CN1694953B

CN1694953B - 制备哺乳动物胰蛋白酶的方法

Info

Publication number: CN1694953B
Application number: CN03824737.2A
Authority: CN
Inventors: 兰迪·伯卡; 金伯利·布朗
Original assignee: Novozymes Biotech Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2023-08-29
Also published as: EP1546302A4; ATE439432T1; CN1694953A; US20040043455A1; AU2003273256A1; DK1546302T3; DE60328802D1; EP1546302A1; WO2004020612A1; EP1546302B1

Abstract

本发明涉及在Fusarium venenatum宿主菌株中制备哺乳动物胰蛋白酶的方法，包括(a)在适宜表达所述哺乳动物胰蛋白酶并将其分泌到培养基中的条件下在培养基中培养所述Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株包含含有核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列并与编码尖镰孢胰蛋白酶原的信号肽和原肽的SEQ ID NO：1的核苷酸58-129可操作连接；和(b)从所述培养基中回收所述哺乳动物胰蛋白酶。本发明还涉及包含核酸序列的构建体，所述核酸序列编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列、并与编码尖镰孢胰蛋白酶原的信号肽和原肽的SEQ ID NO：1的核苷酸58-129可操作地连接，以及涉及包含所述构建体的载体和Fusarium venenatum宿主菌株。

Description

制备哺乳动物胰蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及在Fusarium venenatum宿主菌株中制备哺乳动物胰蛋白酶的方法。

背景技术

蛋白水解酶具有广泛的商业应用，并成功地在工业中实现，诸如清洁剂，皮革，化学，农业，药物，食物和乳制品工业。

胰蛋白酶是哺乳动物来源的蛋白水解酶，并可用于商业。例如来自猪胰腺的胰腺胰蛋白酶，可用于食品功能性(functionality)工业以及皮革工业中在中性和碱性条件下软化生皮(hide)和皮肤(skin)。

胰蛋白酶优选在赖氨酸和精氨酸的L-异构体的肽键C-末端侧进行切割。胰蛋白酶被合成为已知具有氨基-末端信号肽以指导分泌胰蛋白酶原的前体，以及沉默酶活性直到其经过蛋白水解被去除并同时活化酶的原肽。所述原肽的切割需要高度特异性丝氨酸蛋白内切酶即肠激酶(enterokinase)(肠肽酶(enteropeptidase))的活化，所述肠激酶通过切割序列(Asp)₄-Lys活化胰蛋白酶原(Lavallie等，1993，Journal of Biological Chemistry268：2331-23317)。

美国专利5,945,328公开了猪胰蛋白酶在米曲霉宿主菌株中的表达。WO 01/55429公开了在大肠杆菌和酵母中制备和纯化重组人胰蛋白酶原以及胰蛋白酶的方法。WO 00/17332公开了在大肠杆菌中重组产生的胰蛋白酶和胰蛋白酶原类似物以及其核酸，所述核酸含有胰蛋白酶原前导序列的修饰，使得所述胰蛋白酶原不能被胰蛋白酶或胰蛋白酶-样酶切割。WO99/10503公开了大肠杆菌中将胰蛋白酶原作为包涵体进行重组制备的方法，其中所述胰蛋白酶原包含不天然存在但被胰蛋白酶的活性形式识别的自我切割位点。然而，微生物系统中哺乳动物胰蛋白酶的表达未在商业水平实现，且因此本领域需要提供微生物中更适宜的表达系统来制备商业量的哺乳动物胰蛋白酶。

本发明的目的是提供在Fusarium venenatum宿主中制备哺乳动物胰蛋白酶的方法。

发明内容

本发明涉及制备哺乳动物胰蛋白酶的方法，所述方法包括：

(a)在适宜表达所述哺乳动物胰蛋白酶并将其分泌到培养基中的条件下在培养基中培养所述Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusariumvenenatum宿主菌株包含含有核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列并与编码尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶原的信号肽和原肽的SEQ ID NO：1的核苷酸58-129可操作连接；和

(b)从所述培养基中回收所述哺乳动物胰蛋白酶。

本发明还涉及核酸序列的构建体，所述核酸序列编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列并与编码尖镰孢胰蛋白酶原的信号肽和原肽的SEQ IDNO：1的核苷酸58-129可操作地连接、以及涉及包含所述构建体的载体和Fusarium venenatum宿主菌株。

附图简述

图1A和1B显示基因组DNA序列以及尖镰孢胰蛋白酶原-样蛋白(分别为SEQID NOS：1和2)的推定的氨基酸序列。

图2A，2B和2C显示猪胰蛋白酶原的cDNA序列和推定的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOS：3和4)。

图3显示pCaHj522的限制酶切图谱。

图4显示pRaMB58的限制酶切图谱。

发明内容

本发明涉及在Fusarium venenatum宿主菌株中制备哺乳动物胰蛋白酶的方法，所述方法包括(a)在适宜表达所述哺乳动物胰蛋白酶并将其分泌到培养基中的条件下在培养基中培养所述Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株包含含有核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列，并且其与编码尖镰孢胰蛋白酶原的信号肽和原肽的SEQ ID NO：1的核苷酸58-129可操作连接；和(b)从所述培养基中回收所述哺乳动物胰蛋白酶。

本发明优选提供在丝状真菌(filamentous fungal)宿主菌株中制备哺乳动物胰蛋白酶特别是猪胰蛋白酶的方法，其中该酶的原前(prepro)形式被正确加工成成熟的活性胰蛋白酶。

术语“胰蛋白酶”定义为催化羧酸酰胺水解的内切肽酶，其优选在Arg或Lys(E.C.3.4.21.4)L-异构体的C末端进行切割。本发明术语“胰蛋白酶”指成熟酶，即活性胰蛋白酶而无氨基末端信号肽和原肽。胰蛋白酶可作为具有指导分泌的氨基-末端信号肽以及原肽被分泌，所述原肽沉默酶活性直到其被去除并同时活化酶。该酶的前体形式已知为胰蛋白酶原。

为本发明的目的，胰蛋白酶活性利用N-α-苯甲酰-L-精氨酸对硝基苯胺hydrochloride作为底物根据Gaertner和Puigserver，1992，Enzyme Microb.Technol.14：150的方法，在25℃利用2mg N-α--苯甲酰-L-精氨酸对硝基苯胺hydrochloride每ml 100mM MOPS缓冲液，4mMCaCl₂，0.01％TritonX-100，pH 7.5测定。所述活性在405nm监测。一个单位的胰蛋白酶活性定义为25℃，pH 6.5时每分钟水解1.0μ摩尔N-α-苯甲酰-L-精氨酸。

