidulans (Ballance et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289, 1983; Tilburn et al., Gene 26, 205-221, 1983; Yelton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474, 1984) abgeleitet und entsprechend angepaßt worden ist, und das dem Verfahren von Buxton et al. (Gene 37, 207-214, 1985) zur Transformation von A. niger ähnlich ist. Aspergillus oryzae wird mit einem Vektorsystem, das einen Selektionsmarker enthält, der die Eigenschaft aufweist, in das Genom des Wirtsstamms aufgenommen zu werden, jedoch vor der Transformation von dem Wirtsstamm nicht beherbergt wird, transformiert. Transformanten können dann von Nichttransformanten auf der Grundlage des aufgenommenen Selektionsmarkers selektiert und isoliert werden.
Bevorzugte Selektionsmarker sind die Gene argB (A. nidulans oder A. niger), trpC (A. nidulans), amdS (A. nidulans) oder pyr4 (Neurospora crassa), oder das Gen für DHFR (Dihydrofolat-Reduktase oder Mutanten davon). Stärker bevorzugte Selektionsmarker sind das argB-Gen oder das amdS-Gen. Wildtyp-Stämme von A. oryzae sind normalerweise argB⁺ (d.h. das argB-Gen ist in A. oryzae funktionell). Wenn argB als Selektionsmarker ausgewählt wird, muß ein Stamm von A. oryzae, der eine argB-Mutante ist, die einen Defekt im Gen für diesen Marker aufweist, als Wirtsstamm ausgewählt werden. A. oryzae-argB-Mutanten können, wie von F. B. Buxton et al. (Gene 37, 207-214, 1985) beschrieben, präpariert werden. Eine argB-Mutante ist definiert als eine Mutante mit einem Defekt in dem Ornithin-Transcarbamylase-Gen. Andererseits kann das amdS-Gen als ein Selektionsmarker zur Transformation des A. oryzae-Wildtyps verwendet werden, da die Wildtyp-Stämme dieses Gen nicht enthalten.
DNA-Sequenzen, die Funktionen kodieren, die eine Genexpression erleichtern, sind typischerweise Promotoren, Transkriptionsterminatoren und Polyadenylisierungssignale.
Der Promotor, dem aktivierende Sequenzen und Enhancer-Sequenzen, wie sie im Stand der Technik bestens bekannt sind, stromaufwärts vorangehen können, kann jede DNA-Sequenz aufweisen, die eine starke transkriptionelle Aktivität in Aspergillus oryzae zeigen könnte, und die von Genen abgeleitet sein kann, die sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine, wie etwa Amylasen, Glucoamylasen, Proteasen, Lipasen, Zellulasen und glykolytische Enzyme, kodieren. Geeignete Promotoren können von Genen für die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, die Aspartat-Proteinase von Rhizomucor miehei, die Glucoamylase von A. niger, die neutrale α-Amylase von A. niger, die säurestabile α-Amylase von A. niger und für die Lipase von Rhizomucor miehei abgeleitet sein. Beispiele für Promotoren von Genen für glykolytische Enzyme sind TPI, ADH und PGK.
Der Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung ist der TAKA-Amylase-Promotor von A. oryzae. Die TAKA-Amylase ist eine bestens bekannte α-Amylase (Toda et al., Proc. Japan Acad. 58, Ser. B, 208-212, 1982). Die DNA, welche die Promotor-Region kodiert, wurde von dem genomischen Klon der TAKA-Amylase abgeleitet. Die Sequenz des Promotors und von Regionen stromaufwärts des Promotors zusammen mit der Präregion und dem 5'-Ende des Strukturgens der TAKA-Amylase wird in 1 veranschaulicht.
Wie in Beispiel 2 genauer beschrieben, wurde eine DNA-Sequenz, welche die TAKA-Amylase einschließlich der Präregion und dem Promotor und aktivierenden Sequenzen stromaufwärts kodiert, von einem A. oryzae-Myzel abgeleitet und in, mit BamHI verdautes pBR322 eingefügt, um das Plasmid pTAKA 17 zu ergeben (siehe 2). In pTAKA 17 wird die von A. oryzae abgeleitete DNA als ein 5,5 kb großes BamHI/Sau3Al-BamHI/Sau3Al-Fragment gezeigt, wobei der Promotor und aktivierende Sequenzen stromaufwärts ein 2,1 kb großes Fragment darstellen, das in Position 0 beginnt. Die etablierte DNA-Sequenz des Promotors und aktivierender Sequenzen stromaufwärts bis zu der BglII-Schnittstelle werden in 1 gezeigt. Der Promotor endet bei Nukleotid-1, das dem Met(1)-Codon der TAKA-Amylase-Präsequenz vorangeht. Die Nukleotidsequenz, welche die Präsequenz kodiert, ist aus 63 Nukleotiden aufgebaut, und die reife TAKA-Amylase beginnt in einer Position, die Nukleotid-64 entspricht.
Von pTAKA17 kann die gesamte Promotor-Sequenz, einschließlich Sequenzen stromaufwärts des Promotors oder funktionelle Teile davon durch Mittel abgeleitet werden, die dem Fachmann offensichtlich sind. Die Promotor-Sequenz kann mit Linkern verfügbar gemacht werden, mit dem Zweck, spezifische Restriktionsstellen einzuführen, welche die Ligation der Promotor-Sequenz mit weiterer DNA, beispielsweise dem Gen, welches das gewünschte Proteinprodukt kodiert, oder verschiedenen Präregionen (Signalpeptiden) erleichtert.
Die Sequenz von Nukeotid-1144 (siehe 1) (welches den Startpunkt einer SalI-Schnittstelle darstellt) bis Nukleotid -10 ist ein Beispiel eines gut funktionierenden Teils der Promotor-Region. In einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung ging der Nukleotidsequenz von Nukleotid-1176 bis -1 das noch nicht sequenzierte 1,05 kb große Fragment von pTAKA17 voran. Für den Fachmann ist offensichtlich, daß verschiedene Fragmente verwendet werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung weisen der Promotor und aktivierende Sequenzen stromaufwärts die folgende Sequenz auf:
welche die Sequenz von Nukleotid-1144 bis -10 in 1 darstellt.
Gemäß einer weiteren Ausführung weist der Promotor und aktivierende Sequenzen stromaufwärts die folgende Sequenz auf:
welche die Sequenz von Nukleotid-1176 bis -1 in 1 darstellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der zuletzt genannten Sequenz die 1,05 kb große, stromaufwärts gelegene unsequenzierte Region von pTAKA17 (Position 0 bis 1,05 in 2) vorangehen.
Die Terminatoren und Polyadenylierungssequenzen können aus den selben Quellen stammen wie die Promotoren. Enhancer-Sequenzen können ebenfalls in die Konstruktion eingefügt werden.
Das exprimierte Produkt kann in den Zellen akkumuliert sein, was ein Aufreißen der Zellen erfordert, um das Produkt zu isolieren. Um diesen weiteren Verfahrenschritt zu vermeiden und auch, um das Ausmaß eines möglichen Abbaus des exprimierten Produkts innerhalb der Zellen zu minimieren, wird bevorzugt, daß das Produkt von der Zelle sezerniert wird. Zu diesem Zweck wird das Gen des gewünschten Produkts mit einer Präregion ausgestattet, welche die effektive Steuerung des exprimierten Produkts in den Sekretionsweg der Zelle sicherstellt. Diese Präregion, die ein natürlich vorkommendes Signal oder ein Leader-Peptid oder funktionelle Teile davon oder eine synthetische Sequenz, die eine Sekretion ermöglicht, sein könnte, wird im allgemeinen vom gewünschten Produkt während der Sekretion abgespaltet, wodurch das reife Produkt zurückbleibt, das für eine Isolierung aus dem Kulturnährmedium bereit ist.
Die Präregion kann von Genen für sezernierte Proteine aus jeder Quelle von Organismus abgeleitet sein.
Die Präregion kann von einem Glucoamylase- oder einem Amylase-Gen von einer Aspergillus-Spezies, einem Amylase-Gen von einer Bacillus-Species, einem Lipase- oder Proteinase-Gen von Rhizomucor miehei, dem Gen für den α-Faktor von S. cerevisiae oder dem Kälber-Prochymosin-Gen abgeleitet sein. Stärker bevorzugt ist die Präregion abgeleitet von dem Gen für die TAKA-Amylase aus A. oryzae, die neutrale α-Amylase aus A. niger, die säurestabile α-Amylase aus A. niger, die α-Amylase aus B. licheniformis, die maltogene Amylase aus Bacillus NCIB 11837, die α-Amylase aus B. stearothermophilus oder B. licheniformis subtilisin. Eine effektive Signalsequenz ist das Signal der TAKA-Amylase aus A. oryzae, das Signal der Aspartat-Proteinase aus Rhizomucor miehei und das Lipase-Signal aus Rhizomucor miehei.
