CN101517084B - 来自里氏木霉的乙酰乳酸合酶(als)选择性标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了编码乙酰乳酸合酶(ALS)蛋白质的核酸，所述乙酰乳酸合酶提供对ALS抑制剂，例如磺酰脲类和咪唑啉酮类化合物的抗性。核酸可用作宿主细胞内目标蛋白表达的选择性标记。

Description

来自里氏木霉的乙酰乳酸合酶(ALS)选择性标记
本申请要求于2006年9月22日提交的美国临时申请US 60/846,804和于2006年9月22日提交的US 60/846,656的优先权，其均通过引用完整的整合到本文中。
1.发明背景
植物、真菌和细菌通过共同途径合成氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。该途径中的一种酶是乙酰乳酸合酶(ALS)(还已知为乙酰羟酸合酶或AHAS)，该酶在缬氨酸和亮氨酸合成的第一步将丙酮酸转变成2-乙酰乳酸，也将丙酮酸和2-丁酮酸转变成2-乙酰-2-羟丁酸，即异亮氨酸的前体。野生型乙酰乳酸合酶的活性对一些已知的毒性化合物类型的作用敏感，包括磺酰脲类和咪唑啉酮类化合物。因此，此类毒性化合物可用于杀死含有对这些化合物敏感的乙酰乳酸合酶蛋白质的细胞。
本申请公开的内容涉及提供对毒性化合物抗性的乙酰乳酸合酶，从而是重组细胞的有效选择性标记。
2.发明概述
本申请提供了提供对ALS抑制剂(例如：磺酰脲类和咪唑啉酮类化合物)抗性的乙酰乳酸合酶蛋白质，以及编码所述蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，乙酰乳酸蛋白质的氨基酸序列与里氏木霉(Trichodermareesei)的野生型乙酰乳酸蛋白质SEQ ID NO：1具有至少80％同一性。在特定的实施方案中，ALS蛋白质可含有在位置190上的酸性氨基酸，在位置241上的酸性氨基酸，或在位置372上的组氨酸。在一些实施方案中，ALS基因或多肽可用作广泛物种中的选择性标记。在一些情况下，蛋白质可以是非天然存在的。
在一些实施方案中，编码ALS的多核苷酸可以有效地连接启动子和终止子，用于在宿主细胞中表达赋予ALS抑制剂抗性的蛋白质。启动子和终止子对待使用多核苷酸的宿主细胞可以是内源性的，在一些情况下，启动子和终止子可以是细胞的ALS基因的启动子和终止子。在一些实施方案中，多核苷酸可以含有编码乙酰乳酸合酶蛋白质的单个可读框，在此情况下，多核苷酸可以与SEQ ID NO：2至少70％同一，或可以与SEQ ID NO：2杂交。在其它实施方案中，多核苷酸可以包含内含子，在此情况下，多核苷酸可以具有与SEQ ID NO：4至少70％同一的核苷酸序列，或可以与SEQID NO：4杂交。在另一个实施方案中，对于在特定宿主细胞中乙酰乳酸合酶蛋白质的表达，多核苷酸可以是密码子优化的。
本申请还提供包含多核苷酸的载体。除多核苷酸外，目标载体可以含有用于在细胞内重组蛋白质(例如：酶或治疗性蛋白质)表达的表达盒。
还提供包含目标多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是ALS抑制剂抗性的，例如毒性的磺酰脲类和咪唑啉酮类化合物。宿主细胞可以是在多核苷酸不存在时对ALS抑制剂敏感的任何细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是植物细胞，例如玉米、大豆或拟南芥细胞；真菌细胞，例如：丝状真菌细胞(如木霉属物种(Trichoderma sp.)或曲霉属(Aspergillus sp.))，或细菌细胞，例如芽胞杆菌属物种(Bacillus sp.)。在特定的实施方案中，宿主细胞是丝状真菌。细胞可以存在于体外，或者多细胞机体(例如植物)内。多核苷酸可以存在于宿主细胞的基因组中，或存在于在宿主细胞内自主复制的载体中。
还提供了选择细胞的方法。在一些实施方案中，方法包括：将编码ALS的目标多核苷酸引入多个细胞内，将所述多个细胞与ALS抑制剂接触，和培养细胞供细胞选择。在一些实施方案中，细胞是真菌细胞。细胞可以培养在含有ALS抑制剂的液体培养基中，或培养在含有ALS抑制剂的固体培养基上。这些方法还可以包括将第二多核苷酸引入宿主细胞，所述第二多核苷酸编码待由宿主细胞生产的多肽。目标多核苷酸和第二多核苷酸可以位于相同或不同的核酸上，例如相同载体或不同载体。如果使用不同的载体，其可以共转化到相同的细胞内。
还提供了涉及1818A和1818B启动子的实施方案。
3.附图说明
图1显示了来自里氏木霉的野生型乙酰乳酸合酶蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2显示了编码图1的野生型乙酰乳酸蛋白质的里氏木霉推断的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3显示了编码图1的野生型乙酰乳酸合酶蛋白质的里氏木霉基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，其中，启动子是斜体的，编码ALS的序列是下划线的(SEQ ID NO：4)，而终止子序列是斜体和下划线的。
图4是用于测试ALS标记的载体的一般图示，其中载体包括两个基因。第一个基因对应编码目的蛋白质的多核苷酸(例如：葡糖淀粉酶)，第二个基因对应编码ALS标记的多核苷酸。
图5A和5B分别显示了启动子1818A(SEQ ID NO：7)和1818B(SEQID NO：8)的核苷酸序列。
图6显示了用于测试ALS标记的pTrex-葡糖淀粉酶载体的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)，其在大肠杆菌(E.coli)载体pSL1180中包含里氏木霉cbh1启动子、attB1、编码里氏木霉葡糖淀粉酶的多核苷酸；attB2，里氏木霉cbh1终止子，和ALS标记(A190D)。
图7示例了来自生长的转化体摇瓶中上清液样品的SDS-PAGE凝胶。道1描述了未转化的对照。由箭头强调的道3和4显示了里氏木霉葡糖淀粉酶的表达。
图8是用于测试1818A和1818B启动子的载体的图示。
图9显示了用于测试1818A和1818B启动子的构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。
4.详细说明
定义
除非在本文中另外定义，本文中使用的所有技术术语和科技术语都具有本领域普通技术人员普遍理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第二版，John Wiley和Sons，New York(1994)，以及Hale&Marham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本发明中使用的众多术语的通用词典。虽然描述了优选的方法和材料，但是与本文中描述的技术方案相似的或等价的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明。
本文中提及的所有专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的所有序列，都通过引用明确的整合到本文。
数字范围都包含定义范围的数值在内。除非另外指示，核酸分别都按照由左至右5’至3’的方向书写；氨基酸序列分别都按照由左至右氨基至羧基的方向书写，
本文中提供的标题对本发明的各方面或实施方案不作限制，其可以通过整体参考说明书产生。因此，通过参考说明书整体可以更全面的定义下文定义的术语。
如本文中使用的，术语“选择性标记”指这样的基因或多核苷酸，其表达允许鉴别已经用含有所述基因或多核苷酸DNA构建体或载体转化的细胞。选择性标记可以提供对毒性化合物的抗性，例如对抗生素，除草剂等。
术语“乙酰乳酸合酶(ALS)”指具有根据IUBMB酶命名法EC 2.2.1.6定义的活性的酶。酶催化两个丙酮酸分子之间的反应，产生2-乙酰乳酸和CO2。酶需要二磷酸硫胺素，并且还可以称为乙酰羟酸合酶(AHAS)。
术语“ALS抑制剂”指抑制野生型ALS蛋白质的化合物，对含有野生型ALS的细胞是毒性的。此类化合物包括已知的除草剂，并且包括下文讨论的磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶基硫代苯甲酸类或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮类化合物。
本文中定义术语“启动子”为指导下游的多核苷酸在细胞内转录的核酸。在一些情况下，多核苷酸可以含有编码序列，启动子可以指导编码序列转录为可翻译的RNA。
本文中定义的术语“分离的”意指从天然相关的至少一种组分中移出来的化合物、蛋白质、细胞、核酸序列或氨基酸。
术语“编码序列”在本文中定义为这样的核酸，当其置于合适的控制序列(包括启动子)的控制下时，转录成可以翻译为多肽的mRNA。例如，编码序列可以含有单个可读框，或一些由内含子隔开的可读框。例如，编码序列可以是cDNA、基因组DNA、合成DNA或重组DNA。编码序列通常自起始密码子(例如ATG)开始，于终止密码子(例如UAA、UAG和UGA)结束。
术语“重组体”指在宿主细胞内不是天然存在的多核苷酸或多肽。重组分子可以含有两条或多条天然存在的序列，它们以非天然存在的方式连接在一起。