哺乳动物胰蛋白酶/胰蛋白酶原

本发明，编码哺乳动物胰蛋白酶或胰蛋白酶原的核酸序列可获自任何哺乳动物来源。与给定来源一起使用的术语“获自”指核酸序列编码的胰蛋白酶通过该来源或插入了来自所述来源的核酸序列的细胞来制备。

用于分离或克隆编码哺乳动物胰蛋白酶或胰蛋白酶原的核酸序列的技术是本领域已知的，并包括从基因DNA分离，从cDNA制备或其组合。多种技术可得，包括例如杂交，聚合酶链式反应(PCR)扩增，或DNA重新合成(de novo DNA synthesis)。所述核酸序列可为基因组，cDNA，RNA，半合成，合成来源或其任何组合。

所述克隆方法可涉及切除并分离所需的核酸片段，所述核酸片段包含编码哺乳动物胰蛋白酶或胰蛋白酶原的核酸序列，将所述片段插入载体分子，以及将所述重组载体掺入Fusarium venenatum宿主菌株，在所述宿主菌株中多拷贝或克隆的核酸序列将被复制。

靶向胰蛋白酶原基因的任何适宜区的寡核苷酸引物可用于基因的PCR扩增。见例如Innis等，1990，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplication，Academic Press，New York。所述PCR扩增包含模板DNA，适宜的酶，引物和缓冲液，并在DNA热循环仪中方便地进行。cDNA可分离自从任何哺乳动物组织构建的文库，所述组织表达胰蛋白酶原基因。在适宜载体诸如质粒或噬菌体构建cDNA文库以便在原核或真核细胞中增殖的方法是本领域已知的。(见例如Sambrook，1989，上文)。例如，自适宜的组织分离mRNA，并合成第一条cDNA链。第二轮(round)DNA链合成用于产生第二条链。所述双链cDNA可克隆入任何适宜的载体，例如质粒等，从而形成cDNA文库。

分离的核酸序列可通过直接化学合成制备，诸如Narang等，1979，Methods of Enzymology 68：90-99的磷酸三酯法；Brown等，1979，Methods ofEnzymology 68：109-151的磷酸二酯法；Beaucage等，1981，TetrahedronLetters 22：1859-1862的二乙基亚啉酰胺(diethylphophoramdite)法；以及Beaucage and Carothers，1981，Tetrahedron Letters 22：1859-1862的固相磷酰胺三酯法。化学合成通常产生单链寡核苷酸，其可通过与互补序列杂交或通过利用单链作为模板与DNA聚合酶发生聚合而被转化成双链DNA。

在优选实施方案中，编码哺乳动物胰蛋白酶或胰蛋白酶原的核酸序列可以是，但不限于下组之一：

胰蛋白酶/胰蛋白酶原登录号

牛胰腺胰蛋白酶原 Genbank X54703

母牛胰腺胰蛋白酶原 Genbank AF453325

狗胰腺胰蛋白酶原 Genbank M11589，M11590

人胰蛋白酶原I Swissprot P07477

人胰腺胰蛋白酶I Genbank M22612

人胰腺胰蛋白酶II Genbank M27602

人胰腺胰蛋白酶原III GenbankX15505

人胰腺胰蛋白酶原Va Genbank X72781

人胰腺胰蛋白酶原IVb Genbank X71345

小鼠胰腺胰蛋白酶 GenbankAB017030，

AB017032

猪胰蛋自酶原 GenbankAAT49878

大鼠胰腺胰蛋白酶原I GenbankV01273

大鼠胰腺胰蛋白酶原II GenbankV01274

大鼠胰腺胰蛋白酶 GenbankJ00778

大鼠胰蛋白酶Va Genbank X59012

大鼠胰蛋白酶Vb Genbank X59013

在更优选的实施方案中，编码的哺乳动物胰蛋白酶或胰蛋白酶原是猪胰蛋白酶原或胰蛋白酶。在最优选的实施方案中，所编码的哺乳动物胰蛋白酶或胰蛋白酶原是猪胰蛋白酶原(Geneseqn AAT49878)。

Fusarium venenatum宿主菌株

本发明的方法中，任何Fusarium venenatum菌株可用作制备哺乳动物胰蛋白酶的宿主菌株。

在优选实施方案中，Fusarium venenatum宿主菌株是Fusariumvenenatum A3/5以及Fusarium venenatum的分类学对等物(无论它们现在已知的种类名称是什么)，Fusariurn venenatum A3/5最初保藏为Fusariumgraminearum ATCC 20334，并且最近由Yoder和Christianson，1998，FungalGenetics and Biology 23：62-80以及O’Donnell等，1998，Fungal Genetics andBiology 23：57-67分类为Fusarium venenatum。

在另一优选实施方案中，Fusarium venenatum宿主菌株是Fusariumvenenatum A3/5或Fusarium venenatum ATCC 20334的形态突变体，如WO97/26330所公开那样。

在另一优选实施方案中，Fusarium venenatum宿主菌株是单端孢霉烯(trichothecene)缺陷的Fusarium venenatum宿主菌株。见例如美国专利6,180,366。

在另一优选实施方案中，Fusarium venenatum宿主菌株是cyclohexadepsipepie缺陷的Fusarium venenatum宿主菌株。见例如WO00/42203。

核酸构建体

本文的“核酸构建体”定义为单链或双链的核酸分子，其分离自天然基因或经修饰含有结合或相邻的核酸片段(所述核酸片段不以其它形式出现在天然环境)。术语核酸构建体与术语表达盒同义，条件是所述核酸构建体含有所有表达编码序列所需的控制序列。本文术语“编码序列”是被转录成mRNA并翻译成多肽的序列。所述基因组编码序列的边界通常由ATG起始密码子到终止子来确定，所述起始密码子位于mRNA 5’末端的开放可读框起始处，所述终止密码子后面是恰好位于该mRNA 3’末端的开放可读框的下游的转录终止序列。编码序列包括，但不限于，基因组，cDNA，RNA，半合成，合成，重组或其任何组合。