Das TAKA-Amylase-Signal weist die folgende Sequenz auf
Das Gen für das gewünschte Produkt, das funktionell mit Promotor- und Terminator-Sequenzen verknüpft ist, kann in einen Vektor, der den Selektionsmarker enthält, aufgenom men sein oder kann in einem separaten Vektor oder einem separaten Plasmid, der/das die Eigenschaft aufweist, in das Genom des Wirtsstamms integriert zu werden, enthalten sein. Wie hier verwendet, schließt das „Expressionsvektorsystem" einen einzelnen Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide ein, die gemeinsam die gesamte DNA-Information enthalten, die in das Wirtsgenom integriert werden soll. Vektoren oder Plasmide können lineare oder geschlossene ringförmige Moleküle sein. A. oryzae kann mit zwei Vektoren cotransformiert sein, wobei einer den Selektionmarker einschließt und der andere die verbleibende Fremd-DNA, die in den Wirtsstamm eingeführt werden soll, einschließlich Promoter, dem Gen für das gewünschte Produkt und Transkriptionsterminator- und Polyadenylierungsssequenzen, umfaßt.
Normalerweise sind die A. oryzae-Transformanten stabil und können in Abwesenheit eines Selektionsdrucks kultiviert werden. Falls sich herausstellt, das die Transformanten unstabil sind, kann der Selektionsmarker zur Selektion während der Kultivierung verwendet werden. Die transformierten Zellen werden dann unter einen Selektionsdruck, der dem in Frage kommenden Marker entspricht, kultiviert.
A. oryzae ist über Jahre im kommerziellen Maßstab zur Herstellung von beispielsweise dem TAKA-Amylase-Enzym und proteolytischen Enzymen verwendet worden, und dementsprechend ist die Fermentationstechnologie für diesen Mikroorganismus bestens entwickelt, und der Mikroorgansimus ist zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie zugelassen. A. oryzae kann zur industriellen Herstellung großer Mengen von im Prinzip jedem Polypeptid- oder Proteinprodukt verwendet werden. Beispiele derartiger Produkte sind Chymosin oder Prochymosin und andere Labe, Proteasen, Amyloglucosidasen, säurestabile Amylasen aus Aspergillus, Lipasen aus Pilzen oder prokaryotische Lipasen und thermostabile Amylasen aus Bakterien und Pilzen.
Unten wird die Herstellung von Prochymosin, der Aspartat-Proteinase aus Rhizomucor miehei, der TAKA-Amylase und einer Lipase von Rhizomucor miehei beschrieben.
Die Gene für diese Enzyme wurden aus cDNA-Bibliotheken oder genomischen Bibliotheken erhalten, wie im folgenden genauer beschrieben wird.
BEISPIELE

Plasmide, die als Ausgangsmaterial in den folgenden Beispielen verwendet wurden, sind wie folgt:

p285:	(ATCC Nr. 20681)
pCAMG91:	Boel et al. EMBO Journal 3 (1984), 1581-1585.
pIC19R:	Marsh et al. Gene 32 (1984), 481-485.
pSa143:	Berse et al. Gene 25 (1983), 109-117.
	John & Peberdy, Enzyme Microb. Technol. 6
	(1984), 386-389.
p3SR2:	J.M. Kelly and M.J. Hynes, EMBO Journal 4
	(1985), 475-479.
pBR322:	Bolivar F. et al., Gene 2 (1977), 95-113.
pBR327:	Covarrubias L. et al., Gene 13 (1981), 25-35.
pUC9, pUC13	Vieira et al., Gene 19 (1982), 259-268 and
und pUC 19:	Messing, Meth. in Enzymology 101 (1983), 20-
	27.

Die verwendeten Stämme sind wie folgt:

A. niger:	ATCC 1015, ATCC 10582
A. oryzae:	ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011,
	ATCC 9576, ATCC 14488-11491, ATCC
	11601 und ATCC 12892
E. coli:	MC1000 (Casabadan, M.J. und Cohen, S.N., J.
	Mol. Biol. 138, 179-207) (NCIB 11956)
Rhizomucor miehei:	CBS 370.65

Beispiel 1
Präparation von Plasmid 285'proC, welches das Prochymosin-Gen enthält
Das präpro-Chymosin-Gen wurde aus einer Kälbermagen-cDNA-Bibliothek isoliert und in die PstI-Schnittstelle von pBR322 durch G-C-Tailing eingefügt (Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294, 1979; Truelsen et al., Nucleic Acids Res. 6, 3061, 1979), um pR26 zu erhalten. pUC9 wurde mit SalI geschnitten und mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und mit T4-Ligase ligiert. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde mit BamHI-EcoRI geschnitten, und das 2,7 kb große Fragment wurde mit einem 0,47 kb großen BamHI-EcoRI-Fragment aus pR26, welches das N-terminale Ende des Prochymosin-Gens enthielt, ligiert, um pUC9' zu erzeugen. pUC9' enthält eine HindIII-Schnittstelle am N-Terminus des Prochymosin-Gens. pUC 13 wurde mit BamHI-NarI und NarI-XmaI geschnitten, und die großen bzw. kleinen Fragmente wurden mit einem 0,64 kb großen XmaI-BclI-Fragment von pR26, welches das C-terminale Ende des Prochymosin-Gens enthielt, ligiert, um das Plasmid pUC 13' zu erhalten. pUC 13' enthält eine XbaI-Schnittstelle am C-Terminus des Prochymosin-Gens. Ein 0,65 kb großes XmaI-XbaI-Fragment von pUC 13' wurde mit einem 0,46 kb großen HindIII-XmaI-Fragment von pUC9' und einem 11 kb großen XbaI-HindIII-Fragment von p285 ligiert, um das Plasmid p285'proC zu erzeugen, welches das Prochymosin-Gen enthält, wie in 3 veranschaulicht.
Beispiel 2
Klonierung des TAKA-Amylase A-Gens von A. oryzae
Isolierung eines partiellen cDNA-Klons
Aus A. oryzae Hw32, gewachsen auf Kartoffelstärke, wurde mRNA nach Kaplan et al. (Biochem. J. 183, 181-84, 1979) präpariert. Ein partieller cDNA-Klon, der 1050 by des TAKA-Amylase-Gens enthielt, wurde durch spezifisches „Priming" der mRNA mit einem Gemisch aus 14-mer Oligonukleotiden erhalten:
die zu der, die Aminosäuren 295-299 der TAKA-Amylase (Toda et al., Proc. Japan Acad. 58, Ser. B, 208-12, 1982) kodierenden Sequenz komplementär waren. Das Klonierungsverfahren wurde gemäß Gubler and Hoffmann (Gene 25, 263-69, 1983) durchgeführt. Eine Sequenzierung an den Enden und in der Mitte des cDNA-Klons zeigte die Anwesenheit von Sequenzen, die der Aminosäuresequenz der TAKA-Amylase entsprachen.
Isolierung von genomischen Klonen
Das Myzel von A. oryzae Hw 325 wurde geerntet und für die Präparation von DNA gemäß dem für A. niger verwendeten Verfahren, das durch Boel et al. supra. beschrieben wurde, verarbeitet. Restriktionsfragmente mit einer Größe von 3-10 kb, die durch partiellen Verdau mit Sau3A erzeugt wurden, wurden mit, durch BamHI verdautes, dephosphoryliertes pBR322 (New England Biolabs) ligiert. 50.000 Rekombinanten wurden mit der Oligonukleotid-Sonde NOR-168 (siehe oben) durchgemustert, und bei sieben davon wurde festgestellt, daß sie DNA enthielten, welche die TAKA-Amylase kodierten. Ein Klon wurde zur weiteren Verwendung der Promotor-Region mit 2,1 kb stromaufwärts des mRNA-Startpunkts ausgewählt. Die Restriktionskarte für das Plasmid pTAKA17 wird in 2 dargestellt. pTAKA17, transferiert in einen E. coli-Stamm, wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM), Griesebachstraße 8, D-3400 Göttingen, am 23. Februar 1987 hinterlegt und erhielt die Bezugsnummer DSM 4012, was eine internationale Hinterlegung, authorisiert unter dem Budapester Vertrag von 1977, darstellt, wodurch eine Dauerhaftigkeit der Hinterlegung und eine Zugänglichkeit dieser von Seiten der Öffentlichkeit in Übereinstimmung mit Regel 9 bzw. 11 des oben genannten Vertrags gewährleistet wird.
Beispiel 3
Konstruktion einer cDNA-Bibliothek von Rhizomucor miehei
Der phycomyzete Pilz Rhizomucor miehei (zur morphologischen und taxonomischen Beschreibung dieser Species siehe: Schipper, M.A.A. On the genera Rhizomucor and Parasitella. In: Studies in mycology, Institute of the Royal Netherlands Academy of Sciences and Letters. Nr. 17, 53-71, 1978) sezeniert eine saure Proteinase (Rhizomucor miehei-Proteinase, im folgenden mit RMP abgekürzt), die zur Gerinnung von Milch bei der Käseherstellung weitverbreitet ist. Um rekombinante cDNA-Klone dieses Proteins in E. coli zu erhalten, wurde die Gesamt-RNA aus einem homogenisierten R. miehei-Myzel extrahiert, wie durch Boel et al. (EMBO J. 3, 1097-1102, 1984) und Chirgwin et al., (Biochemistry, Wash., 18, 5294-5299, 1979) beschrieben. Poly(A)-enthaltende RNA wurde durch zwei Durchgänge von Affinitätschromatography an Oligo(dT)-Zellulose erhalten, wie durch Aviv and Leder (PNAS USA 69, 1408-1412, 1972) beschrieben. Durch Oligo(dT) „geprimte" komplementäre DNA wurde synthetisiert und gemäß Gubler and Hoffmann (Gene 25, 263-269, 1983) doppelsträngig gemacht. An die doppelsträngige cDNA wurde dCTP mit der terminalen Desoxynucleotidyl-Transferase angehängt, wie durch Roychoudhury et al. (Nucleic Acids Res. 3, 101-106, 1976) beschrieben. Das Plasmid pBR327 wurde mit PstI linearisiert, und es wurde dGTP angehängt. Die mit Oligo(dC) versehene dscDNA wurde an diesen, mit Oligo(dG) versehenen Vektor angelagert („annealed"), wie durch Peacock et al. (Biochim. Biophys. Acta 655, 243-250, 1981) beschrieben, und verwendet, um ein hsdR^–, M⁺-Derivat von E. coli MC1000 (Casadaban and Cohen, J. Mol. Biol. 138, 179-207, 1980) zu transformieren, um rekombinante Klone zu erzeugen.