术语“异源性”指彼此一般不相关的元件。例如，异源性蛋白质是在野生型宿主细胞内不生产的蛋白质，异源性启动子是野生型宿主细胞的内源性核酸中不存在的启动子，与异源性编码序列有效地连接的启动子是指启动子有效地连接了在野生型宿主细胞内通常不是有效地连接的编码序列。
术语“有效地连接”指这样的元件排列，其允许所述元件是功能性相关的。例如，如果启动子控制序列的转录，则启动子有效地连接编码序列，如果信号序列指导蛋白质通过宿主细胞的分泌系统，则信号序列有效地连接蛋白质。
术语“核酸”涵盖了DNA、RNA，单链或双链的，及其修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换的使用。
本文中使用的术语“DNA构建体”意指包含至少两个DNA多核苷酸片段的核酸序列。
术语“信号序列”或“信号肽”指蛋白质的N-末端部分的氨基酸序列，其有利于成熟形式的蛋白质分泌到细胞外。成熟形式的胞外蛋白质缺少信号序列，所述信号序列在分泌过程中被切除。
术语“载体”在本文中定义为设计用于携带将被引入一种或多种细胞类型中的核酸序列的多核苷酸。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体或病毒颗粒、DNA构建体、盒等。表达载体可以包括调节序列例如启动子、信号序列、编码序列和转录终止子。
本文中使用的“表达载体”意指包含有效地连接适合的调控序列的编码序列的DNA构建体，所述调控序列能够影响蛋白质在适合的宿主内表达。此类调控序列可以包括影响转录的启动子，任选的控制转录的操纵子序列，编码mRNA上的适合的核糖体结合位点的序列，增强子和控制转录和翻译终止的序列。
如本文中使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换的使用，包括涉及任意数目的氨基酸残基的聚合物。术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语还适用于含有保守氨基酸取代的聚合物，从而多肽维持其功能。“肽”是具有少于50个氨基酸残基的多肽。
“宿主细胞”是在宿主细胞基因组中，或者在独立于宿主细胞的基因组而自主复制的染色体外载体中含有目标重组核酸的细胞。宿主细胞可以是任何细胞类型。
术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形态(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，New York)。这些真菌的特征是具有包含壳多糖、葡聚糖和其它复杂多糖的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌与酵母是形态学、生理学和遗传上不同的。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延长，而且碳分解代谢是专性需氧的。
“非病原”细胞是对人类不致病的株。
“转化”意指将DNA引入细胞，从而DNA以染色体外元件或染色体整合体形式维持在细胞内。
除非另外指示，乙酰乳酸合酶蛋白质中的所有氨基酸位置都是在使用BLASTP程序(Altschul，Nucl.Acids Res.1997 25：3389-3402；Schaffer，Bioinformatics 1999 15：1000-1011)，在缺省条件下该蛋白质与SEQ IDNO：1比对后，相对于SEQ ID NO：1的，所述BLASTP程序可自国立生物技术信息中心(NCBI)的万维网址获得。
多核苷酸
本文中提供的多核苷酸是编码乙酰乳酸合酶蛋白质的多核苷酸，所述乙酰乳酸合酶蛋白质提供对ALS抑制剂的抗性。在一些实施方案中，乙酰乳酸合酶蛋白质是非天然存在的蛋白质。概括地说，多核苷酸编码这样的蛋白质：a)具有乙酰乳酸合酶活性(即，可以催化两个丙酮酸分子之间反应产生2-乙酰乳酸)，b)赋予对ALS抑制剂例如磺酰脲类和咪唑啉酮类化合物的抗性，和c)具有与SEQ ID NO：1至少85％同一性(例如：至少90％同一性、至少93％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少98.5％同一性、至少99％同一性或至少99.5％同一性)的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：1描述了来自里氏木霉的野生型乙酰乳酸合酶的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多核苷酸可以编码具有下列一个或多个的蛋白质：a)位于位置190的酸性氨基酸(例如：Asp或Glu)，b)位于位置241的酸性氨基酸(例如：Asp或Glu)，或位于位置372的His。在野生型里氏木霉ALS蛋白质中的位置190、241和372在图1中下划线表示。如上所述，在不同ALS蛋白质(例如：相对于野生型里氏木霉ALS蛋白质更短、更长或含有缺失和/或插入的ALS蛋白质)中的位置190、241和372，在本文中被定义为在该蛋白质中这样的位置，其中当利用标准序列比对方法，例如BLASTP(Altschul，Nucl.Acids Res.1997 25：3389-3402；Schaffer，Bioinformatics 1999 15：1000-1011)，使用缺省参数时比对野生型里氏木霉ALS蛋白质和其它蛋白质时，所述位置对应于(即，与之对齐或在对面(lie across from))野生型里氏木霉ALS蛋白质的位置190、241和372。通常，ALS蛋白质是详细表征的酶，已经经过详细的功能性和结构性研究。ALS蛋白质已经在多个出版物上综述过(参见例如：Chipman，Biochim.Biophys.Acta 1998 1385：401-19；Chipman，Curr.Opin.Chem.Biol.20059：475-81)，并且已经被结晶(参见例如：Pang，J.Biol.Chem.2004279：2242-53；Pang，J.MoI.Biol.2002 317：249-62)，并被经过突变鉴别必需和非必需残基(参见例如：Ibdah，Biochemistry 1996 35：16282-91；Mendel J.MoI.Biol.2001 307：465-771；Hill，Biochem.J.1998335：653-61)。其它赋予除草剂抗性的突变也是已知的(参见例如：Jung，Biochem.J.2004 383：53-61；Duggelby，Eur.J.Biochem.2003270：2895-904)。此外，数百种ALS蛋白质的氨基酸序列也是已知的，可通过NCBI的GenBank数据库公开获得。因此，可以对目标ALS蛋白质进行多种氨基酸改变，其中一些可以在不破坏其活性的条件下赋予对ALS抑制剂的抗性，是显而易见的。
在一些情况下，本文中描述的氨基酸改变可以转用于来自任何物种的任何其它ALS蛋白，使所述蛋白产生除草剂抗性。换言之，任何其它ALS蛋白质的位置190、241或372(相对于SEQ ID NO：1)的氨基酸都可以分别用酸性氨基酸(例如：Asp或Glu)、酸性氨基酸(例如：Asp或Glu)或His取代，使ALS蛋白质产生对ALS抑制剂的抗性。
例如，一些真菌物种的ALS蛋白质的氨基酸序列是已知的，储存在NCBI的Genbank数据库中。在一些实施方案中，上述氨基酸改变可以转用于这些真菌的ALS蛋白质，从而提供其它的ALS抑制剂-抗性蛋白质。在其它实施方案中，其它真菌的ALS蛋白质的氨基酸序列可用于在基于目标里氏木霉的ALS蛋白质中产生进一步的改变，但不破坏这些蛋白质的ALS活性。例如，可以生产来自不同物种的两种ALS蛋白质的融合体，或者含有氨基酸取代、缺失或插入的蛋白质。来自其它真菌物种，包括其它的丝状真菌物种的示例性ALS氨基酸序列，储存在NCBI的Genbank数据库中，如GIDS：39977967和2547090(稻瘟菌(Magnaporthe grisea))，GID：85108881(粗糙麦孢菌(Neurospora crassa))，GID：46108408(玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae))，GID：90302929(粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis))，GID：67537572(构巢曲霉(Aspergillus nidulans))；GID：70999742(烟曲霉(Aspergillus fumigatus))；GID：83767597和83771596(米曲霉(Aspergillus oryzae))；  GID：111063308(小麦颖枯病病菌(Phaeosphaeria nodorum))，GID：50547615(解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica))，GID：49657303(汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii))，GID：68468265(白假丝酵母(Candida albicans))，GID：21615550(扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera))，GID：49641223(乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))；GID：49527687(光滑假丝酵母(Candida glabrata))和GID：817866(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))。上述参考的Genbank登录号通过引用全文整合，包括其中的核酸和蛋白质序列，和在本专利申请最早提交日期之前的这些序列的注释。