本发明的方法中，所述核酸构建体包含核酸序列，所述核酸序列编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列并与编码尖镰孢胰蛋白酶原的信号肽(核苷酸58-111)和原肽(核苷酸112-129)的SEQ ID NO：1的核苷酸58-129可操作连接。所述SEQ ID NO：1的序列可获自尖镰孢DSM 2672(美国专利5,693,520)。

原肽区位于哺乳动物胰蛋白酶成熟编码序列的氨基末端，且所述信号肽区与所述原肽区的氨基末端相邻。

所述原肽编码区(核苷酸112-129)编码氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸18-24)，所述氨基酸序列在翻译可读框中与成熟哺乳动物胰蛋白酶的氨基末端相连。产生的多肽已知为原酶或原多肽。原多肽通常无活性，并可通过原肽从所述原多肽的催化或自身催化性裂解而转化成成熟的活性多肽基因。本发明的尖镰孢原肽编码区取代哺乳动物胰蛋白酶的天然原肽编码区以通过Fusarium venenatum宿主菌株中的内源蛋白酶活性对胰蛋白酶前体进行适当加工。

信号肽编码区(SEQ ID NO：1核苷酸58-129)编码氨基酸序列(SEQID NO：2的氨基酸1-17)，所述氨基酸序列在翻译可读框内与原肽编码区的氨基末端相连，并将胰蛋白酶原导入微生物的分泌途径。本发明中，尖镰孢信号肽编码区取代哺乳动物胰蛋白酶原的天然信号肽编码区，从而将该分子指导入Fusarium venenatum宿主菌株的分泌途径。

编码哺乳动物胰蛋白酶的分离核酸序列可通过多种方式进一步操作，以在Fusarium venenatum宿主菌株中表达哺乳动物胰蛋白酶。将理解所述表达涉及哺乳动物胰蛋白酶制备中的任何步骤，包括但不限于，转录，转录后修饰，翻译，翻译后修饰以及分泌。在将所述核酸序列插入载体前对其进行操作根据所述表达载体为所需或必要的。利用克隆法修饰核酸序列的技术是本领域已知的。

本文术语“控制序列”包括表达哺乳动物胰蛋白酶所需的任何必要或有利组分。每种控制序列对于编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列而言为天然或外来的。除了上述原肽序列和信号序列以外，控制序列还包括，但不限于前导序列，多腺苷酸序列，启动子和转录终止子。所述控制序列至少包括启动子，转录和翻译起始或终止信号。所述控制序列可包含接头，以导入特定限制性位点从而易于将所述控制序列与编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列进行接合。本文术语“可操作地连接”表示一种结构，其中控制序列位于相对DNA序列的编码序列而言适当的位置，使得所述控制序列指导哺乳动物胰蛋白酶的生成。

控制序列可以是适宜启动子序列，即Fusarium venenatum宿主菌株可识别以便表达编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列的核酸序列。所述启动子序列含有转录控制序列，所述序列介导哺乳动物胰蛋白酶的表达。所述启动子可为任何在Fusarium venenatum宿主菌株中显示转录活性的核酸序列，包括突变的，截短的和杂合的启动子，并可获自编码与细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。所述启动子前方可为本领域已知的活化序列和增强子序列。

本发明方法中指导所述核酸构建体转录的适宜启动子的实例为获自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Thizomucormeihei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)，米赫根毛霉脂酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖异构酶，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶，米曲霉乙酰胺酶，尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶，Fusarium venenatum葡糖淀粉酶启动子，Fusarium venenatum Daria启动子，Fusarium venenatum Quinn启动子，及其突变、截短和杂合的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子杂合体)。优选实施方案中，所述启动子获自尖镰孢胰蛋白酶样基因启动子，Fusarium venenatum葡糖淀粉酶基因启动子，Fusarium venenatum Daria基因启动子或Fusarium venenatum Quinn基因启动子。

所述对照序列也可为适宜的转录终止子序列，Fusarium venenatum宿主菌株所识别以终止转录的序列。所述终止子序列可操作地连接于编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列的3′末端。任何在Fusarium venenatum宿主菌株起作用的终止子可用于本发明。

优选实施方案中，所述终止子获自编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，或尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

所述控制序列可为适宜的前导序列，所述前导序列为mRNa的非翻译区，其对于Fusarium venenatum宿主菌株进行的翻译是重要的。所述前导序列可操作地连接于编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列的5′末端。任何在Fusarium venenatum宿主菌株中起作用的前导序列可用于本发明。

优选的前导序列获自编码米曲霉TAKA淀粉酶或构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。

所述控制序列也可为多腺苷酸序列，所述多腺苷酸序列可操作地连接于核酸序列的3′末端并且在转录时作为将多腺苷酸残基添加到转录的mRNA的信号而被Fusarium venenatum宿主菌株识别。任何在Fusariumvenenatum宿主菌株中起作用的多腺苷酸序列可用于本发明。

优选的多腺苷酸序列获自编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，或黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。

所述核酸构建体还可包含一或多种核酸序列，所述核酸序列编码一或多种优选指导哺乳动物胰蛋白酶的表达，诸如转录活化物(例如反式转录活化物)，伴侣分子以及加工型蛋白酶。任何在Fusarium venenatum宿主菌株中起作用的因子均可用于本发明。编码所述一或多种因子的核酸不必与编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列串联。

优选加入调节序列，所述调节序列允许相对于Fusarium venenatum宿主菌株的生长调节哺乳动物胰蛋白酶表达。调节系统的实例是导致基因对化学或物理刺激反应而被打开或关闭的系统，包括调节性化合物的存在。TAKAα-淀粉酶启动子，黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。调节序列的其它实例是允许基因扩增的那些，例如利用重金属扩增的金属硫因基因。在这样的情况下，编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列与所述调节序列可操作地相连。

重组表达载体

本文所述各种核酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，所述载体可包括一或多个方便的限制位点，以允许在所述位点插入或取代编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列。可选，编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列可通过将包含所述序列的序列或核酸构建体插入适宜表达载体中来表达。在所述表达载体的产生中，编码序列位于载体中使得所述编码序列与表达和分泌的适当控制序列可操作连接。

所述重组表达载体可为任何DNA或RNA分子(例如质粒，线性片段，或病毒)，其可方便地进行DNA重组，并使得编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列在Fusarium venenatum宿主菌株中表达。载体选择通常有赖于所述载体与该载体将导入的Fusarium venenatum宿主菌株的相容性。所述载体可为线性或闭合的环形质粒。所述载体可为自主复制载体，其为染色体外实体存在且复制不依赖染色体复制，例如质粒，染色体外元件，微型染色体或人工染色体。所述载体可含有任何保证自我复制的工具。可选，所述载体在导入Fusarium venenatum宿主菌株中时整合到基因组并与其整合的染色体一起复制。所述载体系统可为单个载体或质粒，或两个或两个以上的载体或质粒(其共同包含要导入Fusarium venenatum宿主菌株的所有DNA)或转座子。