Identifizierung von RMP-spezifischen cDNA-Rekombinanten
Ein Gemisch aus 16 Heptadecamer-Oligodesoxyribonukleotiden
von denen eines zu der RMP-mRNA in der Region, die Tyr-Tyr-Phe-Trp-Asp-Ala (Bech and Foltmann, Nethmilk Dairy J. 35, 275-280, 1981) kodiert, komplementär ist, wurde in einem DNA-Syntheseapparat von Applied Biosystems, Inc. synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ungefähr 10.000 E. coli-Rekombinanten aus der Rhizomucor miehei-cDNA-Bibliothek wurden auf Whatman 540-Papierfilter transferiert. Die Kolonien wurden lysiert und immobilisiert, wie durch Gergen et al. (Nucleic Acids Res. 7 2115-2135, 1979) beschrieben. Die Filter wurden mit dem Gemisch aus ³²P-markierten, RMP-spezifischen Heptadecameren hybridisiert, wie durch Boel et al. (EMBO J. 3, 1097-1102, 1984) beschrieben. Hybridisierung und Waschen der Filter erfolgte bei 40°C, gefolgt durch Autoradiographie für 24 Stunden mit einem Verstärkungschirm. Miniprep-Plasmid-DNA wurde aus einer hybridisierenden Kolonie, pRMP 1016, durch Standardverfahren (Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523, 1979) isoliert, und die DNA-Sequenz des cDNA-Inserts wurde durch das Verfahren von Maxam and Gilbert (Methods Enzymol. 65, 499-560, 1980) etabliert. Es zeigte sich, daß pRMP1016 einen Teil des nicht-translatierten 5'-Endes der mRNA enthielt und sich dann über Bereiche ausdehnte, die eine 69 Aminosäuren lange Präproregion und 300 Aminosäuren in den reifen Bereich des RMP-Proteins hinein kodierte. Da pRMP1016 keine einziges Insert enthielt, das dem vollständigen 3'-Ende der RMP-mRNA entsprach, wurde die cDNA-Bibliothek erneut mit einem ³²P-Nick-translatierten 3'-spezifischen Restriktionsfragment aus Klon pRMP1016 durchgemustert, wobei der Klon pRMP2931 isoliert wurde. Dieser Klon enthält einen Teil der nicht-translatierten 3'-Region und ein offenes Leserraster mit den 270 Triplets, die den carboxyterminalen Teil des RMP-Proteins kodieren. pRMP1016 und pRMP2931 weisen deshalb eine ausgedehnte Überlappung auf, und die kombinierte Sequenz der beiden Klone ergibt die Sequenz der präpro-RMP-cDNA von R. miehei. Insgesamt wurden 1416 Nukleotide zwischen den G:C-Schwänzen, die das Ergebnis des cDNA-Klonierungsverfahrens waren, sequenziert. Die etablierte DNA-Sequenz wird in 4a und 4b zusammen mit der deduzierten Aminosäuresequenz eines Vorläufermoleküls („precursor") von RMP gezeigt. In 4a und 4b gibt die horizontale Linie die Position eines Gemischs aus synthetischen Oligos an, das zum Durchmustern einer cDNA-Bibliothek verwendet wurde. Ein Pfeil zeigt die Position, in der während der Reifung von nativer RMP eine Prozessierung erfolgt. Die Nukleotide sind von der ersten Base im Met-Start-Codon an numeriert, und die Aminosäuren sind vom ersten Rest im reifen RMP an numeriert. Aus dieser cDNA-Sequenz kann geschlußfolgert werden, daß RMP als ein 430 Aminosäuren großes Vorläufermolekül mit einem Propeptid von 69 Aminosäuren synthetisiert wird. Eine putative Signalpeptidase-Prozessierungsstelle (von Heijne, Eur. J. Biochem. 133, 17-21, 1983) in diesem Vorläufermolekül könnte zwischen Ala(-48) und Arg(-47) liegen, und die reife RMP wird durch autoproteolytische Spaltung zwischen Glu-1 und Ala(+1) erzeugt werden. Die von der cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz von RMP stimmt mit der früher publizierten partiellen Aminosäuresequenz (Bech and Foltmann, Neth-Milk Dairy J. 35, 275-280, 1981) gut überein.
Um die Konstruktionsarbeit mit den RMP-cDNAs zu erleichtern, wurde ein HindIII-Linker an einer BanI-Schnittstelle genau 3' zu dem TAA-Terminationscodon eingeführt, was in Klon pRMP2931 wie folgt identifiziert wurde. 25 μg pRMP2931 wurde mit PstI verdaut, um das RMP-cDNA-Insert zu erhalten. Dieses Insert wurde durch 1 %ige Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, aus dem Gel elektroeluiert, durch Phenol- und Chloroformextrationen gereinigt und mit NaCl und Ethanol präzipitiert. Dieses Fragment, das die 3'-Hälfte von RMP kodiert, wurde mit BanI verdaut, und die kohäsiven Enden der BanI-Restriktionsstelle wurden mit einer Mischung aus den vier dNTPs und dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase auf gefüllt. Diesen aufgefüllten Enden wurden HindIII-Linker in einer T4-DNA-Ligase-Reaktion hinzugefügt. Die Ligationsreaktionsmischung wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert, und die DNA wurde mit 4 M NH₄ ⁺-Acetat/Ethanol präzipitiert. Die gereinigte DNA wurde mit einem Überschuß an HindIII-Enzym verdaut, und ein 380 bp großes Fragment wurde auf einem 6%igen Polyacrylamidgel gereinigt. Dieses Fragment, welches das 3'-Ende des offenen Leserasters von RMP plus dem TAA-Terminationscodon enthielt, wurde in einen, mit HindIII verdauten und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor pIC 19R ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli-Zellen zu transformieren, und Transformanten wurden auf Ampicillin enthaltenden Agarplatten selektiert. Die Plasmid-DNA wurde aus Transformanten gereinigt, und korrekte Rekombinanten wurden durch Restriktionsendonuklease-Verdau und Agarose-Gelelektrophorese identifiziert. Aus einer solchen korrekten Rekombinanten, pRMP3', wurde ein 210 bp großes BglII/HindIII-Fragment durch 6%ige Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment enthält das 3'-Ende der RMP-cDNA aus der BglII-Schnittstelle bei Aminosäuren 297-299 und erstreckt sich über das TAA-Terminationscodon bis zum eingefügten HindIII-Linker.
Der 5'-Teil der RMP-cDNA wurde aus pRMP1016 als ein 997 bp großes HindIII/BglII-Fragment durch 1 %ige Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Die HindIII-Schnittstelle ist auf der RMP-DNA in einer Position lokalisiert, die den Resten -36, -35 in dem Prosegment entspricht. Das 997 bp große 5'-Fragment wurde mit dem 210 bp großen 3'-Fragment in, mit HindIII verdautes und mit Phosphatase behandeltes pIC 19R ligiert. Mit dieser Ligationsmischung wurden Rekombinanten von E. coli und ein korrektes Plasmid, pRMP, erhalten, wobei der 5'-Teil von RMP, verbunden mit dem 3'-Teil, durch Restriktionsenzym-Analyse identifiziert wurde. Die Konstruktion von pRMP wird in 5 veranschaulicht. pRMP kodiert nicht die RMP-Präregion und die 5'-Hälfte des Prosegments.
Beispiel 4
Konstruktion eines Aspergillus-Expressionsvektors, entworfen, um eine Sekretion von aktiver RMP zu erhalten
In diesem Beispiel wurde ein Plasmid konstruiert, das entworfen wurde, um RMP unter der Kontrolle des Glucoamylase-Promotors, von Signal- und Terminator-Sequenzen zu exprimieren. Der Glucoamylase-Promotor und die Terminator-Sequenzen wurden von dem genomi schen Glucoamylase-Gen, das in den Vektor pCAMG91 kloniert wurde, abgeleitet. Die Konstruktion von pCAMG91 wird durch Boel et al. (EMBO Journal 3, 1581-1585, 1984) beschrieben, und eine Endonuklease-Restriktionskarte des Plasmids CAMG91 wird in 6 gezeigt.
pCAMG91 wurde mit den Restriktionsendonukleasen SalI und PstI verdaut. Aus einem solchen Verdau wurde ein 698 bp großes Fragment auf einem Agarosegel isoliert. Dieses SalI-PstI-Fragment enthält die Region, welche den 140 bp großen, nicht-translatierten 3'-Teil der Glucoamylase-mRNA plus 540 bp 3' zu der Poly(A)-Additionsstelle kodiert. Dieses 3'-Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um stumpfe Enden an den Restriktionsstellen vor Zugabe von XbaI-Linkern und dem Verdau mit dem XbaI-Restriktionsenzym zu erzeugen. Dieses 3'-Ende des Glucoamylase-Gens wurde in pUC 13 ligiert, der mit XbaI linearisiert worden war, um das Plasmid pAMG/Term zu erzeugen, das die Poly(A)-Additionsregion des Glucoamylase-Gens enthielt. Die Konstruktion von pAMG/Term wird in 7a veranschaulicht.