由于遗传密码的冗余性，目标多核苷酸可以包含多个核酸序列中的任一个。在特定的实施方案中，目标多核苷酸可具有这样的核苷酸序列：a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4至少70％同一性(例如：至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)，或b)在严谨的杂交条件下与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4杂交，所述SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4序列分别描述了里氏木霉的野生型cDNA和基因的核苷酸序列。因此，编码多核苷酸可以含有内含子，或可以含有编码蛋白质的单个可读框。
显而易见的，在一些实施方案中，多核苷酸可具有编码具有下列一个或多个的蛋白质的核苷酸序列：a)位于位置190的酸性氨基酸(例如：Asp或Glu)，b)位于位置241的酸性氨基酸(例如：Asp或Glu)，或位于位置372的His。
在两条核酸序列的情况下，术语“同一性”指当比对为最大对应时，利用任何下列序列比较算法测量的两条序列中相同的的核苷酸残基。用于比较的优化的序列比对可以通过以下算法进行，例如：Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，Pearson&Lipman，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 85：2444(1988)的寻找相似性方法，这是通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin遗传软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)中提供的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过目测。
适合确定序列相似性的算法的实例是BLAST算法，描述在Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。用于实施BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心的万维网址(www)ncbi.nlm.nih.gov公开获得。BLAST算法对两条序列之间的相似性实施统计学分析(参见例如Karlin&Altschul，Proc.Nat′I.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。SEQID NO：2或4的至少100、至少500、至少1000，直到全长的核苷酸序列都可用于序列比较。
如上述，多核苷酸可以包括在严谨条件下与具有SEQ ID NO：2或4的核苷酸序列的多核苷酸杂交的核苷酸序列，其中严谨的杂交条件涵盖了低、中、高和极高严谨的杂交条件。
“低严谨”条件指用1 x SSC/0.1％SDS溶液在20℃洗涤15分钟。“中严谨”条件指用1 x SSC/0.1％SDS溶液在65℃洗涤60分钟。“高严谨”条件指用0.2 x SSC/0.1％SDS溶液在65℃洗涤10分钟。“极高严谨”条件指用0.2 x SSC/0.1％SDS溶液在65℃洗涤60分钟。
杂交方法详细描述在Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(第2版，1989 Cold Spring Harbor，NY)中。在一个示例性杂交测定中，通过琼脂糖凝胶(例如0.8％琼脂糖)电泳DNA样品，从而可以通过溴化乙锭染色观察DNA片段。然后在蒸馏H2O中短暂漂洗凝胶，然后在合适的溶液中(例如：0.25M HCl)轻柔振荡来脱嘌呤，再轻柔振荡变性30分钟(例如在0.4M NaOH中)。可以包括复性步骤，其中将凝胶置于1.5M NaCl，1M Tris，pH7.0中轻柔振荡30分钟。然后利用转移溶液(例如：6 x SSC，即，900mM NaCl，90mM柠檬酸三钠)，将DNA转移到合适的带正电膜上，例如Maximum Strength NytranPlus膜(Schleicher&Schuell，Keene，N.H.)。一旦完成转移，一般在大约2小时后，将膜在例如2 x SSC(300mM NaCl，30mM柠檬酸三钠)中漂洗，室温空气干燥。可以在合适的预杂交溶液(例如：每100mL含有20-50mL甲酰胺，25mL 20 x SSPE(1 x SSPE＝0.18M NaCl，1mM EDTA，10mM NaH2PO4，pH 7.7)，2.5mL的20％SDS和1mL的10mg/mL剪切的鲱精DNA的水溶液)中对膜预杂交(进行约2小时或更久)。本领域技术人员已知，预杂交溶液中甲酰胺的量可以根据由常规方法获得的反应的性质变化。因此，对于鉴别杂交分子，较少量的甲酰胺可以获得比使用更大量甲酰胺的相同方法更完全的杂交。在另一方面，利用更多甲酰胺可以更容易的视觉鉴定出强杂交带。
在杂交测定或序列比较中可以使用至少100、至少500、至少1000，直到全长的SEQ ID NO：2或4的DNA探针。DNA探针可以通过在琼脂糖凝胶中电泳分离，从凝胶切出片段，并从切出的琼脂糖中回收。可以标记该纯化的DNA片段(根据生产商的说明，利用例如：Megaprime标记系统)，从而在DNA中掺入P32。将标记的探针加热至95℃进行5分钟来变性，并立即添加到膜和预杂交溶液中。杂交反应应该在合适的条件下进行合适的时间，例如，在37℃轻柔振荡或旋转，进行18小时。漂洗膜(例如，在2 x SSC/0.3％SDS中)，然后在合适的洗涤溶液中洗涤，如上述，伴随轻柔振荡。可以通过放射自显影检测杂交。
在特定的实施方案中，多核苷酸可以是为在特定宿主细胞中表达而密码子优化的。在其它实施方案中，多核苷酸可以具有这样的核苷酸序列，其与特定宿主细胞的野生型ALS序列(例如基因组或cDNA序列)相比，包含少于10个(例如：9、8、7、6、5、4、3、2或1个)个差异，其中在所述特定宿主细胞中所述多核苷酸待被使用。
在一些情况下，除了编码序列外，多核苷酸还可以含有其它在宿主细胞内表达编码蛋白质所需要的元件。例如，在一个实施方案中，多核苷酸可以被序列侧接形成表达盒，所述表达盒提供编码蛋白质在宿主细胞内的表达。在一些实施方案中，表达盒可以含有用于编码序列转录的启动子，和转录终止子，和编码允许翻译起始的5’非翻译区(UTR)的序列，均与编码序列有效地连接。用于多种宿主细胞的启动子、增强子、终止子、UTR、多聚腺苷酸化信号和其它调控序列，特别是来自植物、细菌和真菌的那些都是本领域普遍已知的(参见例如：Ausubel等人，Short Protocols inMolecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989 Cold SpringHarbor，N.Y.)。
在特定的实施方案中，目标表达盒可以含有用于在丝状真菌细胞中表达目标蛋白质的启动子和终止子。用于指导目标核酸在丝状真菌宿主细胞内转录的合适的启动子和终止子的实例是自以下的基因获得的启动子和终止子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、腹状镰孢(Fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；及其突变、截短和杂合的启动子。
启动子和/或终止子可以是对要在其中表达目标ALS蛋白质的宿主细胞而言天然的或非内源性的，在一些实施方案中，启动子和终止子可以是来自宿主细胞的ALS基因启动子和终止子。例如，在一个实施方案中，在里氏木霉细胞中使用的表达盒可以包含有效连接中的里氏木霉ALS基因启动子、里氏木霉ALS编码序列(含有上文概括的一个或多个核苷酸改变)和里氏木霉ALS终止子(图3)。启动子和/或终止子可以来自要使用所述多核苷酸的宿主细胞的ALS基因。
多核苷酸可以被整合到宿主细胞的基因组中，或者存在于在宿主细胞内自主复制的载体上。
重组核酸
还提供了包含目标多核苷酸的重组核酸。目标重组核酸可以包含目标多核苷酸，例如用于在宿主细胞内生产赋予抗性的ALS蛋白质的表达盒，以及用于在宿主细胞内表达目的蛋白质的第二表达盒。在特定的实施方案中，目标多核苷酸用作标记，来将含有重组核酸的宿主细胞从不含有重组核酸的其它细胞选择出来(即，目标多核苷酸用作含有目标多核苷酸的细胞的“选择性标记”)。
由第二表达盒所编码的目标蛋白质可以是例如：酶、治疗性蛋白质、报告蛋白、食品添加剂或食品等。