所述载体可含有一或多种可选标记，使得容易选出转化的Fusariumvenenatum宿主细胞。选择标记是基因，其提供杀生物或病毒抗性、重金属抗性、原养型或营养缺陷型等。用于Fusarium venenatum宿主菌株的选择标记可选自包括但不限于以下标记的组：amdS(乙酰胺酶)，argy(鸟苷酸]氨基甲酰转移酶(ornithine carbamoyltransferase))，bar(膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase))，hph(潮霉素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase))，niaD(硝酸盐还原酶)，pyrG(乳清酸核苷(orotidine)-5′-磷酸脱羧酶)，sC(硫酸腺苷酸转移酶(sulfate adenyltransferase))，trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及来自其它物种的等价物.优选用于Fusarium venenatum宿主菌株的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，黑曲霉或米曲霉的niaD基因，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

所述载体优选含有元件，所述元件允许所述载体稳定整合到Fusariumvenenatum宿主菌株基因组或所述载体不依赖Fusarium venenatum宿主菌株基因组而在所述微生物中复制。

“导入”指将含有所述核酸序列的载体导入Fusarium venenatum宿主菌株，使得所述载体作为染色体整合体或自我复制的染色体外载体而保持。整合通常认为有利，这是由于所述核酸序列很可能在Fusarium venenatum宿主菌株中稳定保持。载体整合到染色体中通过同源重组，非同源重组或转位实现。

将表达载体整合到Fusarium venenatum宿主菌株可涉及原生质体形成，该原生质体的转化，以及以已知方式整合细胞壁。转化Fusarium种类的适宜方法见Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787。

为整合到Fusarium venenatum宿主菌株的基因组，所述载体有赖于编码哺乳动物胰蛋白酶的核酸序列或任何适宜通过同源或非同源重组将该载体整合到基因组中的其它元件。可选，所述载体可包含其它核酸序列，以指导通过同源重组整合到Fusarium venenatum宿主菌株基因组中。所述其它核酸序列使得载体整合到所述基因组中染色体的精确位置。为增加在精确位置整合的可能性，所述整合元件优选含有足量的核酸，诸如100-1,500碱基对，优选400-1,500碱基对，最优选800-1,500碱基对，所述核酸与对应靶序列高度同源，以增强同源重组的可能性。所述整合元件可任何与Fusarium venenatum宿主菌株基因组的靶序列同源的序列。此外，所述整合元件可为非编码型或编码型核酸序列。另一方面，所述载体可通过非同源重组整合到细胞基因组。

为进行自主复制，所述载体还可包含复制起点，使得该载体可在目的Fusarium venenatum宿主菌株中自主复制。所述复制起点可为在细胞中起作用的、介导自主复制的复制起点。术语“复制起点”定义为使得质粒或载体独立于染色体复制而复制的序列。用于丝状真菌细胞的复制起点的实例为AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，NucleicAcids Research 15：9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883公开的方法实现。

用于将本文所述元件进行连接以构建重组表达载体的方法是本领域已知的(见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatus，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York)。

本发明另一方面，Fusarium venenatum宿主菌株可含有一或多个基因的修饰，所述基因编码对目的哺乳动物胰蛋白酶的制备，回收和/或应用有害的蛋白。所述修饰减少或消除一或多种导致突变细胞的表达，所述突变细胞产生的哺乳动物胰蛋白酶比没有所述基因的修饰并在相同条件下培养的突变细胞多。

所述基因可编码任何蛋白或酶。例如，所述酶可以是氨基肽酶，淀粉酶，碳水化合物酶，羧肽酶，过氧化氢酶，纤维素酶，几丁质酶，角质酶(cutinase)，环式糊精糖基转移酶，脱氧核糖核酸酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，转化酶(invertase)，漆酶(laccase)，脂酶，甘露糖苷酶(mannosidase)，变位酶(mutanase)，氧化酶(oxidase)，溶果胶酶(pectinolytic enzyme)，过氧化物酶(peroxidase)，磷脂酶(phospholipase)，肌醇六磷酸酶(phytase)，多酚氧化酶(polyphenoloxidase)，蛋白水解酶，核糖核酸酶，转谷氨酰胺酶(transglutaminase)或木聚糖酶(xylanase).

哺乳动物胰蛋白酶的制备和回收

Fusarium venenatum宿主细胞培养在适宜用本发明的方法产生目的哺乳动物胰蛋白酶的培养基中。例如，所述细胞通过摇瓶培养或小规模或大规模发酵(包括连续，分批，补料分批，或固态发酵)在实验室或工业发酵罐的适宜培养基中、并在允许哺乳动物胰蛋白酶被表达和/或分离的条件下进行培养。所述培养在包含碳源或氮源以及无机盐的适宜培养基中，利用本领域已知的方法进行。适宜培养基可根据公开的配方制备(例如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)分类表中)。分泌的哺乳动物胰蛋白酶可直接从培养基回收。

可利用本领域已知的具体用于胰蛋白酶的方法检测哺乳动物胰蛋白酶。这些检测方法可包括利用特异性抗体，形成酶产物，酶底物的消失，SDS-PAGE或本领域已知任何其它方法。例如，可如本文所述利用酶实验测定哺乳动物胰蛋白酶活性。

产生的哺乳动物胰蛋白酶可通过本领域已知方法分离。例如所述多肽可通过常规方法从培养基分离，所述方法包括，但不限于离心，过滤，提取，喷雾干燥(spray-drying)，蒸发或沉淀。分离的哺乳动物胰蛋白酶随后可利用本领域已知的各种方法纯化，所述方法包括但不限于，层析(例如离子交换，亲和，疏水，层析聚焦(chromatofocusing)，和大小排阻层析(sizeexclusion))，电泳(例如制备性等电子聚焦(isoelectric focusing))，差异溶解性(例如硫酸铵沉淀)，或提取(见例如，Protein Purification，J.-C.Janson andLars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。