Das 3'-Ende des Glucoamylase-Gens von A. niger wurde als ein 700 bp großes XbaI-Fragment aus pAMG/Term erhalten. Dieses Terminator-Fragment wurde in, mit XbaI verdautes und mit Phosphatase behandeltes pC19R ligiert. Mit dieser Ligationsmischung wurden Rekombinanten von E. coli erhalten, und ein korrektes Plasmid, pICAMG/Term, bei dem das 5'-Ende des Terminator-Fragments der HindIII-Schnittstelle der multiplen Klonierungsstelle des pIC19R-Vektors gegenüberliegt, wurde durch Restriktionsenzym-Analyse identifiziert. Die Konstruktion von pICAMG/Term wird in 7a veranschaulicht. Aus pICAMG/Term wurde die Glucoseamylase-Terminator (AMG-Terminator)-Region als ein a 750 bp großes HindIII/Clal-Restriktionsfragment durch 1 %ige Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Aus pCAMG91 wurde der Glucoamylase-Promotor (AMG-Promoter) zusammen mit Regionen, welche das Glucoamylase-Signalpeptid, das Hexapeptid-Prosegment und das pBR322-Ampicillinresistenz-Gen (Amp) kodieren, als ein 3,5 kb großes ClaI/BssHII-Fragment durch 1%ige Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Ein synthetischer BssHII/HindIII-Linker wurde aus zwei synthetischen 31-mer Oligonukleotiden, die mit einem DNA-Syntheseapparat von Applied Biosystems Inc. synthetisiert wurden, hergestellt. Der synthetische Linker weist folgende Struktur auf:
Dieser Linker wurde in einer Ligationsreaktion mit dem 3,5 kb großen, Glucoamylase enthaltenden Fragment und dem 750 bp großen, den Glucoamylase-Terminator enthaltenden Fragment verwendet. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und eine korrekte Rekombinante, p673, wurde durch Restriktionsendonuklease-Verdau identifiziert. Bei dem isolierten p673 handelt es sich um einen HindIII-Klonierungsvektor, in den ein geeignetes HindIII-cDNA-Fragment zwischen das Glucoamylase-Hexapeptid-Prosegment und die Glucoamylase-Transkriptionsterminator-Region eingefügt werden kann. Die eingefügte cDNA wird unter der transkriptionellen Kontrolle des Glucoamylase-Promotors stehen, und eine Sektretion des translatierten Fusionsprodukt wird durch das Glucoseamylase-Signalpeptid plus dem Glucoamylase-Hexapeptid-Prosegment gesteuert. p673 wurde mit HindIII verdaut, mit alkalischer Posphatase behandelt und mit einem 1,2 kb HindIII-Fragment, gereinigt aus einem Verdau von pRMP, ligiert.
Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und eine Rekombinante, p686, bei der die RMP-cDNA in der korrekten Orientierung eingefügt worden war, um eine RMP-Expression zu erreichen, wurde isoliert und durch Restriktionsendonuklease-Verdaus charakterisiert. p686 kodiert ein RMP-Vorläufermolekül mit der folgenden Struktur: Glucoamylase-Signalpeptid, Glucoamylase-Hexapropeptid, Aminosäuren -45 bis -1 des Propeptids von RMP, 361 Aminosäuren des reifen RMP. Die Konstruktion von p686 wird in 7b veranschaulicht.
Beispiel 5
In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung sollte das offene Leseraster von präpro-RMP in ein Expressionsplasmid unter der Kontrolle des Promotors des Glucoamylase-Gens von A. niger oder des TAKA-Amylase-Gens von A. oryzae eingefügt sein. Um dies zu erreichen, wird eine BamHI-Restriktionsendonuklease-Schnittstelle genau 5' zum Methionin-Start-Codon des Signalpeptids von präpro-RMP durch die folgenden Schritte eingefügt.
pRMP1016 wurde mit dem Restriktionsenzym DdeI, das die cDNA in einer Position schneidet, die den Aminosäureresten Ser(-66) und Gln(-65) entspricht, und mit HindIII, das die cDNA in einer Position schneidet, die den Aminosäureresten Lys(-36) und Leu(-35) entspricht, verdaut. Das daraus hervorgehende 89 bp große DdeI/HindIII-Fragment wurde auf einem 8%igem Polyacrylamidgel gereinigt, elektroeluiert und nach Phenol- und CHCl₃-Extraktionen mit Ethanol präzipitiert. Ein synthetisches DNA-Fragment mit der folgenden Sequenz wurde als zwei Ologonukleotide in einem DNA-Syntheseapparat von Applied Biosystems Inc. synthetisiert:
Dieses Fragment weist ein mit BamHI geschnittenes kohäsives Ende 5' zu dem Met-Start-Codon und ein mit DdeI geschnittenes kohäsives Ende am 3'-Ende auf. Die beiden Oligonukleotide wurden mit ATP und T4-Polynukleotidkinase einer Kinasereaktion unterzogen, einander angelagert und dann mit dem 89 bp großen DdeI/HindIII-RMP-Fragment, gereinigt aus pRMP 1016, in einen, mit BamHl/HindIII verdauten pUC 13-Vektor ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren, und korrekte Rekombinanten wurden durch Restriktionsenzym-Verdaus von durch Miniprep gereinigten Plasmiden identifiziert. Korrekte rekombinante Plasmide wurden sequenziert, um die Sequenz der verwendeten Oligonukleotide zu verifizieren. Ein solches korrektes Plasmid, pRMP5', wurde mit BamHI und HindIII verdaut, und ein 110 bp großes BamHI/HindIII-Fragment mit dem Met-Start-Codon, dem RMP-Signalpeptid und einem Teil des RMP-Prosegments wurde durch 10%ige Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Das Fragment wurde elektroeluiert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Der Rest des offenen Leserasters von RMP und die AMG-Terminanor-Sequenzen wurden aus dem Plasmid p686 nach Verdau mit EcoRI und partiellem HindIII-Verdau erhalten. Hierdurch wurde ein 1,9 kb großes Fragment freigesetzt, und dieses Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese, Elektroelution, Phenol- und CHCl₃-Extraktion vor Ethanolpräzipitation gereinigt. Dieses 1,9 kb große Fragment wurde mit dem 110 bp großen BamHI/HindIII-Fragment von pRMP5' in einen pUC 13-Vektor ligiert, der mit BamHI und EcoRI verdaut worden war. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren, und korrekte Rekombinanten wurden durch Restriktionsenzym-Verdaus von Miniprep-gereinigten Plasmiden identifiziert. Eine solche korrekte Rekombinante war pRMPAMGTerm. Die Konstruktion von pRMPAMGTerm wird in 8 veranschaulicht.