在一个实施方案中，例如，由第二表达盒编码的目标蛋白质可以是酶，如糖酶，例如：α-淀粉酶、碱性α-淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶；葡聚糖酶(dextranase)、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶、转化酶、乳糖酶、柚苷酶(naringanase)、果胶酶或支链淀粉酶；蛋白酶例如：酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、粗制凝乳酶、凝乳酶(rennin)、凝乳酶(chymosin)、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或胰蛋白酶；脂肪酶或酯酶，例如：甘油三酯酶、磷脂酶、胃前酯酶(pregastric esterase)、磷酸酶、肌醇六磷酸酶、酰胺酶、亚氨基酰基转移酶(iminoacylase)、谷氨酰胺酶、溶菌酶或青霉素酰基转移酶；异构酶，例如：葡糖异构酶；氧化还原酶，例如：氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、葡糖氧化酶、羟类固醇脱氢酶或过氧化物酶；裂合酶，例如：乙酰乳酸脱羧酶、天冬氨酸β-脱羧酶、fumarese或histadase；转移酶，例如环糊精糖基转移酶；或连接酶。在特定的实施方案中，例如，蛋白质可以是氨肽酶、羧肽酶、壳多糖酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、果胶分解酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶或转谷氨酰胺酶。酶可以是野生型酶或野生型酶的变体。此外，酶可以是包括不同酶的片段的杂交酶。
在其他实施方案中，由第二表达盒编码的目的蛋白质可以是治疗性蛋白(即，具有治疗性生物学活性的蛋白质)。合适的治疗性蛋白的实例包括：促红细胞生成素，细胞因子例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-o，和粒细胞-CSF，GM-CSF，凝固因子例如因子VIII、因子IX，和人蛋白C，抗凝血酶III，凝血酶，可溶性IgE受体-α-链，IgG，IgG片段，IgG融合体，IgM，IgA，白介素，尿激酶，糜蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制剂，IGF-结合蛋白，表皮生长因子，生长激素释放因子，膜联蛋白V融合蛋白，制管张素，血管内皮生长因子-2，骨髓祖代抑制因子-1(myeloid progenitorinhibitory factor-1)，护骨蛋白，α-1-抗胰蛋白酶，甲胎蛋白，DNA酶II，人纤维蛋白溶酶原的三环(Kringle)3，葡糖脑苷脂酶，TNF结合蛋白1，促卵泡激素，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig，跨膜激活子和钙调谐子和亲环蛋白配体，可溶性TNF受体Fc融合体，胰高血糖素样蛋白质1和IL-2受体激动剂。抗体蛋白，例如可以人源化的单克隆抗体是令人特别感兴趣的。
在另一个实施方案中，由第二表达盒编码的蛋白质可以是报告蛋白。例如，此类报告蛋白可以是光学可检测的或生色的。在该实施方案中，蛋白质可以是β-半乳糖苷酶(lacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、荧光素酶、碱性磷酸酶、胭脂碱合酶(NOS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、辣根过氧化物酶(HRP)或荧光蛋白绿(fluorescent protein green)，例如：绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物。
在一些实施方案中，特别是那些宿主细胞是丝状真菌宿主细胞的实施方案中，第二表达盒的编码序列可以编码融合蛋白。在一些这类实施方案中，融合蛋白可以供蛋白质从表达它的宿主细胞内分泌，从而可以含有与蛋白质的N-末端有效连接的信号序列，其中，信号序列含有导向蛋白质到宿主细胞的分泌系统的氨基酸序列，导致所述蛋白质从宿主细胞内分泌到所述宿主细胞生长的培养基中。在蛋白质分泌前从融合蛋白上切除信号序列。使用的信号序列对宿主细胞可以是内源性的或非内源性的，在一些实施方案中，可以是已知从宿主细胞高分泌的蛋白质的信号序列。在特定的实施方案中，信号序列蛋白可以是任何有利于蛋白质从丝状真菌(例如：木霉属(Trichoderm)或曲霉属(Aspergillus))宿主细胞分泌的信号序列。此类信号序列包括但不限于：例如，纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶III、α-淀粉酶、天冬氨酰蛋白酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、糖苷酶和大麦内肽酶B(参见：Saarelainen，Appl.Environ.Microbiol.1997 63：4938-4940)的信号序列。其它的信号序列是那些源自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA)，α因子基因(酵母，例如：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和汉逊酵母属(Hansenula))或α淀粉酶基因(芽胞杆菌属(Bacillus))的信号序列。因此，在一些实施方案中，目标重组核酸可以包含：与编码蛋白质的核酸有效连接的编码信号序列的核酸，其中核酸在宿主细胞内的翻译产生了包含这样的蛋白质的融合蛋白，所述蛋白质具有用于蛋白质从宿主细胞分泌的N-末端信号序列。
在特定的实施方案中，融合蛋白还可以含有“载体蛋白”，其是宿主细胞高分泌的内源性蛋白质的一部分。合适的载体蛋白包括里氏木霉甘露聚糖酶I(Man5A或MANI)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(Cel6A或CBHII)(参见例如：Paloheimo等人，Appl.Environ.Microbiol.2003年12月；69(12)：7073-7082)或里氏木霉纤维二糖水解酶I(CBHI)的载体蛋白。在一个实施方案中，载体蛋白是截短的里氏木霉CBH1蛋白，其包括CBH1核心区和CBH1接头区的一部分。因此，提供了从氨基端至羧基端，含有有效连接的信号序列、载体蛋白和目标蛋白的融合蛋白，以及编码所述融合蛋白的核酸。
在一些实施方案中，多核苷酸可以为蛋白质在特定宿主细胞内的表达而密码子优化。由于列举在多种细胞内每种密码子选择的密码子选择表是本领域已知的(参见例如：Nakamura等人，Nucl.Acids Res.2000 28：292)或可以方便的推断的，因此，在给出待表达的蛋白质的氨基酸序列时，可以方便的设计此类核酸。
目标重组核酸可以存在于，例如整合到宿主细胞的基因组(即核基因组)中，或者可以存在于在宿主细胞内自主复制的载体中，例如：噬菌体、质粒、病毒或逆病毒载体。在一些实施方案中，载体可以是用于在宿主细胞内表达蛋白质的表达载体，因此其还可以含有上述的第二表达盒。在一些实施方案中，载体可以是用于在丝状真菌细胞内表达重组多肽的表达载体。
用于表达重组蛋白的载体是本领域普遍已知的(Ausubel等人，ShortProtocols in Molecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)ColdSpring Harbor，N.Y.)。
选择方法
还提供了用于选择含有目标多核苷酸的宿主细胞的方法。在一些实施方案中，方法包括将目标多核苷酸引入多个细胞内，将所述多个细胞与ALS抑制剂接触，例如毒性的磺酰脲类或咪唑啉酮化合物，以及培养细胞供细胞的选择。可以在固体培养基上选择细胞，例如通过将多个细胞放置到含有ALS抑制剂的琼脂平板上；或者在液体培养基中选择细胞，例如通过将多个细胞培养在含有ALS抑制剂的液体培养基中。
在一些实施方案中，目标选择方法可以用于选择含有编码目的蛋白的第二表达盒的细胞。第二表达盒可以存在于重组核酸中，所述重组核酸也含有即时的编码ALS蛋白的多核苷酸(即，在单个重组的核酸分子中)。在这些实施方案中，即时选择方法可用于选择含有重组核酸的细胞。由于重组核酸也含有第二表达盒，利用ALS抑制剂可选择含有第二表达盒的细胞。在可选的实施方案中，第二表达盒可存在于不含有即时的编码ALS蛋白的多核苷酸的重组核酸上(即，不同的载体)。在这类实施方案中，目标多核苷酸可以与含有表达盒的分离的且不同的多核苷酸分子(例如：不同的核酸分子或载体)共转化(即，与其同时转化)。因此，即时选择方法可用于选择含有第二表达盒的细胞，即使所述第二表达盒与多核苷酸位于不同的核酸分子上。
因此，目标选择方法可用于选择表达目的蛋白的宿主细胞。目的蛋白对所使用的宿主细胞可以是天然的或非天然的。