用途

根据本发明方法制备的哺乳动物胰蛋白酶可用于多种工业中，包括清洁剂，皮革，化学，农业，制药，食品和乳制品工业。例如，哺乳动物胰蛋白酶可作为清洁剂组合物的组分，如美国专利5,288,627，5,693,520和5,948,746所述。哺乳动物胰蛋白酶也可用于食品工业的多种应用中，例如见Owen R.Fennema，ed.，in Food Chemistry，Marcel Dekker，Inc.，New York，1985。哺乳动物胰蛋白酶也可用作皮革工业中的软化酶(bating enzyme)。哺乳动物胰蛋白酶也可用于干酪制备，如美国专利5,948,746所述。

本发明进一步通过以下实施例进行说明，所述实施例不应理解为限制本发明的范围。

实施例

菌株和质粒

Fusarium venenatum宿主MLY-3是Fusarium venenatum菌株A3/5的形态突变体(Royer等，1999，Fungal Genet.Biol.28：68-78)，所述MLY-3用作转化实验的受体菌株。Fusarium venenatumA3/5最初保藏为Fusariumgraminearum ATCC 20334，最近被Yoder and Christianson，1998，FungalGenetics and Biology 23：62-80 and O′Donnell etaL，1998，Fungal Genetics ticsand Biology 23：57-67重新分类为Fusarium venenatum。

核苷酸测序

在Perkin-Elmer Biosystems Model 377XL自动DNA测许仪利用染料-终止子化学法进行DNA测序.

介质和溶液

每升VN03RLMT包含20ml 50XVogels-24mM NaNO₃，273.33g of蔗糖和15g LMT琼脂糖。

每升50X Vogel′s含有125g柠檬酸钠，250g KH₂PO₄，106.25g NaNO₃，10g MgSO₄ 7H₂O，5g CaCl₂ 2H₂O，2.5ml生物素原液(5mg生物素，在100ml 50％乙醇中)，和5ml Vogels微量元素(trace element)溶液。

每升Vogels微量元素溶液包含50g柠檬酸，50g ZnSO₄-7H₂O(或2.4gZnCl₂)，10g Fe(NH₄)₂(SO₄)₂-H₂O(或0.68g FeCl₃)，2.5g CuSO4·5H₂O，0.5gMnSO4-H₂O，0.5g H₃BO₃，和0.5g Na₂MoO₄-2H₂O(或(NH₄)₂MoO₄)。

BASTA top琼脂糖包含COVE top琼脂糖，其中补充了10mg/ml除莠剂Basta(Hoechst Schering，Rodovre，Denmark)。

每升RA孢子形成(sporulation)培养基包含50g琥珀酸，12.1g NaNO₃，1g葡萄糖，20ml 50XVogels，和0.5ml 10mg/mlNaMoO₄原液，pH 6.0。

每升YEPG包含10g酵母提取物，20g肽胨，和20g葡萄糖。

STC包含0.8M山梨醇，25mM Tris pH 8，25mMCaCl₂。

SPTC包含40％PEG 4000，0.8M山梨醇，25mM Tris pH 8，25mMCaCl₂。

每升M400培养基包含50g麦芽糊精，2g MgSO4 7H₂O，2g ofKH₂PO₄，4g柠檬酸，8g酵母提取物，2g尿素，0.5g CaCl₂，和0.5ml AMG微量金属溶液。

每升AMG微量金属溶液包含14.3g ZnS0₄-7H₂O，2.5g CuSO₄ 5H₂O，0.5g NiCl₂，13.8g FeSO₄，8.5g MnSO₄，和3.0g柠檬酸。

实施例1：构建pCaHj522

猪胰蛋白酶原DNA序列和推定的氨基酸序列显示在图2中(分别为SEQ ID NO：3和4)。猪胰蛋白酶原基因作为质粒p185上的cDNA基因克隆，如WO 97/00316所述。该cDNA基因在框内与编码TAKA淀粉酶信号序列的TAKA淀粉酶基因片段融合，并克隆入米曲霉表达质粒。编码TAKA淀粉酶信号序列的TAKA淀粉酶基因片段通过PCR从质粒pTAKA17扩增，见EP 0 238 023。所用曲霉表达载体pCaHj483描述于WO 98/00529。编码TAKA淀粉酶信号序列的基因片段与编码猪原胰蛋白酶的片段的融合利用通过重叠延伸进行剪切来进行(Horton等，1989，基因77：61-68)。Pwo DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)用于根据生产商说明进行PCR扩增。利用pTAKA17质粒制备物作为DNA模板扩增编码TAKA淀粉酶信号序列的PCR引物为：

120464：5′-TTGGATCCTTTATGATGGTCGCGTGG-3′(SEQ ID NO：5)

120462：5′-ATCCGTGGGGAAAGCCAAAGCAGGTGCCG-3′(SEQ IDNO：6)

利用p185质粒作为DNA模板扩增编码猪原胰蛋白酶的PCR引物为：

120461：5′-CCTGCTTTGGCTTTCCCCACGGATGATGAT-3′(SEQ ID NO：7)

120463：5′-TTCTCGAGTTAGTTGGCAGCGATGGT-3′(SEQ ID NO：8)

两种PCR反应加样于1％琼脂糖凝胶并进行琼脂糖凝胶电泳，然后从所述凝胶分离这两种PCR产物.混合PCR产物并用作第三次PCR反应中的模板，所述第三次PCR利用引物120464和120463.形成的PCR片段通过凝胶利用与另两种PCR片段相同的方法纯化.所述片段用限制酶BamH1和Xhol消化，并插入用相同酶消化的pCaHj483以形成pCaHj522(图3).

实施例2：构建表达载体pRaMB58

构建质粒pRaMB58(图4)以便在Fusarium venenatum中表达猪胰蛋白酶。首先，编码尖镰孢胰蛋白酶原-样蛋白的信号肽和原肽的的DNA片段(图1；SEQ ID NO：1的核苷酸58-129)利用pJRoy6(美国专利5,837,847)作为模板通过以下PCR引物进行扩增：

引物980173：5′-CTTCACCATGGTCAAGTTCGCT-3′(SEQ ID NO：9)

引物980174：5′-GTTGGGGATCTCCTGAGGAGCG-3′(SEQ ID NO：10)

其次，图2所示编码成熟猪胰蛋白酶的eDNA片段(SEQ ID NO：3的核苷酸75-744)利用pCaHj522和以下PCR引物扩增：

引物980175：5′-ATCGTCGGGGGTTACACCTGT-3′(SEQ ID NO：11)

引物980176：5′-CGTTAATTAATTCTTTAGTTGGCAGCGATGGTCTG-3′(SEQ ID NO：12)

所有PCR反应利用高特异性(fidelity)Pwo DNA聚合酶并根据生产说明(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switzerland)进行。第一PCR片段用Ncol消化，第二PCR产物用Pacl消化。两种消化所得的片段通过制备性.琼脂糖凝胶电泳利用1％琼脂糖凝胶在50mM Tris-base-50mM硼酸盐-1mMNa₂-EDTA-2H₂O(TBE)缓冲液分离，并利用Bio-Rad Prep-a-Gene Kit根据生产商说明(Bio-Rad，Hercules，CA)进行纯化。

纯化的片段利用Ncol和Pacl消化的pSheB1(美国专利6,361,973)在三部分连接中结合。结合的混合物用于根据生产商说明转化大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen，San Diego，CA)，并用Ncol+Pacl消化来自转化体的质粒DNA，然后在存在0.75kb胰蛋白酶编码序列利用1％琼脂糖凝胶在TBE缓冲液中进行筛选。产生的质粒称为pRaMB58(图4)，其包含杂合编码区，该区含尖镰孢胰蛋白酶信号肽和原肽区以及成熟猪胰蛋白酶序列。

实施例3：用pRaMB58转化Fusarium venenatum

Fusarium venenatum MLY-3(Δtri5)如美国专利6,180,366所述获得。Fusarium venenatum MLY-3的孢子的产生如下：通过用来自补充了2.5％葡萄糖和2.5mM硝酸钠的1X Vogels培养板(2.5％Noble琼脂)的10个plug接种含有500ml RA孢子形成培养基的烧瓶，在28℃，150rpm保温2-3天。通过MIRACLOTH^TM(Calbiochem，San Diego，CA)收集孢子并在SorvallRC-5B离心机(E.I.DuPont De Nemours and Co.，Wilmington，DE)以7000rpm离心20分钟。用无菌蒸馏水洗涤沉淀的孢子两次，重悬于少量水中，并利用血细胞计数器计数。

原生质体的制备如下：用4×10⁷ Fusarium venenatum MLY-3孢子接种100ml YEPG并在24℃、150rpm保温16小时。以3500在Sorvall RT 6000D(E.I.DuPont De Nemours and Co.，Wilmington，DE)中离心7分钟。用30ml 1MgSO₄洗涤沉淀两次，并重悬于1M MgSO₄中的15ml 5mg/mlNOVOZYME234TM(batch PPM 4356，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)。在24℃、150rpm保温培养物至形成原生质体。将35ml 2M山梨醇加入原生质体消化物，并将混合物在2500rpm离心10分钟。重悬沉淀，并用STC洗涤两次，在2000rpm离心10分钟以沉淀原生质体。用血细胞仪计数原生质体，并重悬于8∶2∶0.1的STC∶SPTC∶DMSO溶液，达终浓度1.25×10⁷原生质体/ml。所述原生质体在Nalgene Cryo1℃ Freezing Container(VWRScientific，Inc.，San Francisco，CA)中控速冷冻后保存在-80℃。

Fusarium venenatum MLY-3的冷冻的原生质体在冰上解冻。将100gpRaMB58加入50ml无菌聚丙烯试管。将2ml原生质体加入该试管，轻柔混合，并在冰上保温30分钟。加入220μl SPTC并在室温保温10分钟，加入20ml SPTC并进一步在室温保温10分钟。加入500ml 40℃ VN03RLMTtop琼脂糖后，所述混合物导入直径150ml的空板，并在室温保温过夜。24小时后，再将25ml 40℃ VN03RLMT top琼脂糖(含10mg BASTATM每毫升)导入所述板上，并在室温保温14天。除莠剂BASTA^TM中的活性成分是膦丝菌素。BASTA^TM得自AgrEvo(Hoechst Schering，Rodovre，Denmark)并用苯酚∶氯仿∶异戊基醇(25∶24∶1)提取两次，并用氯仿∶异戊基醇(24∶1)提取一次，然后使用。

四个Fusarium venenatum转化体用pRaMB58获得。所述转化体直接从选择板(VN03RLMT underlay withVN03RLMT-BASTAT′覆盖的)中选出加入125ml含25ml M400培养基的烧瓶并在28℃，200rpm、在平板摇床上保温6天。也包含未转化的受体菌株作为阴性对照。

在接种后4，5和6天时收获1ml培养物上清等分试样。利用N-α-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺作为底物，通过微量滴定板实验测定各转化体的无细胞上清液的胰蛋白酶活性。具体地，将N-α-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺以100mg/ml溶于DMSO，并在100mM MOPS缓冲液，4mMCaCl₂，0.01％Triton X-100，pH 7.5(试验缓冲液)中以1∶50稀释成2mg/ml溶液。水解速率利用Molecular Devices 96-孔板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在405nm、30℃、3分钟通过动力学测定。转化体58c.1，58c.2，58c.3和58c.4产生明显的胰蛋白酶活性。

表1显示在pRaMB58转化体培养物的胰蛋白酶活性，但所述活性未在没有转化的对照菌株中检测到。最高的胰蛋白酶水平见于5天后，且其产量约130-200单位(每ml)。6天后，胰蛋白酶活性开始下降，提示时间较长的培养物的所述酶失活。

表1 Fusarium venenatum转化体摇瓶培养物中的胰蛋白酶表达

菌株/转化体	4天后的胰蛋白酶活性(单位)<sup>a</sup>	5天后的胰蛋白酶活性(单位)<sup>a</sup>	6天后的胰蛋白酶活性(单位)<sup>a</sup>
菌株/转化体	4天后的胰蛋白酶活性(单位)<sup>a</sup>	5天后的胰蛋白酶活性(单位)<sup>a</sup>	6天后的胰蛋白酶活性(单位)<sup>a</sup>	未转化的对照	＜10	＜10	＜10
转化体58c.1	140	182	74	未转化的对照	＜10	＜10	＜10
转化体58c.1	140	182	74	转化体58c.2	121	140	77
转化体58c.3	83	130	128	转化体58c.2	121	140	77
转化体58c.3	83	130	128	转化体58c.4	159	203	139

a一个胰蛋白单位定义为一微摩尔L-BAPNA每分钟每ml培养液的水解。

来自转化体58c.1，58c.2，58c.3和58c.4的培养液样品(15μl)通过SDS-PAGE利用Novex XCellII微型仪器(Invitrogen，San Diego，CA)分析.15μl各上清样品与等体积的Tris-甘氨酸样品缓冲液一起(Invitrogen，SanDiego，CA)在95℃加热5分钟.变性的上清蛋白在10-20％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen，San Diego，CA)分离并用考马斯蓝染色。SDS-PAGE分析显示转化体58c.1，58c.2，58c.3和58c.4主要分泌表观分子量大约23kDa(猪胰蛋白酶的预期大小)的蛋白。

实施例4：Fusarium venenatum产生的胰蛋白酶的氨基末端测序

变性的上清蛋白在10-20％ Tricine SDSPAGE梯度凝胶(Invitrogen，SanDiego，CA)上分离，并利用10％甲醇，pH＝11.0中的10mM CAPS(3-[环己基氨基(cyclohexylamino)]-1-丙烷磺酸(propanesulfonic acid))、以25伏特、2小时电印迹到Novex测序级PVDF膜(Novex，San Diego，CA)。PVDF膜用40％MeOH/1％乙酸中的0.1％考马斯蓝R-250染色20秒，并在50％MeOH中脱色以观察蛋白带。SDS-PAGE分析显示转化体58c.1，58c.2，58c.3和58c.4主要分泌表观分子量大约23kDa(猪胰蛋白酶的预期大小)的蛋白。

Fusarium venenatum转化体58c.4的23kDa SDS-PAGE带被切下并利用N-末端测序分析。切下蛋白的N-末端氨基酸测序在Applied Biosystems476A蛋白测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上利用on-line HPLC和液相三氟乙酸(TFA)递送进行。乙内酰苯硫脲(phenylthiohydantoin)-氨基酸的检测在on-line HPLC利用缓冲液A(含3.5％四氢呋喃(tetrahydrofuran)水溶液)以及含乙酸，乙酸钠和sodium hexanesulfonate的18ml Premix浓缩液(Applied Biosystems，Foster City，CA)以及含乙腈的缓冲液B进行。收集数据并用Applied Biosystems 610数据分析软件用Macintosh llsi分析。通过对着光源观察层析图测定序列。

该带的N-末端序列为IVGGYTXAAN(SEQ ID NO：4的氨基酸1-10，对应成熟猪胰蛋白酶的正确氨基酸序列)。成熟胰蛋白酶的前四个氨基酸IVGG与成熟尖镰孢胰蛋白酶-样酶的前四个残基(SEQ ID NO：2的氨基酸25-28)相同。

本发明的描述和权利要求不受公开的具体实施方案限制，这些实施方案意图作为本发明数个方面的说明。等同的实施方案意图包含在本发明范围内。事实上，除本文显示和描述的内容以外，本发明的各种修饰根据前述说明对本领域技术人员显而易见。所述修饰意图包含在本发明权利要求范围内。如有冲突，以本发明的公开包括定义为准。

本文所引用的各种参考文献的内容包含在本文作为参考。

序列表

<110>诺维信生物技术公司(Novozymes Biotech，Inc.)

<120>制备哺乳动物胰蛋白酶的方法

<130>10333.204-WO

<150>60/407170

<151>2002-08-30

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>998

<212>DNA

<213>Fusarium oxysporum

<400>1

atcatcaacc actcttcact cttcaactct cctctcttgg atatctatct cttcaccatg 60

gtcaagttcg cttccgtcgt tgcacttgtt gctcccctgg ctgctgccgc tcctcaggag 120

atccccaaca ttgttggtgg cacttctgcc agcgctggcg actttccctt catcgtgagc 180

attagccgca acggtggccc ctggtgtgga ggttctctcc tcaacgccaa caccgtcttg 240

actgctgccc actgcgtttc cggatacgct cagagcggtt tccagattcg tgctggcagt 300

ctgtctcgca cttctggtgg tattacctcc tcgctttcct ccgtcagagt tcaccctagc 360

tacagcggaa acaacaacga tcttgctatt ctgaagctct ctacttccat cccctccggc 420

ggaaacatcg gctatgctcg cctggctgct tccggctctg accctgtcgc tggatcttct 480

gccactgttg ctggctgggg cgctacctct gagggcggca gctctactcc cgtcaacctt 540

ctgaaggtta ctgtccctat cgtctctcgt gctacctgcc gagctcagta cggcacctcc 600

gccatcacca accagatgtt ctgtgctggt gtttcttccg gtggcaagga ctcttgccag 660

ggtgacagcg gcggccccat cgtcgacagc tccaacactc ttatcggtgc tgtctcttgg 720

ggtaacggat gtgcccgacc caactactct ggtgtctatg ccagcgttgg tgctctccgc 780

tctttcattg acacctatgc ttaaatacct tgttggaagc gtcgagatgt tccttgaata 840

ttctctagct tgagtcttgg atacgaaacc tgtttgagaa ataggtttca acgagttaag 900

aagatatgag ttgatttcag ttggatctta gtcctggttg ctcgtaatag agcaatctag 960

atagcccaaa ttgaatatga aattt gatga aaatattc 998

<210>2

<211>248

<212>PRT

<213>Fusarium oxysporum

<400>2

Met Val Lys Phe Ala Ser Val Val Ala Leu Val Ala Pro Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Pro Gln Glu Ile Pro Asn Ile Val Gly Gly Thr Ser Ala Ser

20 25 30

Ala Gly Asp Phe Pro Phe Ile Val Ser Ile Ser Arg Asn Gly Gly Pro

35 40 45

Trp Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asn Ala Asn Thr Val Leu Thr Ala Ala

50 55 60

His Cys Val Ser Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Phe Gln Ile Arg Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Ser Arg Thr Ser Gly Gly Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Val

85 90 95

Arg Val His Pro Ser Tyr Ser Gly Asn Asn Asn Asp Leu Ala Ile Leu

100 105 110

Lys Leu Ser Thr Ser Ile Pro Ser Gly Gly Asn Ile Gly Tyr Ala Arg

115 120 125

Leu Ala Ala Ser Gly Ser Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Ala Thr Val

130 135 140

Ala Gly Trp Gly Ala Thr Ser Glu Gly Gly Ser Ser Thr Pro Val Asn

145 150 155 160

Leu Leu Lys Val Thr Val Pro Ile Val Ser Arg Ala Thr Cys Arg Ala

165 170 175

Gln Tyr Gly Thr Ser Ala Ile Thr Asn Gln Met Phe Cys Ala Gly Val

180 185 190

Ser Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Ile

195 200 205

Val Asp Ser Ser Asn Thr Leu Ile Gly Ala Val Ser Trp Gly Asn Gly

210 215 220

Cys Ala Arg Pro Asn Tyr Ser Gly Val Tyr Ala Ser Val Gly Ala Leu

225 230 235 240

Arg Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ala

245

<210>3

<211>897

<212>DNA

<213>猪

<400>3

ggaattccga acacctttgt cttgcttgcg ctcctgggag ctgctgttgc tttccccacg 60

gatgatgatg acaagatcgt cgggggttac acctgtgcag caaattccat tccctaccag 120

gtgtccctga attctggctc ccacttctgt ggtgggtccc tcatcaacag ccagtgggtg 180

gtgtctgctg ctcactgcta caagtcccga atccaggtgc gtctgggaga acacaacatc 240

gacgtccttg agggcaatga gcaattcatc aatgccgcca agatcatcac ccaccccaat 300

ttcaatggaa ataccttaga taacgacatc atgctgatta aactgagctc acctgccact 360

ctcaacagtc gagtagcaac tgtctcactg ccaagatctt gtgcagctgc tggtaccgag 420

tgtctcatct ctggctgggg caacaccaaa agcagtggct ccagctaccc ttcgctcctg 480

caatgcctga aggcccccgt cctaagtgac agttcttgca agagttccta cccaggccag 540

atcaccggaa acatgatctg tgtcggcttc ctggagggtg gtaaggattc ttgccaggga 600

gactctggtg gccccgtggt ctgcaatgga cagctccagg gtattgtctc ttggggctat 660

ggctgcgccc agaaaaacaa gcctggggtc tacaccaagg tctgcaacta tgtgaactgg 720

attcagcaga ccatcgctgc caactaaaga atttcatttc ttcatgactc ttccctttag 780

tcatcttcac cttcctccca tcctgcgaac agcatctaaa taaaaacatt ttgacctgta 840

ccagcatcta aataaaaaca ttttgagctg tacccaaaaa aaaaaaaaag gaattcc 897

<210>4

<211>247

<212>PRT

<213>猪

<400>4

Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala

1 5 10 15

Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala

20 25 30

Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe

35 40 45

Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His

50 55 60

Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp

65 70 75 80

Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr

85 90 95

His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile

100 105 110

Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser

115 120 125

Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly

130 135 140

Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln

145 150 155 160

Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr

165 170 175

Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly

180 185 190

Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn

195 200 205

Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys

210 215 220

Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile

225 230 235 240

Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn

245

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>5

ttggatcctt tatgatggtc gcgtgg 26

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>6

atccgtgggg aaagccaaag caggtgccg 29

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>猪

<400>7

cctgctttgg ctttccccac ggatgatgat 30

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>猪

<400>8

ttctcgagtt agttggcagc gatggt 26

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>Fusarium oxysporum

<400>9

cttcaccatg gtcaagttcg ct 22

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>Fusarium oxysporum

<400>10

gttggggatc tcctgaggag cg 22

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>猪

<400>11

atcgtcgggg gttacacctg t 21

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>猪

<400>12

cgttaattaa ttctttagtt ggcagcgatg gtctg 35

Claims

1.制备哺乳动物胰蛋白酶的方法，所述方法包括

(a)在适宜表达所述哺乳动物胰蛋白酶并将其分泌到培养基中的条件下在培养基中培养Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusariumvenenatum宿主菌株包含含有核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列，并且其与编码尖镰孢胰蛋白酶原的信号肽和原肽的SEQ ID NO：1核苷酸58-129可操作地连接；和

(b)从所述培养基中回收所述哺乳动物胰蛋白酶。

2.权利要求1的方法，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是Fusarium venenatum ATCC 20334。

3.权利要求1的方法，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是Fusarium venenatum ATCC 20334的形态突变体，该形态突变体有利于生产异源多肽。

4.权利要求1的方法，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是单端孢霉烯-缺陷的Fusarium venenatum菌株。

5.权利要求1的方法，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是cyclohexadepsipeptide-缺陷的Fusarium venenatum菌株。

6.权利要求1的方法，其中所述核酸构建体还包含获自选自下组的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉磷酸丙糖异构酶，构巢曲霉乙酰胺酶，米曲霉乙酰胺酶，尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶，Fusariumvenenatum葡糖淀粉酶，Fusarium venenatum Daria或Fusarium venenatumQuinn基因。

7.权利要求1的方法，其中所述核酸构建体还包含获自尖镰孢胰蛋白酶样基因的启动子。

8.权利要求1的方法，其中所述核酸构建体还包含获自选自下组的基因的终止子：米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶，黑曲霉α-葡糖苷酶，或尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

9.权利要求1的方法，其中所述核酸构建体还包含获自尖镰孢胰蛋白酶样基因的终止子。

10.权利要求1-9之一的方法，其中所述哺乳动物胰蛋白酶是牛，狗，人，小鼠，猪，或大鼠胰蛋白酶。

11.权利要求1的方法，其中编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列的核酸序列是SEQ ID NO：3的核苷酸75-744。

12.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列编码SEQ ID NO：4的氨基酸25-247。

13.核酸构建体，其包含核酸序列，所述核酸序列编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列并且其与编码尖镰孢胰蛋白酶原的信号肽和原肽的SEQID NO：1的核苷酸58-129可操作地连接。

14.权利要求13的核酸构建体，其中编码哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列的核酸序列是SEQ ID NO：3的核苷酸75-744。

15.权利要求13的核酸构建体，其中所述哺乳动物胰蛋白酶的成熟编码序列编码SEQ ID NO：4的氨基酸25-247。

16.重组表达载体，其包含权利要求13的核酸构建体。

17.重组Fusarium venenatum宿主菌株，其包含权利要求13的核酸构建体。

18.权利要求17的重组Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是Fusarium venenatum ATCC 20334。

19.权利要求17的重组Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是Fusarium venenatum ATCC 20334的形态突变体，该形态突变体有利于生产异源多肽。

20.权利要求17的重组Fusarium venenatum宿主菌株，其中所述Fusarium venenatum宿主菌株是单端孢霉烯-缺陷的，cyclohexadepsipeptide-缺陷的，或单端孢霉烯缺陷的和cyclohexadepsipeptide-缺陷的Fusariumvenenatum菌株。