Beispiel 6
Konstruktion eines Aspergillus-Expressionsvektors, entworfen, um eine Sekretion von aktiver RMP in A. oryzae mittels des Glucoamylase-Promotors von Aspergillus niger zu erhalten
Der Glucoamylase-Promotor wurde wie folgt isoliert. 25 μg von pCAMG91 wurden mit den Restriktionsendonukleasen EcoRl und BssHII verdaut. Nach diesem Doppelverdau konnte ein 270 bp großes DNA-Fragment durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert werden. Dieses Fragment deckt einen Teil der Promotor-Region, der nicht-translatierten 5'-Region und des Signalpeptids des Glucoamylase-Gens (AMG-Gen) ab. Nach Elektroelution der DNA aus dem Agarosegel wurde das Fragment durch Phenol- und CHCl₃-Extraktionen vor Ethanolpräzipitation gereinigt. Das 270 bp große Fragment wurde dann mit SfaNI verdaut. Dieses Enzym weist eine Spaltungsstelle genau 5' zu dem ATG-Methionin-Start-Codon des Glucoamylase-Gens auf. Nach vollständigem Verdau wurde die DNA mit dem großen Fragment (Klenow) der DNA-Polymerase I und allen vier dNTPs behandelt, um stumpfe DNA-Enden zu erzeugen. Dieser DNA wurden BglII-Linker mit DNA-Ligase angefügt, und die DNA wurde mit einem Überschuß des Restriktionsenzyms BglII verdaut. Nach Auftrennung der DNA-Fragmente auf einem 10%igem Polyacrylamidgel konnte ein 175 bp großes BglII-Fragment durch Elektroelution isoliert werden. Dieses Fragment weist einen BglII-Linker auf, der in einer Position eingefügt ist, die der SfaNI-Restriktionsstelle genau 5' zu dem Methionin-Start-Codon entspricht. Dieses DNA-Stück wurde in einen, mit BglII verdauten, mit alkalischer Phosphatase behandelten pIC 19R-Vekor ligiert, und die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren. Unter den hervorgehenden Transformanten wurden korrekte Plasmide durch Restriktionsenzym-Verdaus von Miniprep-Plasmiden identifiziert. Ein solches korrektes Plasmid, pB404.1, wurde mit NsiI und BglII verdaut, um ein 0,16 kb großes Fragment freizusetzen, das die nicht-translatierte 5'-Region des Glucoamylase-Gens gemeinsam mit ungefähr 100 bp des 3'-Teils der Promotor-Region enthielt. Dieses Fragment wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt, elektroeluiert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Um dieses Fragment mit dem verbleibenden Teil der Glucoamylase-Promotor-Region von pCAMG91 zu verbinden, wurden die folgenden Schritte durchgeführt. 25 μg pCAMG91 wurden mit BssHII verdaut und dann mit NdeI teilweise weiterverdaut. Nach Auffüllen der Fragmentenden mit allen vier dNTPs und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase wurde ein 1,4 kb großes DNA-Fragment auf einem 1%igen Agarosegel isoliert. Dieses Fragment enthielt alle Sequenzen der Promotor-Region gemeinsam mit der nicht-translatierten 5'-Region und der Region, die das Signalpeptid kodiert. Das Fragment wurde elektroeluiert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert, um die DNA zu konzentrieren. Nach Verdau mit NsiI wurde die DNA auf einem 1%igen Agarosegel laufen gelassen, und ein 1,2 kb großes NdeI-NsiI-Fragment wurde durch Elektroelution isoliert. Diese DNA hatte in einer früheren Reaktion ein stumpfes Ende an der NdeI-Schnittstelle ergeben, und sie wurde nun mit dem 0,16 kb große NsiI-BglII-Fragment von pB401.1 in einen, mit NruI-BglII verdauten pIC19R-Vektor ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren, und unter den hervorgehenden Transformanten wurden korrekte Rekombinanten durch Restriktionsenzym-Verdaus von Miniprep-Plasmiden identifiziert. Eine solche korrekte Rekombinante, pB408.3, wurde mit HindIII und BglII verdaut, und der Glucoamylase (AMG) -Promotor wurde als ein 1,4 kb großes Fragment auf einem 1 %igen Agarosegel isoliert. Das Fragment wurde elektroeluiert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Dieses Glucoamylase-Promotor-Fragment wurde dann mit einem 2,0 großen BamHI-EcoRI-Fragment von pRMPAMGTerm (siehe Beispiel 5) in einen, mit HindIII-EcoRI verdauten pUC19-Vektor ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren, und unter den hervorgehenden Transformanten wurden korrekte Rekombinanten durch Restriktionsenzym-Verdaus von Miniprep-Plasmiden identifiziert. Eine derartige korrekte Rekombinante, p778, wurde im Großmaßstab zur Isolierung von rekombinantem Plasmid wachsen gelassen, und die Plasmid-Präparation wurde durch CsCl/Ethidiumbromid-Zentrifugation gereinigt. Dieses Plasmid steuert die Synthese von RMP unter der Kontrolle des Glucoamylase-Promotors und von Terminator-Sequenzen. Die Konstruktion von p408.3 wird in 9a veranschaulicht, und die Konstruktion von p778 wird in 9b veranschaulicht.
Beispiel 7
Konstruktion eines Aspergillus-Eyressionsvektors, entworfen, um eine Sekretion von aktiver RMP mittels des TAKA-Amylase-Promotors von Aspergillus oryzae zu erhalten
50 μg des Plasmids pTAKA17 (siehe Beispiel 2), welches das genomische TAKA-Amylase-Gen von Aspergillus oryzae enthält, wurde mit SalI verdaut. Dieses Enzym weist eine Restriktionsstelle in der genomischen DNA in einer Position auf, die dem Aminosäurerest 26 der reifen TAKA-Amylase entspricht. Eine weitere SalI-Restriktionsstelle befindet sich ungefähr 1300 Nukleotide stromaufwärts von dieser Position, das heißt am 5'-Ende der stromaufwärts gelegenen Promotor-Region. Nach Verdau mit SalI wurde dieses, den 1300 bp großen Promotor enthaltende Fragment durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, und die DNA wurde durch Phenol- und CHCl₃-Extraktionen gereinigt und mit Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde dann in Exonuklease III-Puffer gelöst und mit Exonuklease III gemäß Henikoff, S. (Gene 28, 351-359, 1984) verdaut. Die Reaktion wurde abgestoppt, um ungefähr 130 bp große Deletionen an jedem Ende der DNA zu erhalten. Die Deletion von ungefähr 130 bp von der SalI-Schnittstelle der kodierenden Region des TAKA-Amylase-Gens machte es auf diese Weise möglich, Linker mit multiplen Klonierungsstellen genau stromaufwärts des Methionin-Start-Codon einzuführen. Die mit Exonuklease III behandelte DNA wurde mit Sl-Nuklease gemäß Henikoff, S. (Gene 28, 351-359, 1984) verdaut und mit Ethanol nach Phenol- und CHCl₃-Extraktionen präzipitiert. Eine Reparatur der mit Sl-Nuklease behandelten DNA, um ligierbare stumpfe Enden zu erhalten, wurde mit allen vier dNTPs und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I nach Henikoff, S. (Gene 28, 351-359, 1984) durchgeführt. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI, das in dem 1300 bp großen SalI-Fragment einmal schneidet, verdaut, um zwei Gruppen von Fragmenten zu erzeugen. Eine Gruppe war ungefähr 380 bp groß und stellte die stromaufwärts gelegenen Regionen dar, während die andere Gruppe ungefähr 620 bp groß war und die Promotor-Region enthielt. Diese Gruppen von mit EcoRI verdauten Produkten wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt, und die ungefähr 620 bp großen DNA-Fragmente wurden elektroeluiert und in einen, mit EcoRI/SmaI verdauten pUC19-Vektor ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente E. coli-Zellen zu transformieren, und Miniprep-Plasmid-DNA wurde aus den Rekombinanten isoliert. Diese Deletionsmutanten wurden durch Restriktionsenzym-Verdaus charakterisiert, um Plasmide mit Deletionsendpunkten genau 5' zu dem Methionin-Start-Codon zu identifizieren. Ein paar Kandidaten mit den gewünschten Merkmalen wurden sequenziert, und eine Mutante (p9), die eine 9 bp große Deletion 5' zu dem A im ATG-Methionin-Codon aufwies, wurde für weitere Konstruktionen ausgewählt. p9 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut, und ein 645 bp großes, den TAKA-Amylase-Promotor enthaltendes Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. pTAKA 17 wurde mit SalI und EcoRI verdaut, und ein 510 bp großes Fragment, das die stromaufwärts gelegenen TAKA-Amylase-Promotor-Regionen enthielt, wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Diese beiden Promotor-Regionen wurden aneinander und in einen pIC19R-Vektor ligiert, der mit SalI und HindIII verdaut worden war. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren, und korrekte Rekombinanten wurden durch Restriktionsenzym-Verdau von Plasmiden, die als Minipreps extrahiert wurden, identifiziert. In einer solchen Rekombinanten, p719, wurde die TAKA-Amylase-Promotor-Region von Aspergillus oryzae als ein 1,1 kb großes, ortsveränderliches Fragment gefunden, das durch eine Reihe verschiedener Restriktionsenzym-Verdaus ausgeschnitten werden kann. Die Konstruktion von p719 wird in 10 veranschaulicht.
Aus pRMPAMGTerm wurden das offene Leseraster von präpro-RMP und die Glucoamylase-Terminator-Region (AMGTerm) als ein 2 kb großes Fragment nach Verdau mit BamHI und EcoRI isoliert. Dieses Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese, Phenol- und CHCl₃-Extraktionen gereinigt und dann durch Ethanolpräzipitation konzentriert. Der Promotor aus der TAKA-Amylase von A. oryzae wurde nun als ein 1,1 kb großes Fragment, das nach Verdau von p719 mit SalI und BamHI erhalten wurde, isoliert. Dieses Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese, Phenol- und CHCl₃-Extraktionen gereinigt und dann mit Ethanol präzipitiert. Das 1,1 kb große Promotor-Fragment wurde mit dem 2 kb großen BamHI/EcoRI-Fragment aus pRMPAMGTerm in einen pUC19-Vektor ligiert, der mit SalI und EcoRI verdaut worden war. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren, und unter den hervorgehenden Transformanten wurden korrekte Rekombinanten mit Restriktionsenzym-Verdau von Miniprep-Plasmiden identifiziert. Eine solche korrekte Rekombinante, p777, wurde im Großmaßstab zur Isolierung von rekombinantem Plasmid wachsen gelassen, und die Plasmid-Präparation wurde durch CsCl/Ethidiumbromid-Zentrifugation gereinigt. Die Konstruktion von p777 wird in 11 veranschaulicht.