使用的ALS抑制剂的实际浓度可以根据所使用的特定ALS抑制剂和所选择的宿主细胞的类型而异。一般而言，ALS抑制剂使用提供对含有多核苷酸的宿主细胞的选择的浓度。在一些实施方案中，ALS抑制剂可以使用0.5ppm至10,000ppm的浓度，例如：1ppm至10,000ppm，或10ppm至1,000ppm。例如，在一些情况下，ALS抑制剂可以使用25ppm至100ppm的浓度范围，例如50ppm或100ppm；或者使用100ppm至500ppm的浓度范围，例如200ppm或500ppm。例如，在一个实施方案中，ALS抑制剂可以使用1μg/ml至1mg/ml的浓度范围，例如10μg/ml至500μg/ml。
ALS抑制剂包括以下任何化合物：a)杀死不具有通过抑制ALS酶的对所述化合物抗性的细胞，和b)不杀死具有目标多核苷酸的细胞。特别感兴趣的ALS抑制剂包括已知是ALS抑制剂的磺酰脲(SU)、咪唑啉酮(IMI)、三唑并嘧啶(TP)、嘧啶基硫代苯甲酸(PTB)和磺酰氨基-羰基-三唑啉酮(SCT)化合物，在一些情况下，可以是一般使用的除草剂。可以在目标方法中使用的磺酰脲化合物的实例包括：I)苯基磺酰脲，包括a)氯嘧磺隆(参见W.T.Thompson的Agricultural Chemicals Book II″Herbicides″，Thompson Publications，Fresno Calif.，U.S.A.1990，第152页)；b)氟嘧黄隆(CGA 136，872，参见Brighton Crop Prot.Conf.″Weeds″1989，第41-48页)，c)3-(4-乙基-6-甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-1-(2，3-二氢-1，1-二氧代-2-甲基苯并[b]噻吩-7-磺酰基)-脲(参见例如：EP-A-79，683)；d)3-(4-乙氧基-6-乙基-1，3，5-三嗪-2-基)-1-(2，3-二氢-1，1-二氧代-2-甲基苯并[b]噻吩-7-磺酰基)脲(参见例如：EP-A-79，683)，e)苯磺隆(参见“The PesticideManual″，British Crop Protection Council，第9版(1990/91)，第840页)，f)甲磺隆(参见Proc.Int.Congr.Plant Prot.，第10，1983，卷1，324)；g)氯磺隆(参见美国专利号4,127,405；Weeds Weed Control，1980，第21，24)；h)醚苯磺隆(参见“The Pesticide Manual”第9版，第837页)和i)甲嘧磺隆(参见“The Pesticide Manual”第9版，第774页)；II)噻吩基磺酰脲类，例如，噻吩磺隆(参见Agricultural Chemicals Book II″Herbicides″由W.T.Thompson著，Thompson Publications，FresnoCalif.，U.S.A.1990，第155页)；III)吡唑基磺酰脲类，例如：a)吡嘧磺隆(NC 311，参见“The Pesticide Manual”第9版，第735页)和b)甲基3-氯代-5-(4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基氨磺酰)-1-甲基-吡唑-4-羧酸酯(参见EP 282,613)；IV)砜肼(sulfonediamide)衍生物，例如：酰嘧磺隆和结构类似物(参见EP-A-0,131,258和Z.Pfl.Krankh.Pfl.Schutz，Special Issue XII，489-497(1990)；V)吡啶基磺酰脲类，例如：a)烟嘧磺隆(SL-950，参见Kimura等人，Brighton Crop Protection Conference″Weeds″1989，第29-34页)；b)DPX-E 9636(参见Brighton Crop Prot.30 Conf.-Weeds-1989，第23页以及下列等等)和c)如德国专利申请P4000503.8(WO-91/10660)和P 4030577.5中描述的吡啶磺酰脲类，和VI)苯氧基磺酰脲类，例如在如EP-A-0,342,569、EP-A-4,163、EP-A-113,956、美国专利号4,678,500和美国专利号4,581,059中描述的。在目标方法中可以使用的咪唑啉酮类化合物的实例包括：a)咪唑乙烟酸(参见Ch.R.Worthing的“The Pesticide Manual”第8版，1987，由British CropProtection Council著，第473页)b)灭草喹(参见Ch.R.Worthing的“ThePesticide Manual”第8版，1987，由British Crop Protection Council著，第474页)，和c)imazethamethapyr(化学名：外消旋-2-[4，5-二氢4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧代-1H-咪唑-2-基]-5-甲基-3-吡啶-羧酸；参见WeedTechn.1991(5)，430-433和434-438)和其它相关的化合物。
宿主细胞
还提供了包含目标重组核酸的宿主细胞。宿主细胞可以是任何细胞类型，例如：细菌(例如：大肠杆菌，芽孢杆菌属或链霉菌属)，真菌(例如非丝状真菌或丝状真菌)，或植物(例如拟南芥、玉米或大豆植物)宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以是具有用于生产具有GRAS状态的蛋白质的历史的物种的细胞，即FDA通常认证为安全的。
在特定的实施方案中，目标宿主细胞可以是以下物种的真菌细胞：特别是，木霉属(Trichoderma)(例如：里氏木霉(原分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，现也已知为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum))；青霉属物种(Penicillium sp.)；腐质霉属物种(Humicola sp.)(例如：特异腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicolagrisea))；金孢子菌属物种(Chrysosporium sp.)(例如：C.lucknowense)；粘帚霉属物种(Gliocladium sp.)；曲霉属物种(Aspergillus sp.)(例如：米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、Aspergillus kawachi、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori))；镰孢属物种(Fusarium sp.)；毛霉属物种(Mucor sp.)；脉孢菌属物种(Neurospora sp.)；肉坐菌属物种(Hypocrea sp.)或翘孢霉属物种(Emericella sp.)(还参见：Innis等人，(1985)Sci.228：21-26)等。
示例性细菌宿主细胞包括芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽胞杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、灿烂芽胞杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，以及链霉菌属(Streptomyces sp.)，包括但不限于：变铅青链霉菌(S.lividans)、放线菌链霉菌(S.carbophilus)和淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)。
示例性植物宿主细胞包括单子叶和双子叶植物细胞，包括但不限于玉米(玉蜀黍(Zea mays))、芸苔属物种(Brassica sp.)、稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)和鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)和番茄(Lycopersicon esculentum)宿主细胞。宿主细胞可以是体外培养的宿主细胞，或者多细胞生物即植物的宿主细胞。转移外源性核酸入此类宿主细胞内的方法是本领域普遍已知的。
在特定的实施方案中，目标真菌细胞可以是木霉属的菌株，特别是里氏木霉，其包括RL-P37的功能性等价物(Sheir-Neiss等人，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53)。其它有效的宿主菌株包括：NRRL15709、ATCC 13631、ATCC 26921(QM 9414)、ATCC 32098、ATCC 32086和ATCC 56765(RUT-30)。在其它实施方案中，目标真菌宿主细胞可以是曲霉属的菌株，包括ATCC 22342、ATCC 44733、ATCC 14331、ATCC11490、NRRL 3112，及其来自其的菌株。
在一些实施方案中，宿主细胞可以是其中天然的基因已经缺失或失活的细胞。例如可以删除或灭活对应蛋白酶基因(例如天冬氨酰蛋白酶)的基因(Berka等人，(1990)Gene 86：153-162和USP 6,509,171)，或者对应于纤维素酶基因的基因(例如：cbh1、cbh2以及egl1和egl2)，例如在WO 05/001036中公开的四删除(quad deleted)的里氏木霉菌株及其衍生物。