Beispiel 8
Konstruktion eines Aspergillus-Experessionsvektors, entworfen, um eine Sekretion der Rhizomucor miehei-Lipase unter Kontrolle des Aspergillus oryzae-TAKA-Amylase-Promotors zu erhalten
Konstruktion und Identifizierung eines Lipase-cDNA-Klons in E. coli
Um Information zu erhalten, welche die Konstruktion einer spezifischen Oligonukleotid-Sonde ermöglichen, wurde eine partielle Sequenzbestimmung an der gereinigten Rhizomucor miehei-Lipase (Moskowitz, G.J. et al., J. Agric. Food Chem. 25, 1146-1150, 1977) vorgenommen. Im folgenden Text wird die Abkürzung RML für die Rhizomucor miehei-Lipase verwendet. Der Überstand eines Kulturnährmediums von Rhizomucor miehei, aus dem Myzelien und Substanzen mit geringem Molekulargewicht entfernt worden waren, ist einer Anionenaustauschchromatographie unterzogen worden. Die lipolytische Hauptfraktion von der Säule wurde entsalzt und vor einer Lyophylisierung ultrafiltriert. Das lyophylisierte Pulver wurde dann einer Affinitätschromatographie unterzogen. Die vereinigten Lipasefraktionen von der Säule wurden entsalzt und durch Ultrafiltration konzentriert. Dieses Konzentrat wurde dann einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) unterzogen, und die Lipase aus der HIC-Reinigung wurde zur Aminosäuresequenzbestimmung verwendet. Die Sequenzbestimmung wurde sowohl mit dem nativen Enzym (N-terminale Sequenz) als auch mit ausgewählten Fragmenten, die nach proteolytischem Verdau der Lipase mit Armillaria mellea-Protease erhalten worden waren, durchgeführt. Die Sequenzbestimmung wurde mit einem Gasphasensequenzierapparat (Applied Biosystems Model 470A) durchgeführt, wie von Thim, L. et al. (FEBS Lett. 1987, im Druck) beschrieben.
RML wurde mit Armillaria mellea-Protease, wie von Moody et al. (FEBS Lett. 172, 142-148, 1984) beschrieben, verdaut, mit der einzigen Ausnahme, daß das Verhältnis von Enzym zu Substrat 1:40 (Mol:Mol) betrug. Die erhaltenen Fragmente wurden durch HPLC aufgetrennt, und die UV-Absorption wurde bei 280 nm und 214 nm überwacht. Um geeignete Fragmente für die Konstruktion von Oligonukleotid-Sonden zu identifizieren, wurden nur solche Peptide sequenziert, die ein großes Verhältnis zwischen 280 nm und 214 nm zeigten, da diese Fragmente Trp und/oder Tyr enthalten.
Die folgende N-terminale Sequenz wurde unter Verwendung der nativen RML gefunden:
Eines der aus dem proteolytischen Verdau isolierten Fragmente wies die folgende Sequenz auf: Arg-Thr-Val-Ile-Pro-Gly-Ala-Thr-Trp-Asp-X-Ile-His, und dieses Fragment wurde für die Synthese einer spezifischen Oligonukleotid-Sonde verwendet.
Die Rhizomucor miehei-cDNA-Bibliothek aus Beispiel 3, die zur Isolierung der Aspartat-Proteinase (RMP) -Rekombinanten dieses Organismus konstruiert worden war, wurde auch zur Identifizierung von Lipase-spezifischen Rekombinanten verwendet. Ein Gemisch von Oligonukleotiden wurde mit einem DNA-Syntheseapparat von Applied Biosystems Inc. synthetisiert. Das Gemisch wies folgende Struktur auf:
wobei die Oligonukleotide zu der RML-mRNA in einer Region, welche die Aminosäuren Gly-Ala-Thr-Trp-Asp kodierte, komplementär waren. Dieses Pentapeptid wurde als ein Segment einer Aminosäuresequenz identifiziert, die aus proteolytischen Fragmenten des gereinigten RML-Proteins (siehe oben) erhalten wurden.
Die Rhizomucor miehei-cDNA-Bibliothek wurde mit dem Gemisch aus, mit ³²P-Kinase behandelten Lipase-Oligonukleotiden, das für das Durchmustern mit dem RMP-spezifischen Gemisch beschrieben wurde, durchgemustert. Eine Hybridisierung und ein erstes Waschen der Filter wurde bei 43°C durchgeführt. Nach einer Autoradiographie wurden die Filter bei 47°C gewaschen. Kolonien, die eine starke Hybridisierung zeigten, wurden isoliert, und die in die entsprechenden Plasmide eingefügten cDNAs wurden sequenziert, um RML-spezifische Rekombinanten zu identifizieren. Zwei derartige Rekombinanten, p353.7 und p353.16, wiesen Inserts von etwa 1,2 kb auf. Die DNA-Sequenz, die aus diesen beiden Rekombinanten erhalten wurde, beginnt in der Mitte des Signalpeptides (siehe 12) und erstreckt sich bis zum Poly-A-Schwanz. In dieser Region konnte ein großes offenes Leseraster identifiziert werden. Da die beiden Rekombinanten keine Sequenz für den 5'-Teil eines Signalpeptides mit seinem Methionin-Start-Codon enthielt, wurde ein synthetisches Oligonukleotid (584)
synthetisiert. Dieses Oligonukleotid 584 ist zu der RML-mRNA in einer Region, welche die Aminosäuresequenz Pro-Pro-Leu-Ile-Pro-Ser-Arg, die in der Propeptid-Region gefunden wird, kodiert, komplementär (siehe 12). Nachdem das Oligo 584 für eine hohe spezifische Aktivität einer Kinasereaktion mit T4-Polynukleotidkinase und ³²P-γ-ATP unterzogen worden war, wurde dieses Oligo in einer Primer-Verlängerungsreaktion („primer extention") an Rhizomucor miehei-mRNA mit AMV-reverser Transkriptase nach veröffentlichten Verfahren verwendet (Boel, E. et al., PNAS USA, 80, 2866-2869, 1983). Die Produkte der Primer-Verlängerungsreaktion wurden einer Elektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamid-Harnstoff-Gel unterzogen, und zwei cDNA-Produkte wurden aufgetrennt. Diese beiden cDNAs, eines mit einer Größe von 150 Nukleotiden und das andere mit einer Größe von 160 Nukleotiden, wurden beide elektroeluiert und durch das chemische Abbauverfahren zur DNA-Sequenzierung sequenziert. Beide cDNAs ergaben eine lesbare Sequenz, die sich von der Primer-Region bis zu einer Position, die 9 Nukleotide 5' zu einem Methionin-Start-Codon entfernt lag, erstreckte. Die Sequenz bestätigte die Sequenz, die von den rekombinanten Lipase-cDNA-Plasmiden erhalten worden war. Die Größe der beiden cDNA-Produkte aus der Primer-Verlängerungreaktion zeigte, daß das 5'-Ende (CAP-Stelle) der Lipase-mRNA ungefähr 5 oder 15 Nukleotide 5' zu dem ersten A-Nukleotid lokalisiert sein wird, wie in 12 gezeigt. Eine Mikroheterogenität der Lage des 5'-Endes von mRNAs aus Pilzen ist sehr häufig. Indem man die Sequenz, die von den zwei geklonten cDNAs p353.7 und p353.16 erhalten worden war, mit der Sequenz aus der Primer-Verlängerungsanalyse kombiniert, kann die Aminosäuresequenz eines RML-Vorläufermoleküls etabliert werden. Die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz des RML-Vorläufermoleküls wird in 12 gezeigt. In 12 geben die horizontalen Linien die Positionen von synthetischen Oligos an, die zur cDNA-Synthese und zum Durchmustern der cDNA-Bibliothek verwendet wurden. Ein Pfeil zeigt die Position, in der bei der Reifung der nativen RML eine Prozessierung stattfindet. Die Nukleotide sind von der ersten Base im Met-Start-Codon an numeriert, und Aminosäuren sind vom ersten Rest in der reifen nativen RML an numeriert. Die RML wird durch ein offenes Leseraster kodiert, das sich von einem Met-Start-Codon über 363 Codons erstreckt, bevor ein Stop-Codon erreicht wird. In diesem Vorläufermolekül würden die ersten 24 Aminosäurereste ein typisches hydrophobes Signalpeptid aufbauen. Gemäß der produktiven Regeln von Heijne (Eur. J. Biochem. 133, 17-21, 1983) würde das Signalpeptid von dem nachfolgenden Propeptid durch eine Signalpeptidase-Spaltung zwischen den Ala- und Val-Resten in den Positionen -71 bzw. -70 abgespaltet werden.
Da die N-terminale Aminosäuresequenzanalyse von gereinigter RML, die aus dem Kulturüberstand von Rhizomucor miehei erhalten wurde, Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg als den N-Terminus des aktiven RML-Enzyms identifizierte, bestand das Propeptid des RML-Vorläufermoleküls aus den nächsten 70 Aminosäureresten in dem Vorläufermolekül. Beginnend mit diesem N-terminalen Ser-Rest erstreckt sich die reife RML über 269 Reste, bevor ein Terminations-Codon erreicht wird. In diesem reifen, 29.500 Dalton großen Enzym ist eine Lipase-Substratbindungsstelle um den Rest Ser(144) lokalisiert, die in einer Reihe von Lipasen konserviert ist. An dem 3'- Ende der RML-mRNA waren 104 Nukleotide als eine nichttranslatierte Region zwischen dem TAA-Stop-Codon und dem Poly(A)-Schwanz lokalisiert. 23 Nukleotide 5' zu diesem Poly(A)-Schwanz wurde eine entsprechende Struktur, die aus 7 AT-Basenpaaren bestand, gefunden, während kein typisches eukaryotisches Polyadenylierungssignal identifiziert werden konnte.
In einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wurde eine Reihe von Änderungen an der RML-cDNA vorgenommen. Diese Änderungen umfaßten ein Entfernen der G:C-Schwänze, die während der Klonierung an die cDNA angefügt worden waren, und ein Anfügen von Restriktionsendonukleasestellen 5' und 3' zum offenen Leseraster. Eine Reihe herkömmlicher Restriktionsstellen wurden ebenfalls in die Signalpeptid- und Propeptid-Regionen der cDNA eingeführt.
p353.16 wurde mit FnuDII verdaut, und ein 880 bp großes DNA-Fragment (das 3'-Ende der RML-cDNA) wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Das Fragment wurde elektroeluiert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert.
Dieses 3'-Ende der RML-cDNA wurde dann in einen pUC19-Vektor ligiert, der mit SmaI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um kompetente E. coli-Zellen zu transformieren, und unter den erzeugten Transformanten wurden korrekte Rekombinanten durch Restriktionsenzym-Verdau von Miniprep-Plasmiden identifiziert. Eine solche geeignete Rekombinante, p435.2, wurde mit BanII und HindIII verdaut, und ein 0,69 kb großes Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Das Fragment wurde elektroeluiert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Dieses Fragment der RML-cDNA wies nun einen Hauptteil der multiplen Klonierungsstelle von pUC 19, verbunden mit ihrer nicht-translatierten 3'-Region, auf.
Das 5'-Ende der RML-cDNA wurde unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide neu entworfen, um herkömmliche Restriktionsstellen einzuführen. Die DNA-Sequenz des synthetischen Fragments (RML 5') wird in 14 gezeigt. Die Position von eingeführten Restriktionsstellen und die Verbindungsstellen der individuell synthetisierten Oligonukleotide werden durch horizontale, d. h. vertikale/horizontale Linien angegeben. Das hervorgehende Fragment (RML 5') wurde vor weiteren Ligationsreaktionen als ein 150 bp großes Fragment auf einem 2%igen Agarosegel gereinigt, elektroeluiert, mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und mit Ethanol präzipitiert.
p353.7 wurde mit BanI und BanII verdaut, und ein 387 bp großes RML-Fragment wurde durch 10%ige Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Das Fragment wurde elektroeluiert, vor einer Ethanolpräzipitation mit Phenol und CHCl₃ extrahiert und dann mit dem synthetischen RML 5'-Fragment und dem 0,69 kb großen BanII/HindIII-Fragment aus p435.2 in einen, mit BamHI/HindIII verdauten pUC13-Vektor ligiert. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um kompetente E.coli-Zellen zu transformieren, und unter den hervorgehenden Transformanten wurden korrekte Rekombinanten durch Restriktionsenzym-Verdaus von Miniprep-Plasmiden identifiziert. In einer solchen korrekten Rekombinanten, pB544, wurde der synthetische Teil sequenziert, um die erwartete Struktur zu bestätigen. Die Konstruktion von pB544 wird in 13a dargestellt. Aus pB544 wurde die präpro-RML-cDNA als ein 1,2 kb großes BamHI-Fragment durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Ein Expressionsvektor auf der Grundlage des Promotors des TAKA-Amylase-Gens von Aspergillus oryzae und des Terminators des Glucoamylase-Gens von Aspergillus niger wurde wie folgt hergestellt. p719 (siehe Beispiel 7) wurde mit SalI und BamHI verdaut. Das hervorgehende 1,1 kb große TAKA-Amylase-Promotor-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. pI-CAMG/Term (siehe Beispiel 4) wurde mit BamHI und EcoRI verdaut. Das hervorgehende 0,75 kb große Glucoamylase-Terminator-Fragment wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt. Nach Phenol- und CHCl₃-Extraktionen wurden diese beiden Fragmente mit Ethanol präzipitiert und in einen, mit SalI/EcoRI verdauten pUC19-Vektor ligiert. Die Ligationsreaktion wurde verwendet, um E. coli-Zellen zu transformieren, und unter den hervorgehenden Transformanten wurden korrekte Rekombinanten durch Restriktionsenzym-Verdau von Miniprep-Plasmiden identifiziert. Eine solche korrekte Rekombinante, p775, wurde mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das 1,2 kb große BamHI-RML-präpro-cDNA-Fragment aus pB544 wurde in diesen p775-Vektor ligiert, und damit wurden E. coli-Zellen transformiert. Eine Rekombinante, p787, bei der die RML-präpro-DNA in der korrekten Orientierung zwischen Promotor und Terminator eingefügt worden war, wurde durch Restriktionsenzym-Verdaus von Miniprep-Plasmiden, extrahiert aus E. coli-Transformanten, identifiziert. p787-Plasmid-DNA wurde im Großmaßstab vermehrt, und die Plasmid-Präparation wurde durch CsCl/Ethidiumbromid-Zentrifugation gereinigt. Die Konstruktion von p787 wird in 13b veranschaulicht.
Beispiel 9
Transformation von Aspergillus oryzae (allgemeines Verfahren)
100 ml von YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) wurden mit Sporen von A. oryzae IFO 4177 oder argB-Mutanten davon angeimpft und unter Schütteln ungefähr 2 Tage bei 37°C inkubiert. Das Myzel wurde durch Filtration durch Miracloth-Filter geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSOa gewaschen. Das Myzel wurde in 15 ml 1,2 M MgSO₄, 10 mM NaH₂PO₄, pH-Wert = 5,8 suspendiert. Die Suspension wurde auf Eis gekühlt, und 1 ml Puffer, der 120 mg Novozym 234, Charge 1687, enthielt, wurde hinzugefügt. Nach 5 Minuten wurde 1 ml von 12 mg/ml BSA (Sigma-Typ H25) zugesetzt, und die Inkubation wurde mit sanftem Schütteln 1,5-2,5 Stunden bei 37°C fortgesetzt, bis eine große Anzahl von Protoplasten in einer Probe, die unter dem Mikroskop untersucht wurde, sichtbar war.
Die Suspension wurde durch Miracloth-Filter gefiltert, das Filtrat wurde in ein steriles Röhrchen überführt und mit 5 ml 0,6 M Sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH-Wert = 7,0 überschichtet. Es wurde eine Zentrifugation für 15 Minuten bei 1000g durchgeführt, und die Protoplasten wurden vom oberen Bereich des MgSO₄-Kissens gewonnen. Zwei Volumen STC (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert = 7,5, 10 mM CaCl₂) wurden der Protoplasten-Suspension zugesetzt, und die Mischung wurde 5 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Das Protoplasten-Pellet wurde in 3 ml STC resuspendiert und erneut pelletiert. Dies wurde wiederholt. Schließlich wurden die Protoplasten in 0,2-1 ml STC resuspendiert.
100 μl der Protoplasten-Suspension wurden mit 5-25 μg der entsprechenden DNA in 10 μl STC gemischt. Protoplasten der argB-Stämme wurden mit DNA von pSa143 (ein, das argB-Gen von A. nidulans tragendes Plasmid) gemischt, und Protoplasten der argB⁺-Stämme wurden mit p3SR2 (ein, das amdS-Gen von A. nidulans tragendes Plasmid) gemischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 25 Minuten stehen gelassen. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂ und 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5 wurden zugesetzt, und es wurde sorgfältig gemischt (zweimal), und schließlich wurden 0,85 ml der selben Lösung zugesetzt, und es wurde sorgfältig gemischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 25 Minuten stehen gelassen, bei 2500g 15 Minuten abzentrifugiert, und das Pellet wurde in 2 ml 1,2 M Sorbitol resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentierung wurden die Protoplasten auf den entsprechenden Platten ausgestrichen. Protoplasten der argB-Stämme, die mit pSal43 transformiert waren, wurden auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113, 51-56, 1966) mit Glucose und Harnstoff als Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen, die 1,2 M Sorbitol zur osmotischen Stabilisierung enthielten, ausgestrichen. Protoplasten der argB⁺-Stämme, die mit p3SR2 transformiert waren, wurden auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 51- 56, 1966), die 0,1 M Sucrose, pH = 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl zum Hemmen von Hintergrundwachstum enthielten, ausgestrichen. Nach Inkubation für 4 bis 7 Tage bei 37°C wurden aus den Sporen entwickelte Klone gepickt, in sterilem Wasser suspendiert und zur Vereinzelung von Kolonien ausgestrichen. Dieses Verfahren wurde wiederholt, und Sporen einer Einzelkolonie nach der zweiten Reisolierung wurden als eine definierte Transformante gelagert.
Beispiel 10
Expression von TAKA-Amylase in einem A. oryzae-Wildtyp-Stamm
A. oryzae IFO 4177 wurden mit pTAKA17 durch Cotransformation mit p3SR2, der das amdS-Gen von A. nidulans enthielt, transformiert, wie in Beispiel 9 beschrieben. Protoplasten, hergestellt wie beschrieben, wurden in einem Gemisch gleicher Mengen von pTAKA17 und p3SR2, wobei jeweils ungefähr 5 μg verwendet wurden, inkubiert. 9 Transformanten, die Acetamid als einzige Stickstoffquelle verwenden konnten, wurden zweimal reisoliert. Nach einem Wachstum auf YPD (Sherman et al., 1981) für 3 Tage wurden die Kulturüberstände durch SDS-PAGE analysiert. Die Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue R gefärbt. Die besten Transformanten produzierten 10 bis 20 mal mehr Amylase als untransformierte IFO 4177. Eine Transformante wurde zu weiteren Studien ausgewählt und in einem Kieler-Fermentor mit 2 Liter Fassungvermögen auf 4% Sojabohnenmehl wachsen gelassen und während des Wachstums mit Glucose supplementiert. Die Kultur wurde während der Fermentation heftig geschüttelt. Unter diesen Bedingungen lieferten IFO 4177 ungefähr 1 g/l und die Transformante ungefähr 12 g/l Amylase, bestimmt als Enzymaktivität. Die Enzymaktivität wurde als die Fähigkeit, Stärke abzubauen, gemessen (Cereal Chemistry 16, 712-723, 1939). Die verwendete Stärke war Merck Amylum solubile erg B.6, und der Test wurde bei pH 4,7 und 37°C durchgeführt. Beta-Amylase wurde von außen nicht hinzugefügt.