将核酸引入宿主细胞包括以下技术，例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂转染介导的和DEAE-糊精介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。常规的转化技术是本领域普遍已知的(参见例如：Ausubel等人，(1987)，上文，第9章；和Sambrook(1989)，上文，和Campbell等人，(1989)Curr.Genet.16：53-56)。还可参考WO 05/001036；USP 6,022,725；USP 6,103,490；USP 6,268,328；和公开的美国专利申请20060041113，20060040353，20060040353和20050208623，其公开文本通过引用整合入本文中。
曲霉属和木霉属中的转化和蛋白质表达还描述在例如美国专利号5,364,770；美国专利号6,022,725；和Nevalainen等人，1992，The MolecularBiology of Trichoderma and its Application to the Expression of BothHomologous and Heterologous Genes，在MOLECULAR INDUSTRIALMYCOLOGY，编著Leon和Berka，Marcel Dekker公司，第129-148页中。
如上所述，除了ALS-编码核酸外，目标宿主细胞还可以含有用于在宿主细胞内表达目的蛋白的重组核酸。目标重组核酸和ALS-编码核酸可以顺式的紧密连接在基因组或者质粒中，因此，ALS抑制剂选择重组核酸，从而选择了生产蛋白质的细胞。
蛋白质生产
还提供了利用上述宿主细胞的方法。在一些实施方案中，目标方法包括：培养包含重组核酸的细胞来生产蛋白质，所述重组核酸包含用于生产目标ALS酶的第一表达盒，和用于生产蛋白质的第二表达盒。如上文讨论的，在一些实施方案中，蛋白质可以分泌到培养基中。因此，方法的一些实施方案包括从培养基中回收蛋白质的步骤。
细胞可以培养在含有生理盐和营养物的标准培养基中(参见例如：Pourquie，J等人，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION，编著Aubert，J.P等人，Academic Press，第71-86页，1988，和Ilmen，M.等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306)。常规的商业制备的培养基(例如：酵母麦芽提取物(YM)培养基、LuriaBertani(LB)培养基和沙氏葡萄糖(SD)培养基)也可用于本发明。用于指定丝状真菌的优选的培养条件是本领域已知的，并可以从科学文献和/或真菌的来源例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和真菌遗传储存中心(Fungal Genetics Stock Center)获得。
在一些实施方案中，目标宿主细胞可以在分批或连续发酵条件下培养。经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且在发酵过程中不经历人工改变。因此，在发酵开始时，用想要的生物接种培养基。在该方法中，允许在不向系统添加任何组分的条件下产生发酵。通常，分批发酵作为“批”的限定是涉及碳源的添加，并通常试图控制因子，例如pH和氧浓度。分批系统的代谢物和生物量组成持续改变至发酵结束的时间点。在分批培养中，细胞通过静态滞后期到快速生长对数期并最终到稳定来进展，其中在稳定期中生长率消失或停止。如果不处理，在稳定期的细胞将最终死亡。一般，对数期的细胞负责生产终产物的绝大部分。
标准分批系统的变体是“补料分批发酵”系统，也可用于本发明。在该典型分批系统的变体中，随发酵进展以增量添加底物。当分解代谢物阻抑倾向于抑制细胞代谢且需要在培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是有用的。补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，因此基于可测量因子(例如pH，溶解氧，和废气如CO2的分压)的改变来评估。分批和补料分批发酵是常规的和本领域已知的。
连续发酵是开放的系统，其中，向生物反应器中持续添加确定的发酵培养基，并同时移去等量的条件培养基用于处理。连续发酵一般使培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要位于对数期生长。
连续发酵允许调控影响细胞生长和/或终产物浓度的一个因子或任何数量的因子。例如，在一个实施方案中，将有限的营养物例如碳源或氮源维持在固定的比率，使所有其它参数适度。在其它系统中，可以持续的改变影响生长的许多因子，同时保持通过培养基浊度测量的细胞浓度恒定。连续系统力争维持稳态生长条件。因此，在发酵中由于提出培养基造成的细胞损失必须针对细胞生长率来平衡。调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法，以及使产物形成速率最大化的技术是已知的。
可以在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养真菌宿主细胞(参见例如：Pourquie，J.等人，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OFCELLULOSE DEGRADATION，编著Aubert，J.P.等人，Academic Press，第71-86页，1988和Ilmen，M.等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306)。常规的商业制备的培养基(例如：酵母麦芽提取物(YM)培养基、Luria Bertani(LB)培养基和沙氏葡萄糖(SD)培养基)也可用于本发明。用于真菌宿主细胞的优选的培养条件是本领域已知的，并可以从科学文献和/或真菌的来源例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和真菌遗传储存中心获得。
可以从生长培养基中通过任何方便的方法回收蛋白质，例如，通过沉淀、离心、亲和、过滤或任何其它本领域已知的方法。在另一个实施方案中，提供了细胞培养物，其中，细胞培养物包括：a)生长培养基和b)上述的宿主细胞。
1818A和1818B启动子
还提供了用于在宿主细胞内表达蛋白质的启动子。在一个实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列(分别显示在图5A和5B中)，或其在宿主细胞内具有启动子活性的子序列(subsequence)或功能等价物。还提供了含有启动子的重组核酸和载体，和含有重组核酸或载体的宿主细胞。还提供了利用宿主细胞生产蛋白质的方法。
在一些实施方案中，启动子可以包含以下的核苷酸序列：a)SEQ IDNO：7或8；b)保持启动子活性的SEQ ID NO：7或8的子序列；c)保持启动子活性的SEQ ID NO：7或8的功能等价序列；或d)在严谨杂交条件下与SEQ ID NO：7或8，或其子序列杂交的核酸序列。在特定的实施方案中，核苷酸序列可以与SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列至少80％同一。
在特定的实施方案中，目标启动子的子序列可以含有在SEQ ID NO：7或8中连续的至少约100个核苷酸，至少约200个核苷酸；至少约250个核苷酸；至少约300个核苷酸；至少约350个核苷酸；至少约400个核苷酸；至少约450个核苷酸；至少约500个核苷酸；至少约550个核苷酸；至少约600个核苷酸；至少约650个核苷酸；至少约700个核苷酸；至少约800个核苷酸；至少约850个核苷酸；SEQ ID NO：7或8的完整的连续序列，或其维持启动子活性的功能性等价物。
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列，功能性等价的启动子可以包括一个或多个改变(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9个，超过10个，多达20或30个或更多个改变)，其中改变例如可以是缺失、取代或插入。在一个示例性实施方案中，相对于母启动子，例如SEQID NO：7或8的核苷酸序列，功能性等价的启动子的核苷酸序列可以包括1至5个核苷酸差异。
在其它实施方案中，启动子可以包括在严谨的杂交条件下，与具有SEQ ID NO：7或8的核苷酸序列的多核苷酸杂交的核苷酸序列，其中严谨的杂交条件涵盖了低、中、高和极高的严谨杂交条件，其中，此类条件如上述。
在另一个实施方案中，目标启动子可以包含与SEQ ID NO：7或8，或其子序列至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一的连续的核苷酸序列。在一个实施方案中，目标启动子可以包含与SEQ ID NO：7或8至少95％同一的连续的核苷酸序列。
如下列实施例章节中所述，核酸SEQ ID NO：7或8是自丝状真菌里氏木霉中获得的。显而易见的，可以通过鉴别其它丝状真菌中与SEQ ID NO：7或8相似的序列，来鉴别保持启动子活性的SEQ ID NO：7或8的功能性等价物。由于其它丝状真菌的大部分或全部的基因组序列都是可获得的，例如曲霉属(如：烟曲霉、米曲霉(参见例如：Machida等人，Nature 2005438，1157-1161)、构巢曲霉、烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉(Aspergillus flavus)、土曲霉(Aspergillus terreus))，脉孢菌属(如：粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa))和镰孢属(如：禾本科镰孢(Fusarium graminearum))，因此，具有启动子活性的SEQ ID NO：7或8的功能性等价物是可以容易可鉴别的。
如上述，目标启动子可以在宿主细胞内具有启动子活性。启动子活性可以利用任何合适的测定来检测。在一些实施方案中，目标启动子可以有效地连接多核苷酸，可以利用任何合适的方法检测多核苷酸的转录，例如：Northern印迹或RT-PCR等。在其它实施方案中，启动子可以有效地连接至编码蛋白质(例如报告蛋白)的多核苷酸上，可以通过检测蛋白质来评估启动子的活性。在这类实施方案中，如果需要，5’非翻译区可以连接至启动子，从而使获得的转录物具有5’UTR，其后为编码序列。可以认为，自此类测定获得的结果可以与自合适的对照获得的结果相比，例如阴性对照或阳性对照，来确定所获得的结果的显著性。可以使用任何宿主细胞，例如细菌宿主细胞(如大肠杆菌、芽孢杆菌属或链霉菌属宿主细胞)或者丝状真菌细胞(如曲霉属、木霉属或镰孢属)宿主细胞。对于目标启动子要包含在特定宿主细胞中没有要求。在一些情况下，可以在里氏木霉宿主细胞内对启动子来测试启动子活性。
还提供了包含目标启动子的重组核酸。在一些情况下，重组核酸可以包含目标启动子和多核苷酸，其中启动子和多核苷酸是有效地连接的，使启动子导致多核苷酸在细胞内的转录。在一些情况下，启动子和多核苷酸通常不是天然的连接的，即，是彼此异源性的。在一些情况下，多核苷酸可以含有蛋白质的编码序列。如上述，蛋白质可以是例如酶、报告蛋白或治疗性蛋白质(例如：抗体蛋白质)。在一些实施方案中，蛋白质可以是融合蛋白，其在一些情况下可以含有信号序列或载体部分，用于蛋白质的分泌。
还提供了包含目标重组核酸的核酸载体，以及包含它的宿主细胞。在一些实施方案中，重组核酸可以存在于宿主细胞的基因组中。在其它实施方案中，重组核酸可以存在于在细胞内复制的载体中。宿主细胞可以是任何的多种不同的宿主细胞，包括细菌、真菌、酵母、植物和哺乳动物宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞可以是丝状真菌宿主细胞，在另一个实施方案中，宿主细胞可以是细菌细胞。
还提供了包含培养基和目标宿主细胞的细胞培养物。
还提供了生产蛋白质的方法，一般而言，该方法包括在适合生产蛋白质的条件下维持目标细胞培养物。该方法还可以包括从培养基中回收蛋白质。
为了进一步示例本发明及其优点，提供下列特定的实施例，需理解所述实施例是供示例本发明，不应该以任何方式理解为限制其范围。
实施例1：从氯嘧磺隆-抗性细胞中分离ALS基因
新鲜制备的氯嘧磺隆(化学服务有限公司(Chem Service Inc.)，WestChester，PA)，以20mg/ml的浓度溶解在DMF中，将其以不同的浓度添加到熔融的Vogels琼脂中(之后立刻倾注平板)，以产生含有25、50、100、200、300、400或500ppm氯嘧磺隆的培养基。
在每个平板上放入约2千5百万个里氏木霉菌株QM6a(ATCC 13631)孢子。在28℃生长10天后，分离5个菌落，2个来自50ppm平板，另外每个分别来自每个25、200和300ppm平板。通过将这些菌落在含有200ppm氯嘧磺隆的新鲜Vogels琼脂平板上重划线，来进一步分离克隆。
为了从这些菌株中扩增和测序乙酰乳酸合酶(als)基因，从5株氯嘧磺隆抗性菌株中分别制备基因组DNA。扩增根据生产商的说明书，使用Herculase DNA聚合酶(斯莱特因公司(Stratagene)，La Jolla，CA)和下列引物：正向：(5’-3’)
GGCGCGCCTGAGACAATGGCCGGCAATGGTAAAAA(SEQ ID NO：5)和反向(5′-3′)
GCGATCGCCATCCCGTCGCGTCAAAAACACTGC(SEQ ID NO：6)。
在引物的5’端添加独特的限制性位点，用于后续操作。将获得的4.1kb片段分离、测序和与天然的里氏木霉乙酰乳酸合酶基因的序列(来自JGI基因组网址)相比较。
鉴别出赋予对氯嘧磺隆抗性的als基因中的三个独特的点突变。
与野生型里氏木霉乙酰乳酸合酶蛋白质的序列相比(图1；SEQ IDNO：1)，每一个氯嘧磺隆-抗性的乙酰乳酸合酶蛋白都具有下列氨基酸取代之一：A190D、K241E或R372H。在SEQ ID NO：1的野生型里氏木霉乙酰乳酸合酶蛋白质的位置190、241和372的氨基酸用下划线表示。
与野生型里氏木霉乙酰乳酸合酶推断的cDNA序列(图2，SEQ IDNO：2)相比，每个氯嘧磺隆-抗性的乙酰乳酸合酶cDNA均具有下列核苷酸取代之一：C569A(这对应于A190D氨基酸取代)，A721G(这对应于K241E氨基酸取代)或G1115A(这对应于R372H氨基酸取代)。图2中指示了每个改变的密码子(GCC，其被改变为GAC；AAG，其被改变为GAG；和CGT，其被改变为CAT)。
与野生型里氏木霉乙酰乳酸合酶基因的序列(图3；SEQ ID NO：3)相比，每个氯嘧磺隆-抗性的乙酰乳酸合酶基因均具有下列核苷酸取代之一：C1023A(这对应于A190D氨基酸取代)，A1175G(这对应于K241E氨基酸取代)或G1569A(这对应于R372H氨基酸取代)。
由于遗传密码的简并性，als编码序列中的其它突变可以编码A190D、K241E或R372H氨基酸取代。
实施例2：用A190D乙酰乳酸合酶基因转化里氏木霉
制备pTrex-葡糖淀粉酶载体来表达里氏木霉中的来自里氏木霉的葡糖淀粉酶。图4描述了载体的一般图示。已经用不同的启动子：1818A、1818B和里氏木霉cbh1启动子制备了三个不同的载体构建体。图5A示例了命名为1818A的启动子序列，图5B示例了启动子1818B的序列。
包括cbh1的pTrex-葡糖淀粉酶的完整核苷酸序列示于图6中。pTrex-葡糖淀粉酶载体基于详细描述在WO 05/001036中的载体pTrex3g。简而言之，pTrex3g是基于大肠杆菌载体pSL1180(法玛西娅公司(Pharmacia，Inc.)，Piscataway，NJ)的，所述pSL1180是基于pUC118噬菌粒的载体，具有延伸的多克隆位点，其含有64个六联体限制性酶识别序列。它被命名为Gateway目的载体(Hartley，J.L.等人，(2000)Genome Research 10：1788-1795)，允许利用Gateway技术(英杰生命科学公司(Invitrogen))，在里氏木霉cbh1基因的启动子和终止子区域之间，插入任何想要的可读框。
在pTrex-葡糖淀粉酶载体中，A190D ALS基因是位于其天然的启动子和终止子的控制之下，用于替换在pTrex3g中使用的真菌选择性标记amdS。
利用下文概括的方法，将载体转化到最初来自RL-P37(Sheir-Neiss等人，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53；USP 4,797,361)的四删除(Δcbh1、Δcbh2、Δegl1、和Δegl2)的里氏木霉菌株(WO 05/001036)中。
制备来自木霉属菌株的孢子悬液(约5×108个孢子/ml)。100μl-200μl的孢子悬液涂布在具有200ppm氯嘧磺隆的经修饰Vogels培养基平板中央，使其干燥。
经修饰Vogels具有下列组成：2.5g/L柠檬酸三钠＊2H2O、5.0g/LKH2PO4、2.0g/L NH4NO3、0.2g/L MgSO4＊7H2O、0.1g/L CaCl2＊2H2O、5mL/L经修饰Vogels痕量元素溶液、2.5mL/L经修饰Vogels生物素溶液、20g/L琼脂经修饰Vogels痕量元素溶液(所述溶液含有50g/L柠檬酸、50g/L ZnSO4＊7H2O、10g/L Fe(NH4)2SO4＊6H2O、2.5g/L CuSO4＊5H2O、0.5g/L MnSO4＊4H2O、0.5g/L H3BO3、0.5g/L NaMoO4＊2H2O)。
经修饰Vogels生物素溶液含有0.1g/L d-生物素。在高压灭菌后，在倾注平板前进行下列添加：20mL/L的50％葡萄糖，10mL/L溶解了20mg/mL氯嘧磺隆的DMF。
根据生产商的说明，利用来自Bio-Rad(Hercules，CA)的PDS-1000/he微粒递送系统，通过生物射弹转化方法完成木霉菌株的转化(参见，WO 05/001036和US 2006/0003408)。
在28℃生长3-4天后分离转化体。为了分离稳定的单核，将转化体在有200ppm氯嘧磺隆的新鲜Vogels平板上连续传代2次。培养转化体，并通过SDS PAGE电泳和酶测定来测试培养上清液。图7显示了SDS PAGE凝胶，示例里氏木霉葡糖淀粉酶的表达。
实施例3：1818A和1818B启动子的测序和克隆
通过发掘美国能源部联合基因组研究所(US Department of EnergyJoint Genome Institute)的里氏木霉基因组序列数据库(在万维网址jgi.doe.gov中找到)中的高度代表性EST的上游序列，鉴别了1818A和1818B启动子(如图5A和5B中分别显示的)。
通过PCR扩增启动子，并根据图8中显示的载体图谱，将其在葡糖淀粉酶编码序列之后克隆。图9中显示的是该构建体的完整核苷酸序列。使用的载体是基于pTrex3g的，其详细描述在WO 05/001036的实施例6中。简而言之，pTrex3g是基于大肠杆菌载体pSL1180(法玛西娅公司(Pharmacia，Inc.)，Piscataway，NJ)的，所述pSL1180是基于pUC118噬菌粒的载体，具有延伸的多克隆位点，其含有64个六联体限制性酶识别序列。它被命名为Gateway目的载体(Hartley，J.L.等人，(2000)GenomeResearch 10：1788-1795)，允许利用Gateway技术(英杰生命科学公司(Invitrogen))，在里氏木霉cbh1基因的启动子和终止子区域之间，插入任何想要的可读框。在本实施例使用的载体中，用1818A或1818B启动子替换cbh1启动子，用由其天然的启动子和终止子驱动的里氏木霉乙酰乳酸合酶标记替换amdS选择性标记。
实施例4：用包含1818A和1818B启动子的载体转化里氏木霉宿主细胞
利用下文概括的方法，将载体转化到最初来自RL-P37(sheir-Neiss等人，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53和USP 4,797,361)的四删除(Δcbh1，Δcbh2，Δegl1和Δegl2)的里氏木霉菌株(WO 05/001036)中。
制备来自木霉菌株的孢子悬液(约5×108个孢子/ml)。将100μl-200μl的孢子悬液涂布在具有200ppm氯嘧磺隆的经修饰Vogels培养基平板中央。经修饰Vogels具有下列组成：2.5g/L柠檬酸三钠＊2H2O、5.0g/LKH2PO4、2.0g/L NH4NO3、0.2g/L MgSO4＊7H2O、0.1g/L CaCl2＊2H2O、5mL/L经修饰Vogels痕量元素溶液、2.5mL/L经修饰Vogels生物素溶液、20g/L琼脂经修饰Vogels痕量元素溶液，所述溶液含有50g/L柠檬酸、50g/L ZnSO4＊7H2O、10g/L Fe(NH4)2SO4＊6H2O、2.5g/L CuSO4＊5H2O、0.5g/L MnsO4＊4H2O，0.5g/L H3BO3、0.5g/L NaMoO4＊2H2O。经修饰的Vogels生物素溶液含有0.1g/L d-生物素。在高压灭菌后，在倾注平板前进行下列添加：20mL/L的50％葡萄糖，10mL/L溶解了20mg/mL氯嘧磺隆的DMF。允许孢子悬液在经修饰Vogels平板表面上干燥。
根据生产商的说明，利用来自Bio-Rad(Hercules，CA)的PDS-1000/he微粒递送系统，通过生物射弹转化方法完成木霉菌株的转化(参见，WO 05/001036和US 2006/0003408)。
分离转化体。
实施例5：筛选用于表达由1818A和1818B启动子驱动的葡糖淀粉酶活性的转化体
稳定的转化体在有淀粉的经修饰Vogels乳糖琼脂平板(9cm直径的培养皿)上生长。在28℃生长约4天后，在生长的克隆上倾倒10ml的4-甲基-伞形酮-α-D-葡萄糖的1mg/ml溶液。室温30分钟后，当通过长波长UV灯照射观察时，表达葡糖淀粉酶的菌株可见为荧光蓝菌落。未转化的、亲代里氏木霉对照菌株未显示蓝色荧光。
含有淀粉的经修饰Vogels乳糖琼脂平板与经修饰Vogels琼脂配方相同，除了用25ml/L的20％α-乳糖溶液(在高压灭菌后添加)替换葡萄糖溶液，和在高压灭菌前添加20g/L的Pure Food Powder玉米淀粉。
葡糖淀粉酶底物4-甲基-伞形酮-α-D-葡萄糖按如下制备：200mg的4-甲基-伞形酮-α-D-葡萄糖(西格玛阿尔德里克公司(Sigma-Aldrich Co.))溶解在5ml的DMSO中，并添加195ml，pH6.3的75mM磷酸钾缓冲液。
实施例6：里氏木霉转化体的摇瓶实验
单个真菌转化体在摇瓶培养中生长，以确定葡糖淀粉酶蛋白质表达的水平。基本上按照美国专利5,874,276的实施例1中描述的进行实验，伴随以下修改：用16g/L的α-乳糖替代TSF培养基中的纤维素。
一般而言，遵守Foreman等人(Foreman等人，(2003)J.Biol.Chem278：31988-31997)中描述的发酵规程。用1.5ml冷冻的孢子悬液接种含有5％葡萄糖的Vogels基本培养基(Davis等人，(1970)Methods inEnzymology 17A，第79-143页和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORGANISM，Oxford University Press，(2000))。在约48小时后，将每个培养物转移到位于14L Biolafitte发酵罐的6.2L相同培养基中。发酵罐在25℃、750RPM和每分钟气流8标准升的条件下运行。在初始的葡萄糖耗尽约1小时后，开始25％(w/w)乳糖送料，并以限碳的方式送料以防止乳糖聚集。监控葡萄糖和乳糖的浓度。定期获取样品来监控发酵的进程。在国际设备公司(InternationalEquipment Company)(Needham Heights，MA)的临床离心机中以3/4速旋转50ml离心管中的收集的样品。在还原条件下，用MOPS(吗啉丙烷磺酸(morpholinepropanesulfonic acid))SDS运行缓冲液和LDS样品缓冲液，在BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶(英杰生命科学公司(Invitrogen))上运行摇瓶生长的上清液样品。

Claims (23)

1.编码乙酰乳酸合酶蛋白质的分离的多核苷酸，所述蛋白质提供对毒性磺酰脲化合物的抗性，其中所述乙酰乳酸蛋白质的氨基酸序列具有下面的一种或多种：a)包含在位置190的酸性氨基酸，b)包含在位置241的酸性氨基酸，或c)包含在位置372的His，其中所述蛋白质中位置190、241和372被定义为该蛋白质中对应于SEQ ID NO：1的位置190、241和372的位置，其中所编码的蛋白质具有乙酰乳酸合酶活性。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述磺酰脲化合物为氯嘧磺隆。
3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述乙酰乳酸蛋白质的氨基酸序列具有A190D、K241E或R372H取代。
4.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸与启动子和终止子有效地相连。
5.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含内含子。
6.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含单个可读框。
7.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸是密码子优化的，以在特定的宿主细胞内表达所述乙酰乳酸合酶蛋白质。
8.包含权利要求1的分离的多核苷酸的载体。
9.权利要求8的载体，其中所述载体还包含用于重组蛋白表达的表达盒。
10.包含权利要求1的分离的多核苷酸的宿主细胞，其中所述宿主细胞对毒性的磺酰脲化合物有抗性。
11.权利要求10的宿主细胞，其中所述磺酰脲化合物为氯嘧磺隆。
12.权利要求10的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌宿主细胞。
13.权利要求12的宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
14.权利要求13的宿主细胞，其中所述宿主细胞是里氏木霉(Trichodermareesei)宿主细胞。
15.权利要求10的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
16.权利要求10的宿主细胞，其中分离的多核苷酸存在于所述宿主细胞的基因组中。
17.权利要求10的宿主细胞，其中所述分离的多核苷酸存在于在所述宿主细胞内自主复制的载体中。
18.选择细胞的方法，其包括：
将权利要求1的分离的多核苷酸引入多个细胞内；
将所述多个细胞与毒性磺酰脲或咪唑啉酮化合物接触；以及
培养所述细胞供所述细胞的选择。
19.权利要求18的方法，其中所述细胞是真菌细胞。
20.权利要求19的方法，其中所述细胞是里氏木霉细胞。
21.权利要求18的方法，其中所述细胞是植物细胞。
22.权利要求18的方法，其还包括在液体培养基中培养所述细胞。
23.权利要求18的方法，其中所述磺酰脲化合物为氯嘧磺隆。
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