Beispiel 11
Expression von RMP in A. oryzae
IFO 4177-Zellen wurden mit p777 aus Beispiel 7 oder p778 aus Beispiel 6 durch Cotransformation mit p3SR2 durch das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren transformiert. Die Transformanten wurden selektiert und reisoliert, wie in Beispiel 9 beschrieben.
Die Transformanten wurden 3 Tage in YPD wachsen gelassen, und die Überstände wurden durch SDS-PAGE und nachfolgendes Western Blot-Verfahren und ELISA analysiert. Die Überstände sowohl der Transformanten von p777 als auch von p778 enthielten 50-150 mg/l Protein, das mit einem RMP-Antikörper reagierte. Die Proteinase war im Vergleich zu der von R. miehei produzierten Proteinase überglykosiliert. Es wurden zwei Formen beobachtet, wobei angenommen wird, daß eine davon eine Proform und die andere die prozessierte, reife Proteinase ist. Zwei Transformanten von p778 und drei Transformanten von p777 wurden in einem Fermentor auf die selbe Weise, wie die oben beschriebenen TAKA-Amylase-Transformanten wachsen gelassen. Die beiden Transformanten von p778 lieferten ungefähr 0,2 g/l und 0,4 g/l, und die drei Transformanten von p777 lieferten ungefähr 0,5 g/l, 2,4 g/l und 3,3 g/l RMP, bestimmt als Milchgerinnungsaktivität nach dem Kunitz-Verfahren (Kunitz M., Jour. Gen. Physiol. 18, 459-466, 1935), wobei angenommen wird, daß die spezifische Aktivität des rekombinanten RMP die selbe ist wie die des Rhizomucor miehei-Enzyms. (Dies ist später bestätigt worden.) SDS-PAGE und SDS-PAGE in Verbindung mit Western Blot und ELISA zeigten, daß nur eine Form von RMP vorhanden war, wenn die Kultivierung in einem größeren Maßstab vorgenommen wurde. RMP war auch unter diesen Wachstumsbe dingungen überglykosiliert. Die Proteinmenge, die auf Gelen beobachtet wurde, korrelierte gut mit den Mengen, die aufgrund der Enzymaktivität vorhergesagt wurden.
RMP wurde aus dem Kulturüberstand durch Affinitätschromatographie und Gelfiltration (size exlusion chomatographie) gereinigt.
Die N-terminale Sequenz der gereinigten rekombinanten RMP wurde unter Verwendung eines Gasphasensequenzierapparats wie bei Thim et al. (FEBS Lett. 1987, im Druck) beschrieben, bestimmt.
Es wurden zwei Formen der rekombinanten RMP gefunden, was zeigt, daß die Prozessierung des N-terminalen Endes heterogen war. Eine Form wies die folgende N-terminale Sequenz auf: Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-, und die andere Form wies die folgende N-terminale Sequenz auf: Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-Tyr-Asp-. Eine derartige heterogene Prozessierung am N-Terminus ist auch für die native RMP aus Mucor miehei beschrieben worden (Paquet, D. et al., Neth. Mil. Dairy J. 35, 358-360, 1981). Da die heterogene Prozessierung der rekombinanten RMP gut mit der der nativen RMP korrelierte, ist gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt worden, daß A, oryzae in der Lage ist, rekombinante RMP in der korrekten Region zu prozessieren.
Beispiel 12
Konstruktion einer Expressionseinheit zur Produktion von Prochymosin in A. oryzae
Das Konstrukt enthält das Prochymosin-Gen, dem unmittelbar die Signalpeptidsequenz des TAKA-Amylase-Gens von A. oryzae unter der Kontrolle des TAKA-Amylase-Promotors von A. oryzae vorangeht. Das Konstrukt enthält weiterhin den Terminator des Glukoamylase-Gens von A. niger plus ein E. coli-Replikon.
Ein ungefähr 430 bp großes BamHI/XmaI-Fragment von p285'proC (siehe Beispiel 1) und ein synthetisches Oligomer mit der folgenden Sequenz
wurden in ein, mit EcoRI-XmaI geschnittenes pUC 19-Plasmid eingefügt, wodurch sich das Plasmid pToC50A ergab.
pToC50a wurde mit EcoRI-SacII geschnitten, und das große Fragment, das pUC19 und den 5'-Teil des Prochymosin-Gens (Prochymosin') enthielt, wurden isoliert. Dieses Fragment wurde mit einem 0,6 kb großen EcoRI-BanI-Fragment von pTAKA17 und dem folgenden synthetischen Oligomer
ligiert.
Nach der Transformation mit einem Plasmid pToC51, das den 5'-Teil des Prochymosin-Gens, (Prochymosin'), das mit der Signalsequenz des TAKA-Amylase-Gens von A. oryzae (prä-TAKA) fusioniert war und dem ungefähr 500 bp stromaufwärts vorangingen, enthielt, wurde die TAKA-Amylase-Sequenz isoliert. Die Konstruktion von pToC51 wird in 15a veranschaulicht.
pR26 wurde mit HinfI geschnitten, mit dem großen Fragment (Klenow) der DNA-Polymerase I und den vier dNTPs behandelt und mit XmaI geschnitten. Ein 750 bp großes Fragment, welches das 3'-Ende des Prochymosin-Gens enthielt, wurde isoliert. Um an dem 3'-Ende dieses Fragments eine HindIII-Schnittstelle einzufügen, wurde pUC9 mit XmaI/HincII geschnitten, und das große Fragment wurde mit dem 750 bp großen Fragment, welches das 3'-Ende des Prochymosin-Gens enthielt, ligiert.
Ein 5,6 kb großes EcoRI-ClaI-Fragment von pTAKA17 wurde isoliert und mit einem 2,6 kb großen ClaI-HindIII-Fragment aus dem selben Plasmid plus einem 0,7 kb großen EcoRI-HindIII-Fragment aus pICAMG/Term (siehe Beispiel 4), welches den Terminator und die Poly(A)-Stelle des A. niger-Glucoamylase-Gen enthielt, ligiert. Das hervorgehende Plasmid wird in 15b als pToC52 veranschaulicht.
pToC52 wurde mit HindIII geschnitten und teilweise mit EcoRI geschnitten, und ein 6,4 kb großes Fragment wurde isoliert. Dieses wurde mit einem 0,9 kb großen EcoRI-XmaI- Fragment aus pToC51 und einem 0,7 kb großen XmaI-HindIII-Fragment aus pUC9'PC, das den 3'-Teil des Prochymosin-Gens ('Prochymosin) enthielt, ligiert. Das hervorgehende Plasmid wird pToC56 genannt und wird in 15b dargestellt.
Beispiel 13
Expression von Prochymosin in A. oryzae
A. oryzae IFO 4177 wurden mit pToC56 oder einer argB-Mutante davon durch Cotransformation mit entweder p3SR2 (amdS-Gen) oder pSa143 (argB-Gen) transformiert. Transformanten, die auf Selektivmedium gewachsen waren, wurden zweimal reisoliert, wie in Beispiel 9 beschrieben.
Die Transformanten wurden 3 Tage in YPD wachsen gelassen, und der Prochymosin-Gehalt in den Überständen wurde durch ELISA auf einem Western Blot nach SDS-PAGE analysiert. Die Transformanten produzierten in den Überständen 1-10 mg/l eines immunreaktiven Proteins mit der Größe von Prochymosin. Weitere immunreaktive Proteine wurden in den Überständen nicht nachgewiesen.
Beispiel 14
Expression von RML in A. oryzae
IFO 4177 wurden mit p787 aus Beispiel 8 durch Cotransformation mit p3SR2 durch das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren transformiert. Transformanten wurden selektiert und reisoliert, wie in Beispiel 9 beschrieben.
Die Überstände von YPC-Kulturen der drei Tage lang gewachsenen Transformanten wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Western Blot und ELISA, analysiert. Die beste Transformante produzierte 2 mg/l eines Proteins mit der Größe des reifen RML. Die Lipaseaktivität in den Überständen wurde als die Fähigkeit, Tributyrin zu spalten (NOVO-Method AF 95.1/3-GB) gemessen.
Die Messung bestätigte, daß 2 mg/l aktive Lipase in den Überständen vorhanden waren.
Die Merkmale, die in der vorangegangenen Beschreibung, in den Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbart werden, können sowohl einzeln als auch in jeder Kombination davon Material zum Durchführen der Erfindung in verschiedenen Formen sein.

Claims

Promotor, der zur Expression eines Proteinprodukts in Aspergillus geeignet ist, der die folgende Sequenz aufweist:
dem wahlweise Aktivierungssequenzen stromaufwärts vorangehen.
Promotor und aktivierende Sequenzen stromaufwärts nach Anspruch 1, wobei den aktivierenden Sequenzen stromaufwärts die 1,05 kb große, unsequenzierte Region stromaufwärts von Position 0 bis 1,05 in Plasmid pTAKA17, beherbergt von E. coli DSM 4012, vorangeht.
Promotor und Aktivierungssequenz stromaufwärts nach Anspruch 1, die folgende Sequenz aufweisen: