KR102489871B1 - 진균 숙주 주, ｄｎａ 구성물, 및 사용 방법 - Google Patents

진균 숙주 주, ｄｎａ 구성물, 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

관심 대상의 단백질, 효소, 변이체 및 기타 물질을 신뢰가능한 또는 덜 가변적인 방식으로 발현시키는 데 있어서 특히 안정하고 유용한 진균 숙주 주 및 이의 생성 및 사용을 위한 재조합 DNA 구성물이 제공된다.

Description

진균 숙주 주, ＤＮＡ 구성물, 및 사용 방법{FUNGAL HOST STRAINS, DNA CONSTRUCTS, AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 12월 1일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/085,834호의 우선권을 주장하는데, 상기 미국 가특허 출원은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
서열 목록
37 C.F.R. §1.52(e)에 따라 EFS를 통하여 제출된 서열 목록은 본원에 참고로 포함된다. EFS를 통하여 제출된 서열 목록 텍스트 파일은 2015년 10월 11일자로 생성되고 크기가 13.4 킬로바이트인 파일 "2015-580(40676-WO-PCT)_ST25.txt"를 포함한다.
본 발명은 진균 숙주 주(strain) 및 이의 생성 및 사용을 위한 재조합 DNA 구성물에 관한 것이다. 진균 숙주 주는 신뢰가능하거나 덜 가변적인 방식으로 관심 대상의 단백질을 발현하는 데 있어서 특히 안정하고 유용하다. 추가로 본 발명은 이렇게 구성된 그러한 진균 숙주 주의 용도, 관심 대상의 단백질, 및 그러한 개선된 진균 숙주 주의 발효에 의해 제조된 관심 대상의 그러한 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
관심 대상의 단백질을 위한 생산 숙주로서의 진균 주의 사용은 오랫동안 경제적으로 실행가능한 것으로 여겨졌으며 한동안 상업적 환경(commercial setting)에서 널리 사용되었다. 게다가 이러한 단백질은, 임의로 정제된 후, 다양한 산업적 응용, 학문적 응용 또는 기타 응용에서 사용될 수 있다. 그러나, 만약 있다면, 분자 기술을 이용하여 구성된 형질전환체의 단지 매우 적은 수가 실제로 관심 대상의 효소를 생성하는 경우가 흔하다. 그러한 적은 수의 성공적인 형질전환체의 이유는 단순히 형질전환의 낮은 효율 (이는 전반적으로 소수의 형질전환체를 생성함)일 수 있다. 또 다른 이유는 낮은 백분율의 형질전환체가 발현 생성물의 생성을 허용하기에 충분히 안정하다는 것일 수 있는데, 상기 발현 생성물은 단백질, 효소 또는 다른 분자일 수 있다.
이종 유전자 (예를 들어, 비-천연 유전자, 또는 천연 형태와는 다른 형태로 존재하는 천연 유전자)의 발현의 가변성이 그 유전자의 핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련되지 않은 인자들의 결과로서 나타날 수 있다. 예를 들어, 비상동 말단 연결(non-homologous end join; NHEJ) 기작이 대부분의 진균류를 비롯한 다세포성 진핵 생물에서 지배적이다. 따라서, 발현 벡터는 랜덤(random) 위치에서 게놈 내로 통합되어서, 아마도 다양한 형질전환체 사이에서의 발현 수준에 대하여 위치 효과를 생성하게 된다. 게다가, 불안정한 형질전환체가 심지어 관심 대상의 유전자의 발현이 확인된 후에도 생성될 수 있으며, 이는 안정한 형질전환체를 수득하기 위하여 형질전환체의 추가의 스크리닝을 필요로 할 수 있다. 또한 가변성은 다핵 원형질체의 형질전환의 결과로서 이핵공존체(heterokaryon)의 생성에 의해 나타날 수 있으며, 그 이유는 사상균의 다핵 성질이 이러한 유기체에서 표적화 유전자 통합을 방해하기 때문이다. 따라서, 가변성이 감소된 관심 대상의 단백질을 발현시키기 위한 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 생성하는 신뢰가능한 수단이 명백한 이점을 제공한다.
그러한 명백한 이점의 비제한적 예로는 진균류에 의해 발현되는 DNA 라이브러리에서의 관심 대상의 유전자 또는 변이체의 기능성 스크린이 있다. 발현 효능 및/또는 수준의 가변성은 주어진 변이체의 특성과 또 다른 것의 특성의 비교를 어렵게 만든다. 따라서, 관심 대상의 유전자 또는 변이체가 특정 숙주 세포에 의해 신뢰가능하게 발현될 수 있는 경우, 그리고 더 적은 가변 수준이어서 그의 특성이 더 쉽게 평가되고 비교될 수 있는 경우 특정한 이점이 명백하게 존재한다.
[발명의 내용]
본 발명은 진균 숙주 주 및 이의 생성 및 사용을 위한 재조합 DNA 구성물에 관한 것이다. 진균 숙주 주는 본 기술 분야에 공지된 다른 발현 방법과 비교하여 발현 수준에 있어서 더 높은 신뢰도 및/또는 더 낮은 가변성을 가지고서 이러한 숙주에서 관심 대상의 유전자 또는 변이체의 발현을 제공하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 진균 숙주 주는 관심 대상의 유전자를 신뢰가능하거나 덜 가변적인 방식으로 발현하도록 유전자 통합을 효율적으로 표적화하는 데 유용하다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주의 구성 방법을 제공하며, 이는 a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 제한 효소는 형질전환된 염색체 DNA를 선형화하고/하거나 염색체 DNA에서 양립가능한 돌출 말단(cohesive end)을 생성할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 선형화된 DNA는 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 적합하게는, 관심 대상의 유전자는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 또는 특정한 기타 유용한 효소 중 하나를 코딩한다. 일부 경우에, 선형화 DNA는 관심 대상의 하나 초과의 유전자를 포함할 수 있으며, 따라서 형질전환된 진균 주는 관심 대상의 하나 초과의 효소 또는 단백질을 코딩하는 유전자 생성물들의 혼합물을 발현한다. 소정의 특정한 실시 양태에서, 적합한 형질전환 진균 주는 단백질 혼합물을 발현한다. 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 또는 그러한 유전자 생성물 중 임의의 것의 단편을 코딩할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 선형화 DNA는 적어도 하나의 선발 마커를 추가로 포함한다. 선발 마커는 적합하게는 als1, amdS, hygR, pyr2, pyr4, pyrG, sucA, 블레오마이신 내성 마커, 블라스티시딘 내성 마커, 피리티아민 내성 마커, 클로리뮤론 에틸 내성 마커, 네오마이신 내성 마커, 아데닌 경로 유전자, 트립토판 경로 유전자, 티미딘 키나아제 마커, 또는 당업자에게 공지된 또는 본 발명의 형질전환 진균 주를 만드는 데 사용될 수 있는 것으로 당업자에게 공지되게 될 임의의 기타 마커이다.
일부 실시 양태에서, 진균 주는 자낭균류(Ascomycete) 진균 주일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 자낭균류 진균 주는 적합하게는 사상균 주일 수 있다. 예를 들어, 사상균 주는 트리코데르마(Trichoderma), 페니실륨(Penicillium), 아스페르길루스(Aspergillus), 후미콜라(Humicola), 크리소스포륨(Chrysosporium), 푸사륨(Fusarium), 뉴로스포라(Neurospora), 또는 에메리셀라(Emericella)이다. 특정 실시 양태에서, 사상균 주는 적합하게는 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)(티. 레에세이)이다. 대안적인 실시 양태에서, 사상균 주는 적합하게는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)이다.
제2 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법을 이용하여 수득된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 제공한다: a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계.
일부 실시 양태에서, 이 측면의 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주는 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 예를 들어, 관심 대상의 유전자는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 또는 기타 유용한 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 일부 예에서, 이 측면의 형질전환된 진균 주는 관심 대상의 하나 초과의 유전자를 포함하며, 따라서, 형질전환된 진균 주는 관심 대상의 유전자 생성물인 물질들의 혼합물을 생성할 수 있다. 그런 의미에서, 이 측면의 형질전환된 진균 주는 관심 대상의 유전자 생성물을 포함하는 혼합물 또는 조성물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 또는 그러한 물질들 중 어느 하나의 단편을 코딩하는 것일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 이 측면의 형질전환된 진균 주는 자낭균류 진균 주일 수 있다. 소정의 특별한 실시 양태에서, 자낭균류 진균 주는 적합하게는 사상균 주일 수 있다. 예를 들어, 사상균 주는 트리코데르마 속, 페니실륨 속, 아스페르길루스 속, 후미콜라 속, 크리소스포륨 속, 푸사륨 속, 뉴로스포라 속, 또는 에메리셀라 속으로부터의 것일 수 있다. 소정의 특별한 실시 양태에서, 형질전환된 사상균 주는 트리코데르마 레에세이일 수 있다. 또 다른 특별한 실시 양태에서, 형질전환된 사상균 주는 적합하게는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)일 수 있다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 사용하여 진균 주의 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 진균 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공하며, 여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 진균 형질전환체 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법의 제한 효소는 형질전환된 염색체 DNA를 선형화하고/하거나 염색체 DNA에서 양립가능한 돌출부(cohesive)를 생성할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 진균 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법에서 사용되는 선형화 DNA는 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 관심 대상의 유전자는 적합하게는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제 등을 코딩하는 것이다. 특정한 실시 양태에서, 본 방법에서 사용되는 선형화 DNA는 관심 대상의 하나 초과의 유전자를 포함하며, 따라서, 본 방법은 관심 대상의 하나 초과의 유전자에 의해 코딩되는 생성물인 그러한 효소들의 혼합물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 그런 의미에서, 본 방법은 안정성이 개선된 진균 형질전환체에 의해 생성된 효소를 포함하는 조성물, 또는 그러한 진균 형질전환체에 의해 생성된 효소 또는 단백질 혼합물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 추가 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 또는 그러한 물질의 단편을 코딩하는 것일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 이 측면의 방법의 선형화 DNA는 적어도 하나의 선발 마커를 추가로 포함한다. 예를 들어, 선발 마커는 적합하게는 als1, amdS, hygR, pyr2, pyr4, pyrG, sucA, 블레오마이신 내성 마커, 블라스티시딘 내성 마커, 피리티아민 내성 마커, 클로리뮤론 에틸 내성 마커, 네오마이신 내성 마커, 아데닌 경로 유전자, 트립토판 경로 유전자, 및 티미딘 키나아제 마커일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 이 측면의 진균 주는 자낭균류 진균 주이다. 예를 들어, 적합한 자낭균류 진균 주는 사상균 주일 수 있다. 사상균 주는 트리코데르마, 페니실륨, 아스페르길루스, 후미콜라, 크리소스포륨, 푸사륨, 뉴로스포라, 또는 에메리셀라 주 중 하나일 수 있다. 일부의 특별한 실시 양태에서, 사상균 주는 트리코데르마 레에세이 주이다. 소정의 다른 실시 양태에서, 사상균 주는 아스페르길루스 니게르 주이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 형질전환된 진균 주를 적합한 배지에서 발효시키는 방법을 제공하며, 상기 주는 하기 단계에 의해 수득된다: a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계. 특정한 실시 양태에서, 진균 주는 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 발효된다.
일부 실시 양태에서, 이 측면의 방법을 이용하여 발효되는 진균 주에 의해 발현되는 관심 대상의 유전자는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 또는 본원에 열거된 효소들 중 하나 이상의 혼합물을 코딩한다. 일부 다른 실시 양태에서, 진균 주에 의해 발현되는 관심 대상의 유전자는 또한, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 및 그러한 분자의 하나 이상의 단편, 또는 그러한 분자의 혼합물을 코딩하는 것일 수 있다.
특정한 관련 측면에서, 본 발명은 또한 형질전환 진균 주에 의해 발현되는 관심 대상의 유전자 생성물을 포함하는 이 측면의 발효 종료시의 브로스(end-of-fermentation broth)인 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계에 의해 수득되는 형질전환된 진균 주를 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 적합한 배지에서 성장 및 발효시키는 단계를 포함하는, 관심 대상의 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다: a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계.
일부 실시 양태에서, 이 측면의 방법은 상기 관심 대상의 유전자의 발현 수준을 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 관심 대상의 유전자는 적합하게는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 및 이러한 효소들 중 하나 이상의 혼합물을 코딩할 수 있다. 대안적으로, 관심 대상의 유전자는 적합하게는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 및 이러한 물질의 단편 또는 이러한 물질들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 따름으로써 수득되는 형질전환된 진균 세포에서 관심 대상의 유전자를 발현시키는 방법에 의해 생성된, 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되는 관심 대상의 단백질을 제공한다: a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계.
추가의 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 따름으로써 수득되는 형질전환된 진균 세포에 의해 발현되는 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되는 관심 대상의 단백질을 포함하는 단백질성 조성물을 제공한다: a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계.
또한 추가의 측면에서, 본 발명은 바이오매스(biomass) 가수분해, 클리닝(cleaning) 응용, 곡물 가공, 동물 영양, 식품 조성물, 직물 처리 등에서의 본원의 다양한 측면의 방법들 중 임의의 것, 및/또는 본 발명의 형질전환된 진균 주의 사용에 의해 생성된 단백질성 조성물의 사용 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 염색체 DNA 내에 적어도 하나의 제한 효소 부위를 포함하는 진균 숙주 세포; 및 b) 관심 대상의 유전자, 선발 마커 및 상기 염색체 제한 효소 부위의 측면에 있는 서열에 대하여 상당한 상동성을 갖는 서열을 발현시키기 위한 작동가능한 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 진균 발현 시스템을 제공하며; 여기서, 상기 상당한 상동성을 갖는 서열은 관심 대상의 유전자를 발현시키는 상동 재조합 사건(homologous recombination event)을 야기한다.
특정한 실시 양태에서, 진균 발현 시스템은 진균 숙주 세포의 염색체 DNA에서 적합한 제한 효소 부위를 생성할 수 있는 제한 효소를 발현하는 발현 카세트를 추가로 포함한다.
관심 대상의 유전자는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 및 이러한 효소들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩하는 것일 수 있다. 대안적으로, 관심 대상의 유전자는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 및 이러한 분자의 단편 또는 이러한 분자들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 선발 마커는 적합하게는 als1, amdS, hygR, pyr2, pyr4, pyrG, sucA, 블레오마이신 내성 마커, 블라스티시딘 내성 마커, 피리티아민 내성 마커, 클로리뮤론 에틸 내성 마커, 네오마이신 내성 마커, 아데닌 경로 유전자, 트립토판 경로 유전자, 또는 티미딘 키나아제 마커일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 진균 숙주 주는 자낭균류 진균 숙주 주일 수 있다. 예를 들어, 자낭균류 진균 주는 적합하게는 사상균 주이다. 일부 실시 양태에서, 진균 숙주 주는 트리코데르마, 페니실륨, 아스페르길루스, 후미콜라, 크리소스포륨, 푸사륨, 뉴로스포라 또는 에메리셀라 숙주 주이다. 특별한 실시예에서, 사상균 숙주 주는 트리코데르마 레에세이 숙주 주이다. 또 다른 특별한 실시예에서, 사상균 숙주 주는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 숙주 주이다.
관련 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 진균 발현 시스템의 이용 방법을 제공하며, 상기 진균 발현 시스템은 a) 염색체 DNA 내에 적어도 하나의 제한 효소 부위를 포함하는 진균 숙주 세포; 및 b) 관심 대상의 유전자, 선발 마커 및 상기 염색체 제한 효소 부위의 측면에 있는 서열에 대하여 상당한 상동성을 갖는 서열을 발현시키기 위한 작동가능한 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 상당한 상동성을 갖는 서열은 관심 대상의 유전자를 발현시키는 상동 재조합 사건을 야기한다. 염색체 제한 효소 부위를 생성할 수 있는 제한 효소의 존재 하에 진균 숙주 세포를 b)의 핵산 분자로 형질전환시킨다.
일부 실시 양태에서, 제한 효소는 진균 숙주 세포에 또한 두어진 발현 카세트에 의해 생성된다.
추가의 관련 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 진균 발현 시스템의 이용 방법에 의해 수득된 형질전환된 또는 유도된 진균 주를 제공한다. 게다가, 본 발명은 또한 하기 단계를 따름으로써 수득되는 형질전환된 또는 유도된 진균 주를 발효시키는 방법을 제공한다: a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계.
또한 추가의 측면에서, 본 발명은 관심 대상의 유전자를 발현시키는 방법을 제공하며, 이는 형질전환된 또는 유도된 진균 주를 상기 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 적합한 배지에서 성장 및 발효시키는 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되는 관심 대상의 단백질을 제공한다. 게다가, 본 발명은 관심 대상의 단백질을 포함하는 단백질성 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 바이오매스 가수분해, 클리닝 응용, 곡물 가공, 동물 영양, 식품 조성물, 직물 처리 등에서의 그러한 단백질성 조성물의 사용 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표적화 유전자 통합 방법을 제공하며, 이는 하기 단계를 포함한다:
a) 염색체 DNA 내에 적어도 하나의 제한 효소 부위를 포함하는 진균 숙주 세포를 수득하는 단계;
b) 관심 대상의 하나 이상의 유전자, 적어도 하나의 선발 마커 및 상기 염색체 제한 효소 부위의 측면에 있는 서열에 대하여 상당한 상동성을 갖는 서열을 발현시키기 위한 작동가능한 서열을 포함하는 핵산 분자를 수득하는 단계 (여기서, 상기 상동 서열은 서열은 상기 관심 대상의 유전자를 발현시키는 상동 재조합 사건을 야기함);
및 제한 효소 부위를 생성할 수 있는 제한 효소의 존재 하에 a)의 진균 숙주 세포를 b)의 핵산 분자로 형질전환시키는 단계.
일부 실시 양태에서, 진균 숙주 세포는 진균 숙주 세포에서 제한 효소를 생성하는 데 사용되는 발현 카세트를 추가로 포함한다.
관심 대상의 유전자는 적합하게는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 및 이러한 효소들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩한다. 대안적으로, 관심 대상의 유전자는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 이러한 분자의 단편 또는 이러한 분자들 중 1가지 이상의 혼합물을 코딩한다.
선발 마커는 적합하게는 als1, amdS, hygR, pyr2, pyr4, pyrG, sucA, 블레오마이신 내성 마커, 블라스티시딘 내성 마커, 피리티아민 내성 마커, 클로리뮤론 에틸 내성 마커, 네오마이신 내성 마커, 아데닌 경로 유전자, 트립토판 경로 유전자, 또는 티미딘 키나아제 마커일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 진균 숙주 주는 적합하게는 자낭균류 진균 주이다. 예를 들어, 자낭균류 진균 주는 사상균 주일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 사상균 주는 트리코데르마, 페니실륨, 아스페르길루스, 후미콜라, 크리소스포륨, 푸사륨, 뉴로스포라 또는 에메리셀라 진균 주이다. 소정의 특정 실시 양태에서, 사상균 주는 적합하게는 트리코데르마 레에세이 주이다. 소정의 다른 특정 실시 양태에서, 사상균 주는 아스페르길루스 니게르 주이다.
일 측면에서, 본 발명은 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주의 구성 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 선형화 ("선형"으로도 칭해짐) 또는 원형 DNA와 제한 효소 (제한 효소의 "처리를 이용한"으로도 칭해짐)의 혼합물을 이용하여 트리코데르마 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있음); 및 b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계 (여기서, 제한 효소의 처리를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높음)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주의 구성 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 트리코데르마 세포를 선형화 또는 원형 DNA로 형질전환시키는 단계 (여기서, 트리코데르마 세포는 제한 효소를 생성하도록 유도되며, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있음); 및 b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계 (여기서, 제한 효소의 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 유도 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높음)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 트리코데르마 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공하며, 이는 선형화 또는 원형 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 트리코데르마 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고, 여기서, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있으며, 제한 효소의 처리를 이용한 생성된 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 트리코데르마 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공하며, 이는 선형화 또는 원형 DNA로 트리코데르마 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고, 여기서, 트리코데르마 세포는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있는 제한 효소를 생성하도록 유도되며, 제한 효소의 유도를 이용한 생성된 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 유도 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높다.
단락 [0047]에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 방법은 형질전환 단계 전에 또는 형질전환 단계 동안 유도시에 제한 효소를 생성할 수 있는 구성물을 트리코데르마 세포 내에 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
단락 [0046] 내지 [0048] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 방법은 유전적으로 안정한 트리코데르마 형질전환체를 선발하는 단계를 추가로 포함한다.
단락 [0044] 내지 [0049] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 방법은 제한 효소의 처리를 하지 않거나 제한 효소의 유도를 하지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 선형화 또는 원형 DNA를 이용하여 동일한 트리코데르마 세포의 형질전환 전 주를 형질전환시키는 단계를 추가로 포함한다.
단락 [0044] 내지 [0050] 중 어느 하나에 기술된 방법의 소정 실시 양태에서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율 및 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용하지 않은 안정한 형질전환체의 백분율은 동일한 조건 하에 동일한 형질전환 방법을 이용하여, 그리고 소정 실시 양태에서, 대략 동일한 수의 세포 및 동일한 양의 선형화 또는 원형 DNA를 이용하여 수득된다.
단락 [0044] 내지 [0051] 중 어느 하나에 기술된 방법의 소정 실시 양태에서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용하지 않은 안정한 형질전환체의 백분율보다 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 높다. 특정한 실시 양태에서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용하지 않은 안정한 형질전환체의 백분율보다 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 6배 더 높다.
단락 [0044] 내지 [0052] 중 어느 하나에 기술된 방법의 특별한 실시 양태에서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 특정한 실시 양태에서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 모든 테스트한 형질전환체 중에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다.
단락 [0044] 내지 [0053] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 형질전환의 효율은 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용하지 않은 형질전환의 효율보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 높다. 특정한 실시 양태에서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 형질전환의 효율은 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용하지 않은 형질전환의 효율보다 적어도 1배, 2배, 3배 또는 4배 더 높다.
단락 [008] 내지 [0013], [0022], [0023], [0025], [0026], [0035], [0036], [0038] 내지 [0040], 및 [0044] 내지 [0054] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 제한 효소는 적어도 6개의 염기쌍의 제한효소 부위를 인식한다. 일부 실시 양태에서, 제한 효소는 적어도 8개의 염기쌍의 제한효소 부위를 인식한다. 특별한 실시 양태에서, 제한 효소는 적어도 10개의 염기쌍의 제한효소 부위를 인식한다. 특별한 실시 양태에서, 제한 효소는 적어도 12개의 염기쌍의 제한효소 부위를 인식한다. 특정한 실시 양태에서, 적어도 2가지의 상이한 제한 효소가 본 방법에 사용된다.
단락 [008] 내지 [0013], [0022], [0023], [0025], [0026], [0035], [0036], [0038] 내지 [0040], 및 [0044] 내지 [0055] 중 어느 하나에 기술된 방법의 소정 실시 양태에서, 제한 효소는 메가뉴클레아제이다. 소정 실시 양태에서, 제한 효소는 LAGLIDADG 호밍(homing) 메가뉴클레아제이다. 특별한 실시 양태에서, 제한 효소는 I-SceI, I-CreI, I-MsoI, I-AniI, I-DmiI, 및 PI-PfuI로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단락 [008] 내지 [0013], [0022], [0023], [0025], [0026], [0035], [0036], [0038] 내지 [0040], 및 [0044] 내지 [0055] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 다른 실시 양태에서, 제한 효소는 징크-핑거 뉴클레아제(Zinc-finger nuclease; ZFN), 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription activator-like effector nuclease; TALEN), 또는 RNA-가이드 엔도튜클레아제(RNA-guided endonuclease)이다.
단락 [008] 내지 [0013], [0022], [0023], [0025], [0026], [0035], [0036], [0038] 내지 [0040], 및 [0044] 내지 [0057] 중 어느 하나에 기술된 방법의 소정 실시 양태에서, 제한 효소는 형질전환된 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 양립가능한 돌출 말단을 생성할 수 있다.
단락 [0044] 내지 [0058] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 트리코데르마 세포는 선형화 DNA로 형질전환된다. 일부 다른 실시 양태에서, 트리코데르마 세포는 원형 DNA로 형질전환된다.
단락 [0044] 내지 [0059] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 선형화 또는 원형 DNA는 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 소정 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 효소를 코딩한다. 특별한 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 이들의 변이체, 이들의 기능성 단편, 또는 이들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩한다. 또 다른 특별한 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 이들의 변이체, 이들의 기능성 단편, 또는 이들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩한다.
단락 [0044] 내지 [0060] 중 어느 하나에 기술된 방법의 소정 실시 양태에서, 선형화 또는 원형 DNA는 선발 마커를 포함한다. 특별한 실시 양태에서, 선발 마커는 als1, amdS, hygR, pyr2, pyr4, sucA, 블레오마이신 내성 마커, 블라스티시딘 내성 마커, 피리티아민 내성 마커, 클로리뮤론 에틸 내성 마커, 네오마이신 내성 마커, 아데닌 경로 유전자, 트립토판 경로 유전자, 또는 티미딘 키나아제 마커이다.
단락 [0044] 내지 [0061] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 방법은 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 또는 RNA 서열을 사용하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 방법은 길이가 적어도 약 20개, 30개, 40개, 50개, 100개, 150개 또는 200개 뉴클레오티드인 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 또는 RNA 서열을 사용하는 단계를 포함하지 않는다. 소정 실시 양태에서, 방법은 길이가 적어도 150개 또는 200개 뉴클레오티드인 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 서열을 사용하는 단계를 포함하지 않는다. 소정 실시 양태에서, 방법은 길이가 적어도 약 20개, 30개, 40개 또는 50개 뉴클레오티드인 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 RNA 서열을 사용하는 단계를 포함하지 않는다.
단락 [0044] 내지 [0061] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 방법은 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 또는 RNA 서열을 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 방법은 길이가 적어도 약 150개, 200개, 300개, 또는 400개 뉴클레오티드인 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 서열을 사용하는 단계를 포함한다. 특별한 실시 양태에서, 방법은 길이가 적어도 약 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개 뉴클레오티드인 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 서열을 사용하는 단계를 포함한다. 소정 실시 양태에서, 방법은 길이가 적어도 약 20개, 30개, 40개 또는 50개 뉴클레오티드인 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 RNA 서열을 사용하는 단계를 포함한다. 소정 실시 양태에서, 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 또는 RNA 서열은 상기 적어도 20개, 30개, 40개, 40개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 또는 1000개 뉴클레오티드의 상동성 영역의 전체 길이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다 (또는 RNA의 경우 동등하다).
단락 [0044] 내지 [0061] 및 [0063] 중 어느 하나에 기술된 방법의 일부 실시 양태에서, 방법은 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 서열을 사용하는 단계를 포함하며, 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 서열은 제한 효소에 의해 절단된 부위에서의 상동 재조합에 의해 트리코데르마 염색체 DNA와 재조합된다.
단락 [0044] 내지 [0064] 중 어느 하나에 기술된 방법의 소정 실시 양태에서, 트리코데르마 주는 티. 레에세이, 티. 비렌스(T. virens), 티. 아스페렐룸(T. asperellum), 티. 하르지아눔(T. harzianum), 티. 코닝기이(T. koningii), 티. 롱기브라키아툼(T. longibrachiatum), 티. 비리데(T. viride), 또는 티. 아트로비리데(T. atroviride) 주이다. 특별한 실시 양태에서, 트리코데르마 주는 티. 레에세이 주이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단락 [0044] 내지 [0065] 중 어느 하나의 방법을 사용하여 수득되는 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 제공한다.
단락 [0066]에 기술된 트리코데르마 주의 일부 실시 양태에서, 트리코데르마 주는 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 소정 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 효소를 코딩한다. 특별한 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 이들의 변이체, 이들의 기능성 단편, 또는 이들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩한다. 또 다른 특별한 실시 양태에서, 관심 대상의 유전자는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 이들의 변이체, 이들의 기능성 단편, 또는 이들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩한다.
단락 [0066] 내지 [0067] 중 어느 하나에 기술된 트리코데르마 주의 소정 실시 양태에서, 트리코데르마 주는 티. 레에세이, 티. 비렌스, 티. 아스페렐룸, 티. 하르지아눔, 티. 코닝기이, 티. 롱기브라키아툼, 티. 비리데, 또는 티. 아트로비리데 주이다. 특별한 실시 양태에서, 트리코데르마 주는 티. 레에세이 주이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 관심 대상의 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다: a) 단락 [0067] 내지 [0068] 중 어느 하나에 기술된 트리코데르마 주를 사용하는 단계 (여기서, 관심 대상의 유전자는 관심 대상의 단백질을 코딩함); 및 b) 관심 대상의 단백질을 트리코데르마 주로부터 생성하는 단계. 소정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 분비형 단백질이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단락 [0044] 내지 [0065] 및 [0069] 중 어느 하나에 기술된 방법을 적용함으로써 생성된 관심 대상의 단백질을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단락 [0070]에 기술된 관심 대상의 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리그노셀룰로오스 바이오매스 기질의 가수분해, 클리닝 응용, 곡물 및 전분 가공, 동물 영양, 식품 조성물 또는 직물 처리에 있어서의 단락 [0071]에 기술된 조성물의 용도를 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
도 1. AclAmy1 발현 플라스미드 pTrex3gM-AclAmy1의 벡터 NTI 지도. 실시예 1에 기술된 바와 같이, 이 벡터는 트리코데르마 레에세이 셀로바이오하이드롤라아제 1 (cbh1) 프로모터 및 전사 종결자(transcriptional terminator)에 의해 구동되는 게놈 AclAmy1 유전자로부터의 AclAmy1 발현을 지원하였다. 이것은 단일 질소원으로서 아세트아미드에서 형질전환체가 성장하게 하는 amdS 선발가능 마커를 지녔다.
도 2. pENTRY-AclAmy1의 벡터 NTI 지도. 이 벡터는 실시예 1에 기술된 바와 같이 엔지니어링되었다(engineered). 이것은 게이트웨이(Gateway)® LR 반응을 위한 '공여(donor)' 플라스미드로서의 역할을 한다.
도 3. AclAmy1 발현을 위한 AclAmy1 발현 플라스미드 pTrex8gM-AclAmy1의 벡터 NTI 지도. 이 벡터는 트리코데르마 레에세이 셀로바이오하이드롤라아제 1 (cbh1) 프로모터 및 전사 종결자에 의해 구동되는 게놈 AclAmy1 유전자로부터의 AclAmy1 발현을 지원한다. 이것은 보충 우리딘의 부재 하에 형질전환체가 성장하게 하는 pyr2 선발가능 마커를 지닌다.
도 4a 내지 4e. pTrex8gMAclAmy1 (도 4a), PacI의 존재 하에 pTrex8gM-AclAmy1 (도 4b), 컬럼 정제에 의해 PacI을 제거한 후라는 것을 제외하고는 도 4b와 동일한 것 (도 4c), 주형으로서 pTrex8gM-AclAmy1을 이용하여 PCR 증폭시킨 발현 구성물 (도 4d), 또는 도 4d에서와 동일한 것 (이때 PacI을 첨가함) (도 4e)을 이용한 트리코데르마의 형질전환.
도 5. 안정한 트리코데르마 형질전환체의 α-아밀라아제 활성
도 6. I-SceI 제한효소 부위를 갖는 pBJP6의 구성. 대략 1.5 kb의 5'UTR cbh2, PcbhI 및 Tcbh2를 개별적으로 PCR 증폭시키고, 융합 PCR에 의해 함께 융합시키고, pBluescript SK(+)의 XbaI 및 KpnI 부위 내에 클로닝하여 7.3 kb의 pBJP4 플라스미드를 생성하였다. 절두형 GFP 반복체의 합성 서열을 pBJP4의 단일 NdeI 제한효소 부위 내에 삽입시키고, 올바른 배향의 GFP 반복체를 갖는 플라스미드를 선발하고, pBJP5 (8.6 Kb)로 명명하였다. I-SceI 제한효소 부위를 갖는 최종 10 kb pBJP6 플라스미드는 2개의 I-SceI 제한효소 부위로 둘러싸인 PCR 증폭된 에이. 니둘란스 pyrG 마커를 pBJP5의 단일 PmeI 부위 내에 클로닝함으로써 수득된다.
도 7. 생체 내 I-SceI 활성 분석 셋업(set up)의 근거. 별표(*)는 절두형 GFP 서열을 나타내며, 반복 GFP 서열은 더 조밀한 해치형의(hatched) 박스로 예시되어 있다.
도 8. 티. 레에세이 P37Δ cbhIpyrG-26의 게놈에서의 I-SceI 제한효소 부위의 도입. (A) 티. 레에세이의 게놈에서의 I-SceI 제한효소 부위 카세트의 다이어그램(diagram). 하기 (B) 내지 (D)의 서던 블롯(Southern blot)을 수행하는 데 사용한 제한 효소를 수직 화살표로 나타낸다. 패널 A의 하부에 막대로 나타낸 3가지 상이한 프로브(P1, P2, P3)를 이용하여 전 구성물의 존재 및 카피수(copy number)를 확인한다. 예상되는 제한효소 절단 단편/서던 블롯 밴드의 크기를 다이어그램에 나타낸다. (B) 내지 (D) 9가지의 형질전환체 (레인 1 내지 9) 및 모 주 (레인 10)의 서던 블롯 분석. 레인 1 내지 10에서의 샘플의 주 명칭은 패널 D의 우측에 표시되어 있다. (B) 주의 게놈 DNA를 XbaI로 절단하고, 그 후 프로브 1을 이용하여 혼성화하였다. 5.4 Kb 밴드는 게놈에 존재할 때 I-SceI 제한효소 카세트를 나타낸다. 좌측의 수는 정확한 밴드의 크기를 나타낸다. (C) 게놈 DNA를 PstI로 절단하고, 프로브 2를 이용하여 혼성화하였다. 6.3 Kb는 통합된 I-SceI 제한효소 부위 카세트의 예상 밴드 크기이다. (D) 게놈 DNA를 XhoI로 절단하고, 프로브 3을 이용하여 혼성화하였다. 프로브 3을 이용할 경우 예상 밴드 크기는 2.3 Kb이다.
도 9. 생체 내 I-SceI 활성 테스트. I-SceI의 유도는 우리딘 영양요구성 표현형을 초래할 DSB를 생성할 것으로 예측된다. 주들을 탄소원으로서 글루코스 또는 락토스를 이용하여 30℃에서 4일 동안 최소 배지 +/- 우리딘 상에 점 접종하였다. 락토스 기반 배지 상에서 I-SceI의 발현은 DSB를 유도하며, 이는 pyrG 마커의 밖의 루프 및 후속적으로, 우리딘을 포함하지 않는 배지 상에서의 주의 성장의 무능력을 초래한다. 화살표는 성장이 없는 영역을 나타낸다.
도 10. GFP를 이용한 생체 내 I-SceI 활성 테스트 GFP. I-SceI 발현의 유도는 pyrG 마커의 절제 및 GFP의 복구 (녹색 형광 균사에 의해 표시됨)로 이어진다. 주들을 락토스 및 우리딘을 포함하는 trMM 상에서 성장시켜 각각 pyrG 마커를 유도하고 pyrG 마커가 상실되게 한다. 트리코데르마 세포를 세포 외관에 대하여 격차 간섭 대조 현미경법(Differential Interference Contrast microscopy; DIC)에 의해 또는 녹색 형광 단백질 발현 (GFP)에 대하여 형광 현미경법에 의해 관찰하였다.
도 11. I-SceI에 의해 매개되는 글루코아밀라아제 발현 카세트의 표적화 통합 접근법의 근거. I-SceI 랜딩(landing) 부위에서의 글루코아밀라아제 카세트의 표적화 통합은 alS 내성, 우리딘 영양요구성 및 글루코아밀라아제 생성을 초래할 것으로 예상된다.
도 12. 티. 레에세이에서의 I-SceI의 발현에 의한 형질전환 빈도의 증가. 락토스/글루코스 또는 글루코스 플레이트 상의 대조 주 (JP7.7) 및 I-SceI 발현 주 JP7.7.12 (JP7.7 + pTTT- I-SceI). 락토스를 통한 I-SceI의 유도는 형질전환 빈도를 증가시킨다.
도 13. I-SceI 랜딩 부위에서의 글루코아밀라아제 카세트의 표적화 통합에 대한 선발된 형질전환체의 서던 블롯 분석. (I) pJP8이 I-SceI 랜딩 부위에서의 (cbh2 유전자좌에서의) 통합일 때 또는 아닐 때 (pBJP6이 여전히 cbh2 유전자좌에 존재함) 예상 블롯 크기를 나타내는 서던 블롯의 다이어그램. 서던 블롯을 수행하는 데 사용한 제한 효소를 막대로 나타낸다. 두 가지 (2가지) 상이한 프로브 (PcbhI 및 Tcbh2)를 이용하여 각각 5' 측면 및 3' 측면에서의 통합을 확인하였다. 예상 밴드 크기를 다이어그램에 나타낸다. (II) 12개의 형질전환체의 서던 블롯 분석 (레인 1 내지 12). (II-A) 형질전환체의 게놈 DNA를 SpeI으로 절단하고, 그 후 프로브 PcbhI을 이용하여 혼성화하였다. 5.5 Kb 밴드는 5' 측면에서의 pJP8 카세트의 상동성 통합을 나타내며, 3.6 Kb는 I-SceI 제한효소 부위 카세트 (pBJP6)가 cbh2 유전자좌에 여전히 존재할 때의 예상 크기이다. 좌측의 수는 밴드의 크기를 나타낸다. (II-B) 게놈 DNA를 BamHI로 절단하고, 프로브 Tcbh2를 이용하여 혼성화하였다. 6.8 Kb는 3' 측면에서 통합된 pJP8의 예상 밴드 크기이며, 3 Kb는 통합되지 않았을 때의 것이다. 선발된 형질전환체의 pyrG 표현형 및 상대적 글루코아밀라아제 활성이 블롯 사진 옆의 표에 제시되어 있다.
도 14. 표적화 (pyrG-) 형질전환체와 비-표적화 형질전환체 사이의 글루코아밀라아제 활성의 비교. pyrG 표현형 ("pyrG-"는 표적화 통합을 나타내며 "pyrG+"는 비-표적화 통합을 나타냄)이 각각의 형질전환체에 대하여 예시되어 있다. 모 주의 글루코아밀라아제 배경 활성을 좌측에 한 낱말 "C"로 나타낸다. 오픈(open) 막대는 I-SceI 유도 조건으로부터의 글루코아밀라아제 발현 형질전환체를 나타낸다. 해치형 막대는 I-SceI 비-유도 조건으로부터의 글루코아밀라아제 발현 형질전환체를 나타내며, 도트형(dotted) 막대는 대조 형질전환체를 나타낸다. 2개의 수평 막대 (y축에서 "1.35" 및 "0.9" 옆)는 표적화 통합 형질전환체의 상대적 글루코아밀라아제 활성의 한계를 정하는 것이었다.
도 15. I-SceI 랜딩 부위에서의 글루코아밀라아제 카세트의 표적화된 그리고 비-통합된 형질전환체의 서던 블롯 분석. 서던 블롯의 셋업은 도 13에 설명된 것과 동일하다. (A) 형질전환체의 게놈 DNA를 SpeI로 절단하고, 그 후 프로브 PcbhI을 이용하여 혼성화하였다. pJP8이 I-SceI 랜딩 부위의 5' 측면에서 통합될 때의 블롯 상에서의 예상되는 올바른 크기는 5.5 Kb이다. (B) 게놈 DNA를 BamHI로 절단하고, 프로브 Tcbh2를 이용하여 혼성화하였다. 6.8 Kb는 I-SceI 랜딩 부위의 3' 측면에서의 pJP8의 올바른 통합의 예상 밴드 크기이다. 형질전환체 1 내지 10은 I-SceI 랜딩 부위에서 표적화 통합되며 (청색 막대 제한), 글루코아밀라아제 발현에 있어서 더 적은 가변성을 나타낸다. 형질전환체 11 내지 16은 랜덤 통합 형질전환체이며 (적색 막대 제한), 글루코아밀라아제 발현에 있어서 높은 가변성을 갖고, 이때 I-SceI 랜딩 부위에서 pJP8 카세트가 부분적으로 통합되거나 (형질전환체 11 및 14) 상기 카세트가 비통합되거나 (형질전환체 12, 13 및 15) 상기 카세트가 다중 카피로 랜덤 통합된다 (형질전환체 16). P37Δ cbhIpyrG-26 주는 블롯의 마지막 라인에서 대조구로서 사용되며, 예상되는 바와 같이, PcbhI을 사용할 때 이 주의 혼성화가 없다 (블롯 A). 프로브로서 Tcbh2를 사용하는 대조구에서의 예상 블롯 크기는 6.9 Kb (블롯 B)이다.
도 16. 발현 플라스미드 pTTT-I-SceI의 플라스미드 지도. 이것은 cbhI 프로모터에 의해 구동되고 cbhI 종결자로 끝나는 합성 코돈 최적화 유전자로부터의 I-SceI의 발현을 지원한다. 이것은 유일한 질소원으로서의 아세트아미드 상에서의 진균 형질전환체의 성장을 지원하도록 amdS 선발 마커를 포함한다. 이 플라스미드는 벡터 상의 텔로미어(telomere) 서열 반복체로 인하여 진균 세포에서 자율적으로 유지된다.
도 17a 및 도 17b. 다수의 제한 효소를 이용한 처리에 의해 안정한 티. 레에세이 형질전환체의 백분율 증가를 나타내는 형질전환 플레이트의 사진. 티. 레에세이 주를 임의의 제한 효소를 이용한 처리 없이 용해성(lytic) 셀룰로오스 모노옥시게나아제 (EG4)-코딩 서열을 포함하는 PCR 단편으로 형질전환시키거나 ("PCR"로 표지된 좌측 패널), 20 단위의 AsiSI로 처리하거나 ("PCR + AsiSI"로 표지된 도 17a의 중간 패널 및 "AsiSI"로 표지된 도 17b의 중간 패널), 7 단위의 각각의 AsiSI, PacI 및 SwaI ("PCR + AsiSI + PacI + SwaI"로 표지된 도 17a의 우측 패널) 또는 AsiSI, PacI 및 PmeI ("3가지 효소"로 표지된 도 17b의 우측 패널)로 처리하였다.
I. 개관
본 발명은 진균 숙주 주 및 이의 생성 및 사용을 위한 재조합 DNA 구성물에 관한 것이다. 진균 숙주 주는 신뢰가능하거나 덜 가변적인 방식으로 관심 대상의 단백질을 발현하는 데 있어서 특히 안정하고 유용하다. 추가로 본 발명은 이렇게 구성된 그러한 진균 숙주 주의 용도, 관심 대상의 단백질, 및 그러한 개선된 진균 숙주 주의 발효에 의해 제조된 관심 대상의 그러한 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원에 개시된 방법은 관심 대상의 단백질 또는 관심 대상의 변이체를 향상된 신뢰도로 발현시킨다. 이와 같이, "향상된 신뢰도"라는 용어는 (1) 형질전환체의 적어도 60% (예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%)가 안정한 형질전환체이거나; (2) 형질전환체의 적어도 60% (예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%)가 배경 발현 수준에 비하여 의도된 대로의 관심 대상의 단백질 또는 변이체를 발현하거나; (3) 관심 대상의 단백질 또는 변이체가 60% 미만 (예를 들어, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만)으로 변하는 발현 수준으로 발현됨을 의미한다. 상기 (3)에서 또는 본원의 다른 곳에서 언급되는 바와 같이, "발현 수준 변동"이라는 용어는 최고 발현 수준과 최저 발현 수준 사이의 차이를 최고 발현 수준과 배경 발현 수준 사이의 차이인 값으로 나눔으로써 정의되거나 결정되며, 여기서, 모든 결정은 관심 대상의 동일 유전자 또는 변이체 및 동일 구성물을 이용하여 이루어진다.
II. 정의
본 발명의 주, 조성물 및 방법을 기술하기 전에, 하기 용어 및 어구가 정의된다. 정의되지 않은 용어는 본 기술 분야에서 사용되는 그의 일상적인 의미에 부합되어야 한다.
값들의 범위가 제공될 경우, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의, 그 문맥이 명백하게 달리 진술하지 않으면 하한치의 단위의 십분의 일까지의 각각의 개재 값(intervening value) 및 그 진술된 범위 내의 임의의 다른 진술된 값 또는 개재 값은 본 발명의 조성물 및 방법 내에 포함됨이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 그 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있으며, 본 발명의 조성물 및 방법 내에 또한 포함되고, 이는 진술된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계치를 조건으로 한다. 진술된 범위가 한계치들 중 하나 또는 이들 둘 모두를 포함할 경우, 상기 포함된 한계치들 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두를 배제하는 범위가 본 발명의 조성물 및 방법 내에 또한 포함된다.
특정한 범위가 본원에서 제시되며, 이때 수치 값에는 "약"이라는 용어가 선행된다. 본원에서 "약"이라는 용어는 이것이 선행되는 정확한 수와, 이 용어가 선행되는 수의 반올림 또는 근사치인 수를 문자 그대로 뒷받침하기 위하여 사용된다. 소정의 수가 구체적으로 인용된 수를 반올림한 것인지 구체적으로 인용된 수의 근사치인지를 결정하는 데 있어서, 반올림한 것이거나 근사치인 인용되지 않은 수는, 이것이 제시된 문맥에서 그 구체적으로 인용된 수와 실질적으로 등가인 수일 수 있다. 예를 들어, 수치 값과 관련하여, "약"이라는 용어는 이 용어가 문맥에서 달리 구체적으로 정의되지 않으면, 그 수치 값의 -10% 내지 +10%의 범위를 나타낸다. 또 다른 실시예에서, "약 6의 pH 값"이라는 어구는, 그 pH 값이 구체적으로 달리 정의되지 않으면 5.4 내지 6.6의 pH 값을 나타낸다.
본원에 제공된 제목은 본 명세서를 전체적으로 참고함에 의한 것일 수 있는 본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 측면 또는 실시 양태를 제한하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 본 명세서를 전체적으로 참고함에 의해 더욱 완전히 정의된다.
본 문서는 읽는 것을 용이하게 하기 위하여 다수의 섹션(section)으로 정리되지만, 독자는 한 섹션에서 이루어진 진술이 다른 섹션에 적용될 수 있음을 알 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 상이한 섹션에 사용된 제목은 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 테스트에서 또한 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적인 방법 및 재료를 이제 설명한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되는 것처럼 본원에 참고로 포함되며, 방법 및/또는 재료 (이와 관련하여 간행물이 인용됨)를 개시하고 설명하기 위하여 본원에 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 본 출원일 이전의 그의 개시 내용에 대한 것이며, 본 발명의 조성물 및 방법이 종래 발명에 의해 그러한 간행물에 선행한다는 권리가 주어지는 것은 아님을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공된 공개일은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과는 상이할 수 있다.
이러한 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]에 따라, 하기 약어 및 정의가 적용된다. 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 그 문맥이 명백하게 달리 기술하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함함이 주지된다. 따라서, 예를 들어, "효소"의 언급은 복수의 그러한 효소를 포함하며, "투여량"의 언급은 하나 이상의 투여량 및 당업자에게 공지된 이의 당량의 언급을 포함하며, 기타 등등이다.
청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 초안이 작성될 수 있음이 또한 주지된다. 그와 같이, 이러한 진술은 청구 요소의 인용과 관련하여 "단독의", "단지" 등과 같은 배타적인 용어의 사용, 또는 "부정적" 한정의 사용의 선행적 근거로서의 역할을 하도록 의도된다.
"재조합"이라는 용어는, 본 발명의 세포, 핵산, 폴리펩티드/효소 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, 이것이 그의 천연 상태로부터 변형되었음을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 그 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 자연에서 발견되는 것과는 상이한 수준으로 또는 자연에서 발견되는 것과는 상이한 조건 하에 천연 유전자를 발현한다. 재조합 핵산은 하나 이상의 뉴클레오티드만큼 천연 서열과 상이할 수 있고/있거나 발현 벡터에서 이종 서열, 예를 들어, 이종 프로모터, 분비를 허용하는 신호 서열 등에 작동가능하게 연결된다. 재조합 폴리펩티드/효소는 하나 이상의 아미노산만큼 천연 서열과 상이할 수 있고/있거나 이종 서열과 융합된다. 관심 대상의 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 예를 들어 재조합 벡터이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "본질적으로 이루어진"이라는 용어는 이 용어 앞의 성분(들)이 이 성분(들)의 작용 또는 활성에 기여하지 않거나 이 성분의 작용 또는 활성을 간섭하지 않는 전체 조성물의 30 중량% 미만인 총 양의 다른 공지된 성분(들)의 존재 하에 있는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "포함하는"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어 앞의 성분(들)을 포함하지만 이에 한정되지 않음을 의미함이 또한 주지된다. "포함하는"이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 필수적이지만, 그 성분(들)을 포함하는 조성물은 다른 비-필수적이거나 선택적인 성분(들)을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "~으로 이루어진"이라는 용어는 "~으로 이루어진"이라는 용어 앞의 성분(들)을 포함하며 이에 한정됨을 의미함이 또한 주지된다. 따라서 "~으로 이루어진"이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 필수적이며, 다른 성분(들)이 조성물에 전혀 존재하지 않는다.
본 개시 내용을 읽을 시에 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 개시되고 예시된 개별 실시 양태 각각은 별개의 성분, 및 본원에 개시된 본 발명의 조성물 및 방법의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않고서 다른 몇몇 실시 양태들 중 임의의 것의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 이와 조합될 수 있는 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건들의 순서대로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유전적으로 안정한 주"라는 용어는 불안정한 주의 성장 속도와 비교하여 그의 더 빠른 성장 속도를 나타낸다. 또한, 다수의 사상균 숙주, 예를 들어, 트리코데르마에서, 고체 배양 배지 상에서의 해진 윤곽과는 반대로, 매끄러운 원형 콜로니의 형성이 두드러진 특징으로서 이용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 대상의 단백질"이라는 용어는 사상균에서 발현시키기를 원하는, 선택적으로 높은 수준으로 그리고 상용화 목적으로 발현시키기를 원하는 폴리펩티드를 나타낸다. 그러한 단백질은 효소, 기질-결합 단백질, 표면-활성 단백질, 구조 단백질 등일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 대상의 유전자"는 관심 대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 상이한 숙주 세포들 사이의 이전용으로 설계된 핵산 구성물을 나타낸다. "발현 벡터"는 외래 세포 내에 이종 DNA 단편을 포함시켜 외래 세포에서 이를 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 나타낸다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 구매가능하다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식 내에 있다.
따라서, "발현 카세트" 또는 "발현 벡터"는 표적 세포에서 특정한 핵산의 전사를 가능케 하는 일련의 명시된 핵산 요소들을 포함하는, 재조합적으로 또는 합성에 의해 생성된 핵산 구성물이다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편 내로 포함될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열 중에서도, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "플라스미드"라는 용어는 클로닝 벡터로서 사용되는 원형 이중 가닥(ds) DNA 구성물을 나타내며, 이는 많은 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 가외의 염색체 자가 복제 유전 요소를 형성한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같이, "선발 마커" 또는 "선발가능한 마커"라는 용어는 천연적으로 존재하거나, 세포 내로 도입된 유전자를 나타내는데, 세포 내로 도입된 유전자의 발현은 상응하는 선발제의 존재 하에, 또는 상응하는 선발용 성장 조건 하에 성장하는 능력을 세포에게 부여한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "선발가능 마커-코딩 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 그러한 선발 마커 또는 선발가능한 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터"라는 용어는 하류 유전자의 전사를 유도하는 기능을 하는 핵산 서열을 나타낸다. 일반적으로 프로모터는 표적 유전자가 발현될 숙주 세포에 적절할 것이다. 프로모터는, 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열 ("제어 서열"로도 칭해짐)과 함께, 흔히 주어진 유전자를 발현하는 데 사용된다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기들을 포함하는 임의의 길이의 중합체를 나타내기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 코드가 본원에서 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 여기에 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어는 천연적으로 또는 개입; 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)를 포함하는 폴리펩티드와, 본 기술 분야에 공지된 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드가 본 정의 내에 또한 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "진균류"는 버섯뿐만 아니라 효모 및 곰팡이와 같은 미생물도 포함하는 진핵 유기체의 큰 군의 임의의 구성원이다. 이러한 유기체는 식물, 동물, 원생생물 및 박테리아와는 별개인 진균계로 분류된다. 하나의 주요 차이는 진균 세포가 식물 및 일부 원생생물의 세포벽 (셀룰로오스를 포함함)과는 달리, 그리고 박테리아의 세포벽과는 달리, 키틴을 포함하는 세포벽을 갖는다는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "자낭균 진균 주"는 진균계 내의 자낭균문 내의 임의의 유기체를 나타낸다. 예시적인 자낭균류 진균 세포는 페지조마이코티나(Pezizomycotina) 아문 내의 사상균, 예컨대 트리코데르마 spp, 아스페르길루스 spp, 및 페니실륨 spp를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "사상균"은 진정균(Eumycota) 및 난균(Oomycota) 아문의 모든 사상 형태를 나타낸다. 예를 들어, 사상균은 제한 없이, 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스, 에메리셀라(Emericella), 푸사륨, 후미콜라, 뮤코르(Mucor), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 뉴로스포라, 사이탈리듐(Scytalidium), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라듐(Tolypocladium), 또는 트리코데르마 종을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 사상균은 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 또는 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 사상균은 푸사륨 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사륨 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사륨 크루크웰렌세(Fusarium crookwellense), 푸사륨 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사륨 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사륨 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사륨 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사륨 네군디(Fusarium negundi), 푸사륨 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사륨 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사륨 로세움(Fusarium roseum), 푸사륨 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사륨 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사륨 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사륨 술푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사륨 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사륨 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 또는 푸사륨 베네나툼(Fusarium venenatum)이다. 일부 실시 양태에서, 사상균은 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오프토라 서모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 사이탈리듐 서모필룸(Scytalidium thermophilum), 또는 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris)이다. 일부 실시 양태에서, 사상균은 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닝기이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 레에세이, 예를 들어, RL-P37 (문헌[Sheir- Neiss et al., Appl.Microbiol.Biotechnology, 20 (1984) pp. 46-53]; 문헌[Montenecourt B.S., Can., 1- 20, 1987]), QM9414 (ATCC 번호 26921), NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56466, 56767, 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 예를 들어, ATCC 32098 및 32086이다. 일부 실시 양태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이 RutC30이며, 이는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 트리코데르마 레에세이 ATCC 56765로서 입수가능하다. 이와 관련하여, 일부 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 사상균 중 어느 하나의 전체 세포 브로스 제제를 제공한다.
"이종" 핵산 구성물 또는 서열은 이것이 발현되는 세포에 대하여 천연이 아니거나 천연 형태로 존재하지 않는 서열의 일부분을 갖는다. 제어 서열과 관련하여 이종성은 자연에서 발현이 현재 조절되고 있는 동일 유전자를 조절하는 기능을 하지 않는 제어 서열(즉, 프로모터 또는 인핸서)을 나타낸다. 일반적으로, 이종 핵산 서열은 이 서열이 존재하는 게놈의 일부가 아니거나 이 서열이 존재하는 세포에 대하여 내인성이 아니며, 감염, 형질감염, 형질전환, 미세주입, 전기천공 등에 의해 세포에 부가되었다. "이종" 핵산 구성물은 천연 세포에서 발견되는 제어 서열/DNA 코딩 서열 조합과 동일하거나 이와 상이한 제어 서열/DNA 코딩 서열 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"라는 용어는 단세포 유기체이든지, 다세포 유기체로부터 유래되고 조직 배양물 중에 두어진 세포이든지 다세포 유기체의 일부로서 존재하는 세포이든지 간에, 본 발명에 따른 핵산 구성물로 형질전환되기 쉬운 임의의 진균류를 포함한다. 그러한 숙주 세포, 예컨대 효모 및 기타 진균 세포는 본 발명에서 사용되는 바와 같이, DAN의 복제 및 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 생성에 사용될 수 있다. 적합한 세포는 일반적으로 사상균 또는 효모이다. 사상균, 바람직하게는 아스페르길루스, 예컨대 에이. 니게르 및 에이. 투빈겐시스(A. tubingensis)로부터의 세포가 특히 바람직하다. 다른 바람직한 유기체는 아스페르길루스 오리자에, 에이. 아와모리, 트리코데르마 레에세이, 티. 비리데 및 티. 롱기브라키아툼 중 어느 하나를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환된"은 세포가 재조합 DNA 기술을 이용하여 형질전환되었음을 의미한다. 전형적으로 형질전환은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 세포 내에 삽입함으로써 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 즉, 융합 단백질과 같이, 형질전환될 세포에 대하여 천연인 것이 아닌 서열이다.
"유도체"라는 용어는 "기원한", "수득된", "수득가능한" 및 "생성된"이라는 용어를 포함하며, 일반적으로, 하나의 명시된 물질이 또 다른 명시된 물질에서 그의 기원을 찾거나 상기 또 다른 명시된 물질과 관련하여 설명될 수 있는 특징을 가짐을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자"라는 용어는 폴리펩티드를 생성하는 데 연루된 DNA 절편을 의미하며, 이것은 코딩 영역 앞 및 뒤에 영역, 예를 들어, 5' 비번역 (51 UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러(trailer)" 서열과, 개별 코딩 절편들(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 다른 실시 양태에서, 유전자는 상업적으로 중요한 공업용 단백질 또는 펩티드, 예컨대 효소, 예를 들어 프로테아제, 만난아제, 자일라나아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제 및 리파아제를 코딩한다. 관심 대상의 유전자는 천연 발생 유전자, 돌연변이 유전자 또는 합성 유전자일 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 바와 같이, "제한 효소", "제한 엔도뉴클레아제" 또는 "부위-특이적 엔도뉴클레아제"라는 용어는 제한효소 부위로 공지된 특정 인식 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 근처에서 DNA를 절단하는 효소이다. 제한 효소는 일반적으로 3가지 유형으로 분류되며, 이는 그의 구조 면에서 그리고 이들이 그의 DNA 기질을 그의 인식 부위에서 절단하는지 인식 부위와 절단 부위가 서로로부터 분리된 것인지에 따라 다르다. 제I형은 인식 서열로부터 약 1000개 염기쌍 이상의 랜덤 부위에서 절단할 수 있다. 제II형의 절단 서열은 그의 인식 서열과 중첩된다. 제III형은 DNA를 인식 서열로부터 약 25개 염기쌍에서 절단한다. 메가뉴클레아제, 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR/Cas, 예컨대 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)가 또한 제한 효소 하에 분류된다. 메가뉴클레아제는 게놈에서 매우 희귀한 약 12 내지 40개 염기쌍의 큰 인식 부위를 인식하는 천연 발생 제한 효소이다. 메가뉴클레아제의 예는 호밍 메가뉴클레아제, 예컨대 LAGLIDADG 패밀리를 포함하며, 이의 예는 I-SceI, I-CreI, I-MsoI, I-AniI, I-DmiI, 및 PI-PfuI을 포함한다. 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)는 FokI 제한 엔도뉴클레아제로부터의 비특이적 DNA 절단 도메인과 징크-핑거 단백질의 융합물이다. ZFN 이량체는 DNA 손상 응답 경로를 자극하는 표적화 DNA 이중 가닥 파괴(DSB)를 유도한다. 설계된 징크-핑거 도메인의 결합 특이성은 ZFN을 특정 게놈 부위로 안내한다. 전사 활성자-유사 이펙터(TALE) 뉴클레아제(TALEN)는 FokI 절단 도메인과 TALE 단백질로부터 유래된 DNA-결합 도메인의 융합물이다. TALE는 다수의 33 내지 35개 아미노산 반복 도메인을 포함하며, 이들 각각은 단일 염기쌍을 인식한다. ZFN과 같이, TALEN은 DNA 손상 응답 경로를 활성화시켜 맞춤 변경(custom alteration)을 가능하게 하는 표적화 DSB를 유도한다. RNA-가이드 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)는 CRISPR/Cas 시스템의 일부이다. CRISPR(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeat)은 다수의 짧은 동향 반복체(direct repeat)를 포함하는 유전자좌로서, 박테리아 및 고세균에 대한 획득 면역을 제공한다. CRISPR 시스템은 침입 외래 DNA의 서열-특이적 사일런싱(silencing)을 위한 crRNA 및 tracrRNA에 의존한다. 3가지 유형의 CRISPR/Cas 시스템이 존재한다. 제II형 시스템에서, Cas9는 crRNA-tracrRNA 표적 인식시에 DNA를 절단하는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제로서의 역할을 한다.
DNA를 절단하기 위하여, 모든 제한 효소는, DNA 이중 나선구조의 각각의 당-포스페이트 골격(즉, 각각의 가닥)을 한 번 관통하여 2개의 절개를 만든다. 3,000가지 초과의 제한 효소가 상세하게 연구되었으며, 이들 중 600가지 초과의 것은 구매가능하다. 이러한 효소는 실험실에서 DNA 변형에 일상적으로 사용되며, 분자 클로닝에서 필수불가결한 도구이다. 예를 들어, 하기 제한 효소는 8개 염기쌍 제한효소 부위를 인식하며, 구매가능하다: PacI, SwaI, PmeI, AscI, AsiSI, FseI, NotI, SrfI, 및 SgfI. 본원에서 사용되는 제한 효소는 사상균의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있는 한, 천연 발생 제한 효소 및 합성, 하이브리드, 또는 돌연변이 제한 효소를 모두 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제한 효소 부위", "제한효소 부위" 또는 "인식 부위"라는 용어는 다양한 제한 효소에 의해 인식되는, 뉴클레오티드의 특정 서열 (길이가 4 내지 8개 염기쌍으로부터 12 내지 40개 염기쌍까지임)을 포함하는 DNA 분자 상의 위치이다. 이것은 팔린드롬(palindromic) 서열일 수 있거나 (그 이유는 많은 제한 효소가 호모이량체로서 결합하기 때문임), 또는 비대칭적일 수 있으며 (맞춤 설계된 TALEN 또는 ZNF 뉴클레아제의 경우), 특정 제한 효소는 그의 인식 부위 내의, 그 근처의 어떤 곳의, 또는 1000 bp보다 더 멀리 떨어져 있는 것과 같이 멀리 떨어져 있는 두 뉴클레오티드 사이의 서열을 절단할 수 있다. 예를 들어, 일반적인 제한 효소 EcoRI은 팔린드롬 서열 GAATTC를 인식하며, 상부 및 하부 가닥 둘 모두 상의 G와 A 사이를 절단하여 각각의 말단 상의 AATT의 오버행(overhang)을 남긴다. 오버행은 점착성(sticky) 또는 돌출 말단으로도 공지된, 상보체가 부착되지 않은 DNA 가닥의 말단부이다. 그 후 이러한 오버행을 이용하여 DNA의 조각에서 양립가능 돌출 말단 (예를 들어, 또 다른 EcoRI-절단 조각)으로도 공지된 상보성 오버행과 라이게이션시킬 수 있다 (DNA 라이가아제 참조). 일부 제한 효소는 DNA를 블런트(blunt) 말단으로 칭해지는, 오버행을 남기지 않는 방식으로 제한효소 부위에서 절단한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "동일성 %"라는 용어는 "상동성 %"라는 용어와 상호교환가능하게 사용되며, 서열 정렬 프로그램을 이용하여 정렬될 때 본 발명의 폴리펩티드들 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열들 또는 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열들 사이의 핵산 또는 아미노산 서열 동일성의 수준을 나타낸다.
III. 진균 숙주 주, DNA 구성물, 및 사용 방법
본 발명은 진균 숙주 주 및 이의 생성 및 사용을 위한 재조합 DNA 구성물에 관한 것이다. 진균 숙주 주는 본 기술 분야에 공지된 다른 발현 방법과 비교하여 발현 수준에 있어서 더 높은 신뢰도 및/또는 더 낮은 가변성을 가지고서 이러한 숙주에서 관심 대상의 유전자 또는 변이체의 발현을 제공하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 진균 숙주 주는 관심 대상의 유전자를 신뢰가능하거나 덜 가변적인 방식으로 발현하도록 유전자 통합을 효율적으로 표적화하는 데 유용하다.
1. 제한 효소 매개된 통합(restriction enzyme mediated integration; REMI )을 이용한 유전적으로 안정한 형질전환된 진균 주의 구성
첫 번째 측면에서, 본 발명은 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주의 구성 방법을 제공하며, 이는 a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계를 포함한다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 또한 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주의 구성 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 선형화 ("선형"으로도 칭해짐) 또는 원형 DNA와 제한 효소 (제한 효소의 "처리를 이용한"으로도 칭해짐)의 혼합물을 이용하여 트리코데르마 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있음); 및 b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계 (여기서, 제한 효소의 처리를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높음)를 포함한다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 또한 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주의 구성 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 트리코데르마 세포를 선형화 또는 원형 DNA로 형질전환시키는 단계 (여기서, 트리코데르마 세포는 제한 효소를 생성하도록 유도되며, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있음); 및 b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계 (여기서, 제한 효소의 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 유도 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높음)를 포함한다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 상기 첫 번째 측면에 기술된 방법을 사용하여 수득되는 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 제공한다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 사용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 진균 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공하며, 여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 또한 트리코데르마 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공하며, 이는 선형화 또는 원형 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 트리코데르마 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고, 여기서, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있으며, 제한 효소의 처리를 이용한 생성된 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 또한 트리코데르마 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법을 제공하며, 이는 선형화 또는 원형 DNA로 트리코데르마 세포를 형질전환시키는 단계를 포함하고, 여기서, 트리코데르마 세포는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있는 제한 효소를 생성하도록 유도되며, 제한 효소의 유도를 이용한 생성된 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 유도 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높다.
a. 고전적인 진균 주 구성 방법
관심 대상의 단백질을 위한 생산 숙주로서의 진균 주의 사용은 오랫동안 경제적으로 실행가능한 것으로 여겨졌으며 한동안 상업적 환경에서 널리 사용되었다. 형질전환 및 주 구성을 위한 여러 가지 유전적 방법이 진균류에 대하여 개발되었으며, 이는 PEG/원형질체 형질전환 (문헌[Hinnen et al., 1978]), 전기충격 형질전환(electrotransformation) (문헌[Karube et al., 1985]), 바이오리스틱스(biolistics) (문헌[Armaleo et al., 1990]), 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 형질전환(ATMT) (문헌[de Groot et al., 1998]), 및 RNA 간섭(RNAi) 기술 (문헌[Akashi et al., 2005])에 의한 표준 방법을 포함한다.
소정 실시 양태에서, 형질전환을 위한 아스페르길루스 sp. 또는 하이포크레아(Hypocrea) sp. (트리코데르마 sp.)를 준비하기 위하여, 진균류 균사체로부터의 원형질체를 제조한다. 문헌[Campbell et al.Curr.Genet.16:53-56; 1989]을 참조한다. 균사체는 발아된 영양 포자로부터 수득될 수 있다. 균사체를 세포벽을 절단하는 효소로 처리하여 원형질체를 생성한다. 그 후, 원형질체는 현탁 배지 중 삼투 안정제의 존재에 의해 보호된다. 적합한 안정제는 예를 들어 소르비톨, 만니톨, 염화칼륨, 황산마그네슘 등을 포함한다. 전형적으로, 안정제(들)의 농도는 약 0.8 M과 약 1.2 M 사이 (예를 들어, 약 0.9 M과 약 1.2 M 사이, 약 1.0 M과 약 1.2 M 사이, 약 1.1 M과 약 1.2 M 사이 등)에서 변할 수 있다.
특별한 실시 양태에서, 약 1.2 M의 소르비톨이 현탁 배지에서 안정제로서 사용된다. 숙주 주 (예를 들어, 아스페르길루스 sp. 또는 하이포크레아 sp. (트리코데르마 sp.)) 내로의 DNA의 흡수는 흔히 칼슘 이온 농도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 약 10 mM CaCl2 내지 약 50 mM CaCl2 (예를 들어, 약 15 mM 내지 약 45 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 25 mM 내지 약 35 mM)가 흡수용 용액에서 사용된다. 흡수용 용액 중 칼슘 이온의 포함 외에, 흔히 포함되는 다른 물품으로는 완충 시스템, 예컨대 TE 완충제 (10 mM 트리스(Tris), pH 7.4; 1 mM EDTA) 또는 10 mM MOPS (pH 6.0) 완충제 (모르폴린프로판술폰산) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 있다. 이러한 완충제 중의 폴리에틸렌 글리콜은 세포 막을 융합시키는 작용을 함으로써 배지의 내용물이 숙주 주 (예를 들어, 아스페르길루스 sp. 또는 하이포크레아 sp.)의 세포질 내로 전달되게 하고, 플라스미드 DNA가 핵으로 이전된다고 생각된다. 소정 실시 양태에서, 이러한 융합 과정은 다수의 카피의 플라스미드 DNA가 숙주 염색체 내에 통합된 채로 둔다.
일반적으로, 105 내지 106/mL, 바람직하게는 2 xl05/mL의 밀도로 침투 처리를 한 아스페르길루스 sp. 원형질체 또는 세포를 포함하는 현탁물이 형질전환에서 사용된다. 이와 유사하게, 108 내지 109 /mL, 바람직하게는 2 x l08/mL의 밀도로 침투 처리를 한 하이포크레아 sp. (트리코데르마 sp.) 원형질체 또는 세포를 포함하는 현탁물이 형질전환에서 사용된다. 적절한 용액 (예를 들어, 1.2 M 소르비톨; 50 mM CaCl2) 중의 100 μL의 부피의 이러한 원형질체 또는 세포는 요망되는 DNA와 혼합된다. 일부 실시 양태에서, 상당한 양의 PEG가 흡수용 용액에 첨가된다. 예를 들어, 약 0.1 내지 약 1배 부피의 25% PEG 4000이 원형질체 현탁물에 첨가될 수 있다. 특별한 실시예에서, 약 0.25배 부피의 25% PEG4000이 원형질체 현탁물에 첨가된다. 첨가제, 예컨대 디메틸 술폭시드, 헤파린, 스퍼미딘, 염화칼륨 등이 또한 흡수용 용액에 첨가되어 형질전환을 도울 수 있다.
소정 실시 양태에서, 혼합물은 약 0℃에서 약 10 내지 약 30분의 기간 동안 인큐베이션된다. 추가의 PEG를 혼합물에 첨가하여 요망되는 유전자 또는 DNA 서열의 흡수를 추가로 향상시킬 수 있다. 소정 실시 양태에서, 25% PEG 4000은 형질전환용 혼합물의 부피의 5 내지 15배인 부피로 첨가될 수 있지만, 더 큰 부피 및 더 적은 부피가 또한 적합할 수 있다. 예를 들어, 25% PEG 4000은 일부 실시 양태에서 형질전환용 혼합물의 부피의 10배로 첨가된다. PEG가 첨가된 후, 형질전환용 혼합물은 그 후 실온에서 또는 얼음 상에서 인큐베이션된 후 소르비톨 및 CaCl2 용액이 첨가된다. 그 후, 원형질체 현탁물을 성장 배지의 용융 분취물에 추가로 첨가한다. 이러한 성장 배지는 형질전환체의 성장을 가능케 한다. 많은 성장 배지가 본 발명에서 요망되는 형질전환체를 성장시키는 데 적합하게 사용될 수 있다. 소정 실시 양태에서, 예를 들어, Pyr+ 형질전환체가 선발된다면 우리딘을 포함하지 않는 성장 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 콜로니는 우리딘이 고갈된 성장 배지 상으로 옮겨져 정제된다.
이 단계에서, 안정한 형질전환체는 그의 더 빠른 성장 속도에 의해 불안정한 형질전환체와 구별될 수 있다. 또한, 다수의 사상균 숙주, 예를 들어, 트리코데르마에서, 우리딘이 결여된 고체 배양 배지 상에서의 해진 윤곽과는 반대로, 매끄러운 원형 콜로니의 형성이 두드러진 특징으로서 이용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 안정성의 추가의 테스트 및 선발은 형질전환체를 고체 비-선발 배지 (예를 들어, 우리딘을 포함함) 상에서 성장시키고, 이 배양 배지로부터 포자를 수확하고, 이러한 포자의 백분율을 결정함으로써 이루어질 수 있다. 선발된 포자를 우리딘이 결여된 선발 배지 상에서 발아시키고 성장시킨다. 테스트한 모든 형질전환체 중에서 안정한 형질전환체의 백분율을 계산할 수 있다.
그러나, 상기 형질전환 방법을 이용하면, 안정한 형질전환체의 백분율은 5%와 30% 사이에서 변할 수 있으며, 이는 다수의 형질전환체가 최상의 주의 선발을 위하여 스크리닝되어야 함을 의미한다. 안정성 빈도는 트리코데르마 주에서 사용되는 선발 마커에 의존할 수 있다. 불안정한 형질전환체의 빈도가 아스페르길루스와 같은 몇몇 다른 진균류와 비교하여 트리코데르마에서 매우 높은 이유는 여전히 알려져 있지 않다. 불안정한 형질전환체의 이러한 높은 수준 때문에, 생산 주의 스크리닝 및 선발 공정은 매우 힘들고 시간 소모가 큰 경향이 있다. 따라서, 가변성이 감소된 관심 대상의 단백질을 발현시키기 위한 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 생성하는 신뢰가능한 수단이 명백한 이점을 제공한다.
외인성 DNA가 표적화 유전자 대체로서 염색체 내에 통합될 때, 이것은 DNA DSB(이중 가닥 파괴)의 세포 복구 기작을 수반한다. DSB는 하기 두 가지 주요 경로를 통하여 게놈의 유지에서 중요한 역할을 한다: 상동 서열에 의존하는 HR(상동 재조합) 경로 및 서열 상동성에 의존하지 않는 NHEJ 경로 (문헌[Kanaar et al., 1998]). 이러한 두 가지 복구 기작은 독립적으로 작용하는 것으로 간주되지만, 기능에 있어서 경쟁을 나타낸다 (문헌[van Dyck et al., 1999]). 단세포 진핵생물 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)에서, HR은 DSB의 복구에 연루된 주요 경로이며, 반면에, 대부분의 사상균에서 HR의 낮은 빈도 (5%)는 표적화 유전자 대체에 대한 연구를 방해하였다 (문헌[Weld et al., 2006]). 그 결과, NHEJ 경로의 제거를 통한 HR 경로의 증가 방법이 사상균에서의 고도로 효율적인 유전자 표적화의 달성에 필요하다. NHEJ-결함 주가 HR의 효율을 개선시키기 위하여 개발되었으며, 그 이유는 유전자가 그의 내인성 유전자좌에서 HR을 통하여 더 용이하게 통합되기 때문이다. NHEJ-결함 주의 형상은 야생형과 유사하지만, 돌연변이체는 몇몇 화학물질, 예컨대 플레오마이신, 블레오마이신, 및 메틸/에틸 메탄술포네이트에 대하여 더 민감하였다. 따라서, 관심 대상의 유전자가 표적화된 방식으로 진균류 게놈 내에 통합될 수 있게 하기 위하여 다른 방법, 시스템 또는 기술이 개발될 필요가 있다.
b. 제한 효소 매개된 통합( REMI )을 이용한 진균 주의 구성
PEG-원형질체 시스템을 기반으로 한 제한 효소 매개된 통합(REMI)은 처음에 에스. 세레비지애에서 확립되었으며 (문헌[Schiest and Petes, 1991]), 몇몇 진균류 식물병원체, 예컨대 코클리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus) (문헌[Lu et al., 1994])및 알테르나리아 알테르나타(Alternaria alternata)(문헌[Tanaka et al., 1999])에서 성공적으로 적용되었다. 오늘날, REMI 기술은 병원성 유전자의 확인과, 다른 유전자-기능 평가에서 유용한 더 많은 수 또는 백분율의 진균류 돌연변이체를 생성함에 있어서 성공적이었다. 예를 들어, 선충-포획 진균류인 아트로보트리스 올리고스포라(Arthrobotrys oligospora)를 최적화된 REMI법으로 처리하여 선형 플라스미드 DNA 1 μg당 34 내지 175개의 형질전환체, 그리고 총 2000개 초과의 형질전환체를 생성하였다. 부가적으로, REMI를 통하여 푸사륨 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 돌연변이 라이브러리에서 스크리닝된 11가지의 흥미로운 돌연변이체 및 맥류 적미병(wheat scab)에서 독성(virulence)과 연관된 또 다른 두 유전자, CBL1 및 MSY1이 또한 확인되었다 (문헌[Seong et al., 2005]). 게다가, 병원성 또는 식물 방어 화합물에 대한 내성과 관련된 몇몇 단백질이 REMI 기술에 의해 에프. 옥시스포룸(F. oxysporum)으로부터 확인되었다 (문헌[Duyvesteijn et al., 2005]; 문헌[Imazaki et al., 2007; Madrid et al., 2003]). 요약하면, 개선된 돌연변이체 (형질전환체) 빈도 및 단일-카피 삽입률이 REMI에 의해 신뢰가능하게 수득될 수 있다.
본 발명은 지금까지 인식되지 않고 적용되지 않은 맥락에서 REMI의 용도를 제공하며, 즉, REMI는 형질전환체의 빈도와는 대조적으로 안정한 트리코데르마 형질전환체의 백분율을 유의하게 증가시키는 데 사용되었다. 사실상, 형질전환체의 빈도는, 예상된 것과는 반대로, REMI를 트리코데르마에 적용했을 때 더 적은 것으로 밝혀졌다. 그러나, 만들어진 형질전환체들 중, 이것이 감소된 빈도로 있을 경우, 안정한 형질전환체의 수가 극적으로 증가한다.
또 다른 관점으로부터 기술될 경우, 트리코데르마가 제한 효소의 존재 하에 DNA로 형질전환되었을 때, 불안정한 형질전환체의 수는 극적으로 강하됨으로써 안정한 콜로니의 용이한 선발을 허용하였다 (도 4a 내지 도 4e).
전통적인 PEG-매개된 형질전환 실험에서, 안정한 형질전환체의 백분율은 5%와 30% 사이에서 변할 수 있다. 이와는 대조적으로, REMI가 트리코데르마의 PEG-매개된 형질전환에 적용될 때, 안정한 형질전환체의 백분율은 90%까지 증가한다. 그 결과, 최상의 주를 선발하기 위하여 스크리닝되어야 하는 형질전환체의 수는 유의하게 감소될 수 있다.
게다가, REMI가 적용되었을 때, 고 생성 형질전환체의 더 높은 백분율이 관찰되었다.
일부 실시 양태에서, 본원에 개시된 방법에 또는 본원에 개시된 진균 숙주 주와 함께 사용되는 제한 효소는 진균 숙주 주에 두어진 발현 카세트에 의해 생성된다. 적합하게는 발현 카세트는 예를 들어, 고수준 전사에 유용한 서열 및 선발가능 마커를 포함하는 임의의 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
제한 효소 또는 이의 일부의 코딩 영역을 그러한 일반 목적용 발현 벡터 내로 삽입하여 이것을 발현 카세트 프로모터 및 종결 서열의 전사 제어 하에 둘 수 있음이 고려된다. 그러한 일반 목적용 발현 벡터의 비제한적 예로는 아스페르길루스에서의 pRAX가 있다. 관심 대상의 유전자 또는 변이형 유전자, 또는 이의 일부는 강력 glaA 프로모터의 하류에 삽입될 수 있다. 그러한 일반 목적용 발현 벡터의 비제한적 예로는 하이포크레아에서의 pTrex3gM이 있다. 관심 대상의 유전자 또는 변이형 유전자, 또는 이의 일부는 강력 cbhl 프로모터의 하류에 삽입될 수 있다.
소정 실시 양태에서, 벡터에서, 관심 대상의 제한 효소 또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 전사 및 번역 서열, 예를 들어 적합한 프로모터 서열 및 신호 서열에, 구조 유전자에 대하여 리딩 프레임(reading frame)으로, 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 적합하게는 특정 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열이며, 숙주 세포에 대하여 동종성이거나 이종성인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 선택적 신호 펩티드는 관심 대상의 단백질 또는 변이체의 세포외 생성을 제공할 수 있다. 신호 서열을 코딩하는 DNA는 바람직하게는 발현될 유전자와 천연적으로 연관된 것이다. 그러나, 임의의 적합한 소스(source)로부터의, 예를 들어, 엑소-셀로바이오하이드롤라아제로부터의 또는 트리코데르마의 엔도글루카나아제로부터의 신호 서열이 고려된다.
관심 대상의 단백질 또는 제한 효소를 코딩하는 DNA 서열을 프로모터에 라이게이션시키코 그러한 구성물을 적합한 벡터 내로 삽입하는 데 사용될 수 있는 프로토콜은 본 기술 분야에 공지되어 있다.
본원에 개시된 DNA 벡터 또는 구성물은 전술한 공지된 기술, 예컨대 형질전환, 형질감염, 미세주입, 마이크로포레이션(microporation), 바이오리스틱 폭격(bombardment) 등에 따라 진균 숙주 세포 내에 도입될 수 있다.
여기에 제공된 본 발명에서 적합하게 사용되는 진균 주는 트리코데르마 spp., 특히 트리코데르마 레에세이 (롱기브라키아툼(longibrachiatum))으로부터의 것일 수 있다. 그러나, 관심 대상의 유전자는 또한 압시디아(Absidia) spp.; 아크레모늄(Acremonium) spp.; 아간쿠스(Agancus) spp., 안에어로마이세스(Anaeromyces) spp ; 에이. 아우쿨레아투스(A. auculeatus), 에이. 아와몬(A. awamon), 에이. 플라부스(A. flavus), 에이. 포에티두스(A. foetidus), 에이. 푸마리쿠스(A. fumaricus), 에이. 푸미가투스(A. fumigatus), 에이. 니둘란스, 에이. 니게르, 에이. 오리자에, 에이. 테레우스(A. terreus) 및 에이. 베르시콜로르(A. versicolor)를 포함하는 아스페르길루스 spp., 아에우로바시듐(Aeurobasidium) spp.; 세팔로스포룸(Cephalosporum) spp.; 샤에토뮴(Chaetomium) spp.; 크리소스포륨 spp ; 코프리누스(Coprinus) spp ; 닥틸룸(Dactyllum) spp.; 에프. 콩글로메란스(F. conglomerans), 에프. 데셈셀룰라레(F. decemcellulare), 에프. 자바니쿰(F. javanicum), 에프. 림(F. lim), 폭시스포룸(Foxysporum) 및 에프. 솔라니(F. solani)를 포함하는 푸사륨 spp.; 글리오클라듐(Gliocladium) spp.; 에이치. 인솔렌스(H. insolens) 및 에이치. 라누기노사(H. lanuginosa)를 포함하는 후미콜라 spp.; 뮤코르 spp.; 엔. 크라사(N. crassa) 및 엔. 시토필라(N. sitophila)를 포함하는 뉴로스포라 spp.; 네오칼리마스틱스(Neocallimastix) spp ; 오르피노마이세스(Orpinomyces) spp.; 페니실륨 spp; 파네로카에테(Phanerochaete) spp.; 플레비아(Phlebia) spp.; 피로마이세스(Piromyces) spp.; 슈도모나스(Pseudomonas) spp.; 리조푸스(Rhizopus) spp.; 쉬조필룸(Schizophyllum) spp.; 트라메테스(Trametes) spp ; 티. 레에세이, 티. 레에세이 (롱기브라키아툼) 및 티. 빈데(T. vinde)를 포함하는 트리코데르마 spp.; 및 자이고린쿠스(Zygorhynchus) spp.와 같은 진균류를 포함하는 임의의 다른 적합한 미생물로부터 유래될 수 있다. 이와 유사하게, 관심 대상의 유전자, 또는 이것이 코딩하는 단백질은 박테리아, 예컨대 바실루스(Bacillus) spp., 셀룰로모나스(Cellulomonas) spp.; 클로스트리듐(Clostridium) spp., 마이셀리오프토라(Myceliophthora) spp.; 서모모노스포라(Thermomonospora) spp ; 스트렙토마이세스(Streptomyces) spp., 에스. 올리보크로모게네스(S. olivochromogenes); 피브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes), 및 칸디다 토렌스(Candida torrens); 씨. 파라프슬로시스(C. parapsllosis); 씨. 사케(C. sake); 씨. 제일라노이데스(C. zeylanoides), 피키아 미누타(Pichia minuta); 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis); 알. 무실라기노사(R. mucilaginosa), 및 스포로볼로마이세스 로세우스(Sporobolomyces roseus)를 포함하는 효모에서 발견될 수 있다. 관심 대상의 유전자는 대안적으로 박테리아와 같은 다른 소스로부터 유래될 수 있다.
c. 진균 주에서의 표적화 유전자 통합 시스템
일 측면에서, 본 발명은 첫 번째 부분에서, 염색체 DNA 내에 적어도 하나의 제한 효소 부위를 포함하는 진균 숙주 세포; 및 두 번째 부분에서, 관심 대상의 하나 이상의 유전자, 선발 마커 및 상기 염색체 제한 효소 부위의 측면에 있는 서열에 대하여 상당한 상동성을 갖는 서열을 발현시키기 위한 작동가능한 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 진균 발현 시스템을 제공하며; 여기서, 상기 상동 서열은 관심 대상의 유전자를 발현시키는 상동 재조합 사건을 야기한다. 게다가, 본 발명은 상기 측면의 진균 발현 시스템을 이용하는 방법을 제공하며, 이는 제한 효소 부위를 생성할 수 있는 제한 효소의 존재 하에 진균 숙주 세포를 상기 핵산 분자로 형질전환시키는 단계를 포함한다.
더욱이, 본 발명은 진균 발현 시스템의 이용 방법에 의해 수득된 형질전환된 또는 유도된 진균 주를 제공한다.
또한 추가로, 본 발명은 표적화 유전자 통합 방법을 제공하며, 이는 먼저, 염색체 DNA 내에 적어도 하나의 제한 효소 부위를 포함하는 진균 숙주 세포; 및 관심 대상의 하나 이상의 유전자, 적어도 하나의 선발 마커 및 상기 염색체 제한 효소 부위의 측면에 있는 서열에 대하여 상당한 상동성을 갖는 서열을 발현시키기 위한 작동가능한 서열을 포함하는 핵산 분자를 수득하는 단계 (여기서, 상기 상동 서열은 관심 대상의 유전자를 발현시키는 상동 재조합 사건을 야기함), 그 후, 제한 효소 부위를 생성할 수 있는 제한 효소의 존재 하에 제1 단계의 진균 숙주 세포를 제1 단계의 핵산 분자로 형질전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 미생물 및 진핵 게놈 둘 모두에서 유전자 생성물의 상호작용 단백질 파트너를 확인하는 것을 포함하는 유전자 기능 설명용으로 개발된 표적화 유전자 통합 시스템을 제공한다. 전통적으로, 유전자 기능의 결정 방법은 전형적으로 관심 대상의 유전자의 널(null) 돌연변이를 생성하여 유기체의 표현형을 평가하여서, 언제 관심 대상의 유전자가 비기능성으로 되는지를 언제 관심 대상의 유전자가 있는지에 대하여 비교하는 것을 포함한다. 널 돌연변이는 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어진 유전자 파괴 벡터를 이용한 유전자 파괴 (유전자 넉아웃(knockout) 또는 유전자 대체로도 칭해짐)에 의해 생성된다. 관련 유기체의 형질전환시에, 관심 대상의 파괴 유전자(들)를 갖는 DNA 구성물은 상동 재조합에 의해 그러한 유기체의 게놈 내의 상주(resident) 위치(들)에서 통합되어 그 유전자의 기능성 카피를 대체한다. 상기에 설명된 바와 같이 전통적인 과정은 일련의 유기체에서 유전자의 파괴에 대하여 잘 작용하였지만 몇몇의 물려받은 제한 사항을 갖는다. 예를 들어, 대다수의 진균류를 포함하는 다세포 진핵 생물에서 지배적인 비-상동 말단 연결(non-homologous end join; NHEJ)은 발현 벡터가 게놈 내로 랜덤으로 통합되게 한다. 게다가, 심지어 형질전환체들 사이에서도, 큰 백분율의 불안정한 것이 전형적으로 생성되어서, 안정한 것을 수득하기 위한 형질전환체의 추가의 스크리닝을 필요로 하게 된다.
게다가, 진균류 시스템, 예를 들어, 트리코데르마 레에세이를 포함하는 것을 이용하여 더 높은 비활성을 갖는 단백질 또는 변이체를 확인하기 위한 고-처리량 스크리닝은 표적화 통합 사건의 낮은 효율로 인하여 난제였었다. 반면에, 단백질/변이체/효소 (이는 그 후에 진균 숙주 유기체에 의해 발현되거나 생성될 수 있고, 이것은 그 후 공업용으로 될 수 있음)의 유의미한 스크리닝을 제공하기 위하여, 관심 대상의 단백질/변이체/효소가 결국 생성될 진균류 시스템, 또는 적어도 상대적으로 가깝게 관련된 진균류 시스템에서 그러한 고-처리량 스크리닝을 행하는 것이 결정적임이 오랫동안 이해되고 있다. 그러나, 많은 당업자가 호의를 보이는 트리코데르마 시스템과 같은 진균류 시스템에서, 관심 대상의 돌연변이 유전자를 포함하는 발현 카세트의 랜덤 통합은 거의 필연적이며 빈번하게 일어나서 하기 두 변수가 생기게 되는데, 이의 상호작용은 엄청난 복잡성을 초래한다: 1) 관심 대상의 단백질/변이체/효소의 발현 수준; 및 2) 관심 대상의 단백질/변이체/효소의 활성. 따라서, 게놈 내의 소정의 부위에 표적화된, 관심 대상의 유전자의 통합을 통하여 형질전환체의 단백질 발현의 균질성을 생성하는, 본원에 기술된 것과 같은 접근법이 매우 바람직하며, 그 이유는 단백질 활성이 특징적인 돌연변이와 직접적으로 관련될 수 있기 때문이다.
이전에는 발현 수준의 가변성을 감소시키려는 노력이 이루어졌었다. 예를 들어, 비-상동 말단 연결(NHEJ) 경로 (예를 들어, ku70, ku80 또는 lig4)가 불활성화된 돌연변이 진균 주는 상동 통합의 빈도 증가를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 불행하게도, 그렇게 수득된 형질전환체의 수는 꽤 적었다. 게다가, 공업용 주에서의 ku70의 돌연변이는, 이것이 유전적 불안정성을 초래할 때 가끔 바람직하지 않은 것으로 보고되었다 (문헌[Aw and Polizzi 2013]).
본 발명은 I-SceI 엔도뉴클레아제를 이용하여 티. 레에세이 게놈 내의 소정의 부위에서 이중 가닥 파괴를 생성함으로써, 티. 레에세이 주에서 온전한 NHEJ 유전자에서 표적화 통합 빈도가 개선되었음을 입증한다.
특별한 실시예 (실시예 2)에서, 재조합 티. 레에세이가 cbh2 유전자좌에서 I-SceI 제한효소 부위를 갖도록 구성되었으며, I-SceI 제한효소 부위의 측면에 있는 서열에 대하여 상당한 상동성을 갖는 글루코아밀라아제 발현 카세트를 이용하여, I-SceI의 존재 하에 재조합 티. 레에세이를 형질전환시켰는데, 이는 티. 레에세이 게놈 내의 소정의 부위에서 이중 가닥 파괴를 생성하였다. 이중 교차(double cross over)를 통한 의도된 유전자좌에서의 글루코아밀라아제 발현 카세트의 표적화 통합이 관찰되었다 (도 11). 표 3에서 추가로 입증되는 바와 같이, 글루코아밀라아제를 발현하는 형질전환체 (I-SceI 유도됨) 중 68%가 표적화 방식으로 통합되었으며, 이에 대하여 비-유도된 I-SceI 구성물의 경우에는 겨우 46%였고, 대조 구성물의 경우에는 16%였다.
d. 진균 주의 발효
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법을 이용하여 수득된 형질전환된 진균 주를 적합한 배지에서 발효시키는 방법을 제공한다: a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계.
이 측면에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 방법을 이용하여 수득된 형질전환된 진균 주를 적합한 배지에서 발효시키는 방법을 제공한다: a) 트리코데르마 세포를 선형화/선형 또는 원형 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있음); 및 b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계 (여기서, 제한 효소의 처리를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높음).
동일한 측면에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 방법을 이용하여 수득된 형질전환된 진균 주를 적합한 배지에서 발효시키는 방법을 제공한다: a) 트리코데르마 세포를 선형화/선형 또는 원형 DNA를 이용하여 형질전환시키는 단계 (여기서, 트리코데르마 세포는 제한 효소를 생성하도록 유도되며, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있음); 및 b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계 (여기서, 제한 효소의 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 유도 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높음).
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 상기 측면에 기술된 것에 따라 수득된 형질전환된 진균 주를 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 적합한 배지에서 성장 및 발효시키는 단계를 포함하는, 관심 대상의 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 형질전환된 또는 유도된 진균 주를 본원에 기술된 방법 및 진균 발현 시스템을 이용하여 수득하는, 형질전환된 또는 유도된 진균 주를 적합한 배지에서 발효시키는 방법을 제공한다.
또한 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 형질전환된 또는 유도된 진균 주를 적합한 배지에서 그리고 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 성장 및 발효시키는 단계를 포함하는, 관심 대상의 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다. 그와 같이 수득된 형질전환된 또는 유도된 진균 주는 적합하게는 본원에 개시되거나 제공된 진균 발현 시스템을 이용할 수 있으며, 이는 일반적으로, 적합한 제한 효소 부위를 생성할 수 있는 제한 효소의 존재 하에 진균 숙주 세포를 특정한 핵산 분자로 형질전환시키는 것을 포함한다.
본 기술 분야에 잘 알려진 발효 방법들 중 임의의 것을 적합하게 이용하여 본원에 제공된 형질전환된 또는 유도된 진균 주를 발효시킬 수 있다. 일부 실시 양태에서, 진균 세포를 배치식(batch) 또는 연속식 발효 조건 하에 성장시킨다.
고전적인 배치식 발현은 폐쇄 시스템이며, 여기서 배지의 조성은 발효 시작시에 설정되고, 조성은 발효 동안 변경되지 않는다. 발효 시작시에, 배지에 요망되는 유기체(들)를 접종한다. 환언하면, 전체 발효 공정은 발효 시스템에 내내 어떠한 성분도 첨가하지 않고서 일어난다.
대안적으로, 배치식 발효는 탄소원의 첨가와 관련하여 "배치"가 될 자격이 주어진다. 게다가, 흔히 발효 공정 내내 pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하려는 시도가 이루어진다. 전형적으로, 배치 시스템의 대사 산물 및 바이오매스 조성은 발효가 중단되는 시점까지 끊임없이 변한다. 배치 배양물 내에서, 세포는 정적 유도기(static lag phase)를 통하여 고 성장 대수기까지, 그리고 마지막으로 정지기(stationary phase)까지 진행하며, 여기서 성장 속도는 감소되거나 중지된다. 비처리된 채로 두면, 정지기의 세포는 결국 사멸한다. 일반적으로, 대수기의 세포는 대부분의 생성물 생성에 책임이 있다.
표준 배치 시스템에 대한 적합한 변화는 "유가식 발효" 시스템이다. 전형적인 배치 시스템의 이러한 변화에서, 기질은 발효가 진행됨에 따라 증분식으로 첨가된다. 유가식 시스템은, 이화 산물 억제가 세포의 대사를 저해하는 것이 공지되어 있을 때, 및/또는 발효 배지 중에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템 중 실제 기질 농도의 측정은 어려우며, 따라서 측정가능한 인자, 예컨대 pH, 용존 산소 및 폐가스, 예컨대 CO2의 분압의 변화를 기반으로 하여 개산된다. 배치식 및 유가식 발효는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
연속식 발효는 또 다른 공지된 발효 방법이다. 이것은 규정 발효 배지가 계속적으로 생물반응기에 첨가되고, 동일한 양의 조정(conditioned) 배지가 프로세싱을 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 일반적으로, 연속식 발효는 배양물을 일정 밀도로 유지하며, 여기서 세포는 주로 대수기 성장에서 유지된다. 연속식 발효는 세포 성장 및/또는 생성물 농도에 영향을 주는 하나 이상의 인자의 조정을 허용한다. 예를 들어, 제한 영양소, 예컨대 탄소원 또는 질소원은 고정된 비율로 유지될 수 있으며, 모든 다른 파라미터는 중간 정도까지 허용된다. 다른 시스템에서, 성장에 영향을 주는 다수의 인자가 계속적으로 변경될 수 있는 반면, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지된다. 연속식 시스템은 정상 상태 성장 조건의 유지에 매진한다. 따라서, 배지 배출로 인한 세포 손실은 발효 중 세포 성장 속도로 상쇄되어야 한다. 연속식 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자의 조정 방법과, 생성물 형성 속도의 최대화 기술은 공업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
e. 진균 주에 의해 생성되는 관심 대상의 단백질
일 측면에서, 본 발명은 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되고, 하기 단계를 포함하는 방법을 사용하여 수득된 형질전환된 진균 주를 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 적합한 배지에서 성장 및 발효시키는 단계를 포함하는 관심 대상의 유전자의 발현 방법에 의해 생성된 관심 대상의 단백질을 제공한다: a) 선형화 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 진균 세포를 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 상기 진균 주의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성할 수 있음); 및 b) 단계 a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 진균 주를 선발하는 단계.
이 측면에서, 본 발명은 또한 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되고, 하기 단계를 포함하는 방법을 사용하여 수득된 형질전환된 진균 주를 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 적합한 배지에서 성장 및 발효시키는 단계를 포함하는 관심 대상의 유전자의 발현 방법에 의해 생성된 관심 대상의 단백질을 제공한다: a) 트리코데르마 세포를 선형화/선형 또는 원형 DNA와 제한 효소의 혼합물을 이용하여 형질전환시키는 단계 (여기서, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있음); 및 b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계 (여기서, 제한 효소의 처리를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높음).
동일한 측면에서, 본 발명은 또한 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되고, 하기 단계를 포함하는 방법을 사용하여 수득된 형질전환된 진균 주를 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 적합한 배지에서 성장 및 발효시키는 단계를 포함하는 관심 대상의 유전자의 발현 방법에 의해 생성된 관심 대상의 단백질을 제공한다: a) 트리코데르마 세포를 선형화/선형 또는 원형 DNA를 이용하여 형질전환시키는 단계 (여기서, 트리코데르마 세포는 제한 효소를 생성하도록 유도되며, 제한 효소는 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)를 생성할 수 있음); 및 b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계 (여기서, 제한 효소의 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 유도 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높음).
또 다른 측면에서, 본 발명은 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되고, 첫 번째 부분에서, 염색체 DNA 내에 적어도 하나의 제한 효소 부위를 포함하는 진균 숙주 세포; 및 두 번째 부분에서, 관심 대상의 하나 이상의 유전자, 선발 마커 및 상기 염색체 제한 효소 부위의 측면에 있는 서열에 대하여 상당한 상동성을 갖는 서열을 발현시키기 위한 작동가능한 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 진균 발현 시스템을 이용하는 방법에 의해 수득된 유도된 진균 주에서 관심 대상의 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에 적합한 배지에서 관심 대상의 유전자를 발현시키는 방법에 의해 생성된 관심 대상의 단백질을 제공하며, 여기서, 상기 상동 서열은 관심 대상의 유전자를 발현시키는 상동 재조합 사건을 야기하고, 이에 의해, 제한 효소 부위를 생성할 수 있는 제한 효소의 존재 하에 진균 숙주 세포를 상기 첫 번째 부분의 핵산 분자로 형질전환시킨다.
관심 대상의 단백질은 적합하게는 임의의 내인성 이종 단백질일 수 있다. 관심 대상의 단백질은 하나 이상의 디술피드 가교체를 포함할 수 있거나 기능성 형태가 단량체 또는 다량체인 단백질일 수 있으며, 즉, 단백질은 사차 구조를 갖고, 복수의 동일한 (동종성) 또는 동일하지 않은 (이종성) 서브유닛으로 구성되지만, 관심 대상의 단백질은 바람직하게는 관심 대상의 특성을 갖는 단백질이다.
관심 대상의 단백질은 관심 대상의 변이체일 수 있다. 관심 대상의 단백질 또는 관심 대상의 변이체는 적합하게는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 또는 이들의 변이체, 또는 이러한 효소들 또는 변이체들 중 2가지 이상의 혼합물일 수 있다. 관심 대상의 단백질 또는 관심 대상의 변이형 단백질의 비제한적 예로는 전분 대사에 연루된 단백질 또는 효소, 또는 이들의 변이체, 글리코겐 대사에 연루된 단백질 또는 효소, 또는 이들의 변이체, 효소, 예컨대 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이아제, 엔도- β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루큐로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 타우마틴, 트랜스퍼라아제, 이송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제 (D-헥소스:02- 옥시도리덕타아제, EC 1.1.3.5), 이들의 변이체, 및 이러한 효소들 또는 이들의 변이체들 중 2 가지 이상의 조합이 있을 수 있다.
관심 대상의 단백질 또는 관심 대상의 변이체는 또한 적합하게는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원 (예를 들오, HBV 표면 항원, HPV E7 등), 또는 이들의 변이체 또는 단편, 또는 그러한 물질들, 변이체들 또는 단편들 중 2가지 이상의 혼합물일 수 있다.
관심 대상의 단백질 또는 변이체의 다른 유형은 식품 또는 작물에 영양적 가치를 제공할 수 있는 것일 수 있다. 비제한적 예는 항-영양 인자의 형성을 저해할 수 있는 식물 단백질 및 더 바람직한 아미노산 조성 (예를 들어, 비-트랜스제닉(transgenic) 식물보다 더 높은 라이신 함량)을 갖는 식물 단백질을 포함한다.
f. 그렇게 제조된 단백질성 조성물의 용도
일 측면에서, 본 발명은 관심 대상의 단백질을 포함하는 단백질성 조성물을 제공한다. 단백질성 조성물은 적합하게는 본원에 제공된 방법을 이용하여 생성된다. 본 조성물은 본원에 개시된 방법을 사용하여 발현되는, 관심 대상의 유전자에 의해 코딩되는 관심 대상의 단백질을 포함한다. 본 조성물은 다양한 유용한 공업적 응용, 예를 들어 바이오매스 가수분해, 클리닝 응용, 곡물 가공, 동물 영양, 식품 조성물, 직물 처리 등에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 그렇게 생성된 단백질성 조성물은 리그노셀룰로오스 바이오매스 가수분해에서 사용될 수 있다. 전 세계의 가장 큰 재생성 바이오매스 자원인 리그노셀룰로오스는 주로 리그닌, 셀룰로오스, 및 헤미셀룰로오스로 구성되며, 후자의 대부분은 자일란이다. 리그노셀룰로오스 공급 원료의 에탄올로의 전환은 다량의 공급 원료의 준비된 가용성(ready availability), 재료의 연소 또는 매립(land filling)을 회피하는 것의 바람직함, 및 에탄올 연료의 청정함의 이점을 갖는다. 목재, 농업 부산물(agricultural residue), 초본 작물, 및 도시 고형 폐기물이 에탄올 생성을 위한 공급 원료로 간주되어 왔다. 일단 리그노셀룰로오스가 발효성 당, 예를 들어 글루코스로 전환되면, 발효성 당은 효모에 의해 에탄올로 용이하게 발효된다. 셀룰로오스는 베타-1,4-결합에 의해 공유 결합된 단당 글루코스의 중합체이다. 많은 미생물은 베타-결합된 글루칸을 가수분해시키는 효소를 생산한다. 이러한 효소는 엔도글루카나아제, 셀로바이오하이드롤라아제 및 베타-글루코시다아제를 포함한다. 자일란은 1,4-β-글리코시드-결합된 D-자일로피라노스로부터 형성된 다당류이다. 자일라나아제 (예를 들어, 엔도-1,4-베타-자일라나아제, EC 3.2.1.8)는 자일란에서 내부 β-1,4-자일로시드 결합을 가수분해시켜 더 작은 분자량의 자일로스 및 자일로-올리고머를 생성한다. 본 발명은 그러한 리그노셀룰로오스 바이오매스 사용에 대한 관심 대상의 공업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한, 향상된 형질전환체 안정성을 보인 형질전환된 진균 세포를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 그렇게 생성된 단백질성 조성물은 클리닝 응용에서 사용될 수 있다. 효소 클리닝 성분이 통상적인 화학 세제에 의해서는 쉽게 제거되지 않는 오염물(soil), 얼룩(stain) 및 기타 잔해를 분해시키는 능력 때문에 인기가 있다. 클리닝에 유용한 잘 알려진 효소는 리파아제, 펙티나아제, 만난아제, 심지어 특정한 셀룰라아제와 같은 다른 효소와 함께, 프로테아제 및 아밀라아제를 포함하며, 이들 각각은 상이한 기능성들의 세트를 제공한다. 예를 들어, 프로테아제는 단백질계 얼룩에 대항하며; 아밀라아제는 탄수화물 및 전분에 작용하며; 리파아제는 지질 또는 지방을 분해시킨다. 본 발명은 클리닝 응용에서의 그러한 용도에 대한 관심 대상의 공업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한, 향상된 형질전환체 안정성을 보인 형질전환된 진균 세포를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 그렇게 제조된 단백질성 조성물은 곡물 가공에서 사용될 수 있다. 전분은 미생물 및 더 고등한 유기체에 의해 사용될 뿐만 아니라 식물 그 자신에 의해서도 사용되는, 식물에서 가장 일반적인 저장 탄수화물이다. 매우 다양한 효소가 전분 가수분해를 촉매할 수 있다. 모든 식물원(plant source)으로부터의 전분은 과립의 형태로 나타나지만, 식물원의 종에 따라, 전분은 현저하게 다른 크기 및 물리적 특성으로 나타난다. 과거에는 전분의 산 가수분해가 널리 사용되었지만, 이러한 공정은 현재는 대체로 효소 공정으로 대체되었는데, 상기 효소 공정은 더 적은 내부식성 재료 및 기타 이득을 요구하고, 가열에 있어서 더 적은 에너지를 필요로 하고, 제어가 산 공정보다 상대적으로 더 용이한 것으로 공지되어 있다. 본 발명은 전분 분해 및 곡물 가공에서의 그러한 용도에 대한 관심 대상의 공업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한, 향상된 형질전환체 안정성을 보인 형질전환된 진균 세포를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 그렇게 제조된 단백질성 조성물은 식품 응용에서 사용될 수 있다. 박테리아, 효모 및 곰팡이에 의해 생성된 효소는 수천년 동안 빵, 치즈, 맥주 및 와인과 같은 식품의 제조를 위하여 식품 응용에서 사용되어 왔다. 오늘날 효소는 베이커리, 치즈 제조, 전분 가공 및 과일 주스 및 기타 음료의 제조에 사용되어 개선된 질감, 외관 및 영양적 가치를 제공하며, 바람직한 풍미 및 향을 생성하고, 기타 등등이다. 전형적으로, 식품용 효소는 일련의 유익한 미생물로부터 기원할 뿐만 아니라 동물 및 식물에서도 기원한다 (예를 들어, 전분-소화 효소, 아밀라아제는 발아 중인 보리씨로부터 수득될 수 있다). 효소는 많은 공정에서 합성 화학물질을 대체하는, 전통적인 화학-기반 기술에 대한 실행가능한 그리고 바람직한 대안으로 여겨진다. 효소는 식품 생산 공정의 환경 성능의 개선을 도와서 에너지 소비를 감소시키고 폐기물 또는 부산물의 생분해성을 향상시킬 수 있다. 효소는 그의 작용에 있어서 합성 화학물질보다 더 특이적인 경향이 있으며, 따라서, 효소 공정은 더 적은 부반응 및 폐기물 또는 부산물을 제공하는 경향이 있고, 그 결과 더 높은 품질의 제품을 생성하고 오염 가능성을 감소시킨다. 흔히 효소 공정은 유일한 가능한 공정이기도 하다. 이의 예는 투명 사과 주스 농축액의 생성에 있는데, 이는 효소, 펙티나아제의 사용에 의존한다. 대부분의 식품용 효소는 미생물, 예컨대 바실루스, 아스페르길루스, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로부터 생성된다. 본 발명은 식품 응용에서의 그러한 용도에 대한 관심 대상의 공업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한, 향상된 형질전환체 안정성을 보인 형질전환된 진균 세포를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 그렇게 제조된 단백질성 조성물은 동물 사료 첨가제에서 사용될 수 있다. 셀룰라아제, 자일라나아제, 베타-글루카나아제, 알파-아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 피타아제 및 기타 카르보하이드라아제가 동물 사료 산업에서 널리 사용되어 왔다. 많은 식물계 사료는 동물 성장을 감소시키는 항-영양 인자를 포함하는 물질을 함유하기 때문에, 그러한 사료에 첨가되는 효소는 섬유, 단백질, 전분 및 피테이트를 분해시킴으로써 이러한 항-영양 인자의 소화성을 향상시키며, 이것은 이들이 동물에 의해 더 많이 분해될 수 있게 하고, 더 저렴한 그리고 흔히 현지 생산된 사료의 사용을 가능하게 하는 한편 고기, 난류 또는 밀크의 생산성을 최대화한다. 이와 동시에, 그러한 사료에 첨가된 효소는 또한 소화기관 건강 및 향상된 동물 능력을 뒷받침하는 이득을 제공할 수 있다. 본 발명은 동물 사료 응용에서의 그러한 용도에 대한 관심 대상의 공업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한, 향상된 형질전환체 안정성을 보인 형질전환된 진균 세포를 제공한다.
또한 추가의 실시예에서, 그렇게 제조된 단백질성 조성물은 직물 응용에서 사용될 수 있다. 효소는 직물 가공의 필수적인 부분이 되었다. 직물 산업에서 2가지의 잘 확립된 효소 응용이 있다. 첫째, 아밀라아제와 같은 효소는 발호(desizing)를 위한 예비 피니싱(preparatory finishing) 분야에서 일반적으로 사용된다. 둘째, 셀룰라아제와 같은 효소는 면제품의 유연화, 바이오스토닝(bio-stoning) 및 보풀(pilling) 경향 감소를 위하여 피니싱 분야에서 일반적으로 사용된다. 다른 효소, 예를 들어 펙티나아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 자일라나아제 등도 직물 가공에서 사용된다. 게다가, 데님 및 비-데님의 색바램, 바이오스코어링(bio-scouring), 바이오폴리싱(bio-polishing), 울 피니싱(wool finishing), 퍼옥시드 제거, 염료의 탈색 등을 포함하는, 효소를 수반하는 다양한 응용이 있다 (문헌[Cavaco-Paulo and Gubitz, 2003]; 문헌[Chelikani et al., 2004]; 문헌[Nalankilli, 1998]; 문헌[Shenai, 1990]). 본 발명은 직물 응용에서의 그러한 용도에 대한 관심 대상의 공업용 효소, 변이체, 및 혼합물의 생산자로서 적합하고 유리한, 향상된 형질전환체 안정성을 보인 형질전환된 진균 세포를 제공한다.
실시예
본 발명의 주, 조성물 및 방법의 측면은 하기 실시예를 고려하면 더 이해될 수 있는데, 하기 실시예는 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 재료 및 방법에 대한 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명에서 사용되는 일부 진균 (트리코데르마) 주 및 플라스미드 (대부분 이 연구에서 구성됨)의 요약이 하기 표 1에 예시되어 있다:
Figure 112017061384936-pct00001
실시예 1: REMI를 이용한 AclAmy1 발현
A. AclAmy1 발현 벡터의 구성
1) pTrex3gM - AclAmy1
관심 대상의 단백질 모델로서 여기서 사용한 효소 AclAmy1은 하기의 아미노산 서열을 갖는 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus)로부터 유래된 산 안정성 진균 알파 아밀라아제를 나타낸다 (이때 신호 서열은 볼드체이면서 이탤릭체임) (서열 번호 1):
Figure 112017061384936-pct00002
AclAmy1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 8개의 인트론을 포함하며, 이 서열은 하기에 제시되어 있다 (서열 번호 2):
Figure 112017061384936-pct00003
Figure 112017061384936-pct00004
이 단백질은 67 킬로달톤(kDa)의 계산된 질량을 가지며, 클래스 EC 3.2.1.1. 내의 다른 것과 같이, 대형 알파-결합 다당류 (예를 들어, 전분)의 알파-결합을 가수분해시킬 수 있다. 기질로서 PAHBAH (p-히드록시 벤조산 하이드라지드)에서 측정할 경우 최적 pH는 4.5인 반면, 고 효소 활성은 pH 3 내지 7의 넓은 범위에서 발견된다. 그의 효소 활성이 최적인 온도는 66℃이다.
pTrex3gM-AclAmy1 벡터는 AclAmy1의 그의 천연 코딩 서열로부터의 발현을 유도하도록 설계하였으며, 이는 강력 cbhI 프로모터의 제어 하에 두어졌다. AclAmy1을 코딩하는 AclAmy1 유전자를 하기 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 아스페르길루스 클라바투스 염색체로부터 증폭시켰다:
프라이머 1 (5'-ggggcggccgccaccATGAAGCTTCTAGCTTTGACAAC-3') (서열 번호 3); 및
프라이머 2 (5'-cccggcgcgccttaTCACCTCCAAGAGCTGTCCAC-3') (서열 번호 4).
제한 효소 NotI 및 AscI을 이용한 절단 후, PCR 생성물을 pTrex3gM 발현 벡터 (미국 특허 출원 공개 제2011/0136197 A1호에 기술된 바와 같음) 내에 클로닝하고, 상기 제한 효소들을 이용하여 절단하고, 생성된 플라스미드를 pTrex3gM-AclAmy1로 표지하였다. pTrex3gM-AclAmy1의 플라스미드 지도가 도 1에 제공되어 있다. 이 플라스미드의 기능성 요소의 전 목록이 도 1에 또한 제공되어 있다.
AclAmy1 유전자의 서열을 DNA 서열 결정에 의해 확인하였다.
2. pENTRY - AclAmy1
발현 벡터 pTrex8gM-AclAmyl1을 구성하기 위하여, 공급자 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))의 권고에 따라 게이트웨이® BP 반응을 통하여 에이. 클라바투스 Amy1 코딩 단편을 먼저 플라스미드 pTrex3gM-AclAmy1 (상기에 설명된 바와 같음)로부터 pDonor221 벡터 내로 재클로닝하였다. 생성된 pEntry-AclAmy1 플라스미드 및 그의 기능성 요소가 도 2에 예시되어 있다.
3. pTrex8gM - AclAmy1
에이. 클라바투스 알파 아밀라아제를 코딩하는 ENTRY 벡터 DNA 단편을 게이트웨이® LR 반응을 통하여 pTREX8gM 내로 추가로 이전시켜 플라스미드 pTREX8gM-AclAmy1을 생성하였다 (도 3). pTrex8gM-AclAmy1의 기능성 요소가 도 3에 열거되어 있다.
코딩 영역의 서열 결정에 의해 클론을 확증하였다.
B. 이소성 발현을 위한 형질전환
1. 원형질체의 준비
트리코데르마 주의 포자를 50 mL의 YEG 배양 배지 (5 g/L의 효모 추출물, 20 g/L의 글루코스) 내에 접종하고, 50 mm 스로(throw)를 갖춘 진탕 인큐베이터 (스위스 소재의 인포스-에이치티(Infors-HT))에서 180 rpm의 속도로 28℃에서 하룻밤 250 mL 진탕 플라스크에서 성장시켰다. 일부 실험에서, cbh1, cbh2, egl1 및 egl2 유전자가 결실된 티. 레에세이 주 RL-P37의 유도체를 사용하고, 일부 다른 실험에서는 다른 티. 레에세이 주를 사용하였다. 임의의 적합한 트리코데르마 주가 본원에 개시된 것과 같이 실험용으로 작용한다.
발아된 포자를 10분간의 원심분리 (3000 g)에 의해 수집하고, 10 mL의 1.2 MgSO4, 10 mM 인산나트륨 (pH 5.8)으로 2회 세척하였다. 펠렛을 1.2 g의 용해 효소 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma))가 보충된 상기 완충액 40 mL에 재현탁시켰다.
이것을 원형질체가 형성될 때까지 100 내지 200 rpm의 속도로 진탕하면서 진탕 인큐베이터에서 28℃에서 인큐베이션하였다.
현탁물을 미라클로스(Miracloth)를 통하여 여과하여 균사체를 제거하고, 동일 부피의 0.6 M 소르비톨, 0.1 M 트리스-HCl (pH 7.0)을 원형질체 용액의 상부에 조심스럽게 첨가하였다. 이것을 4000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다.
원형질체는 상 사이에서 발견되었으며, 그 후 이를 조심스럽게 수집하고, 새로운 튜브로 옮겼다. 요구될 경우 이 단계를 필요한 원형질체가 수집될 때까지 반복하였다. 동일한 부피의 1.2 M 소르비톨, 10 mM CaCl2, 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5)을 원형질체에 첨가하였다. 원형질체를 4℃에서 4000 rpm에서 15분 동안 펠렛화하고, 1.2 M 소르비톨, 10 mM CaCl2, 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5)에서 2회 세척하였다. 마지막으로, 원형질체를 1x108개의 원형질체/mL의 농도까지 상기 완충액에 재현탁시키고, 200 μL의 원형질체당 50 μL의 25% PEG 6000, 50 mM CaCl2, 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5)을 첨가하였다. 그 후, 생성된 물질을 -80℃에서 보관하였다.
2. 이소성 발현을 위한 형질전환
일부 실험에서, PCR 생성물을 원형질체의 형질전환에 직접적으로 사용하였다. 약 5 내지 20 μg의 DNA (PCR 생성물)을 200 μL의 원형질체에 첨가하고, 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 형질전환 혼합물을 실온으로 옮기고, 2 mL의 25% PEG 6000, CaCl2, 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5) 및 4 mL의 1.2 M 소르비톨, 10 mM CaCl2, 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5)을 첨가하였다.
제한 효소 매개된 통합(REMI)을 샘플에 적용하였으면, 20 단위의 제한 엔도뉴클레아제를 그 샘플의 DNA에 첨가하였다.
일부 다른 실험에서, 플라스미드 DNA를 이용하여 트리코데르마 원형질체를 형질전환시키고, 일부의 경우 그 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 선형화하였다. 절단 혼합물을 인큐베이션한 후, 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클레아제로부터 정제하지 않았다.
하나의 실험에서, AclAmy1 코딩 영역을 통한 cbhI 프로모터로부터 플라스미드 pTrex8gM-AclAmy1 유래의 pyr2의 3' 부분까지의 영역을 포함하는 PCR 단편을 하기 프라이머를 사용하여 수득하였다:
프라이머 1: 5'GAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTG (서열 번호 5); 및
프라이머 2: 3'CGATACACGCACCAGGTACCCCAGTGGGGAAGC) (서열 번호 6).
PcbhI-AclAmy1-pyr2 PCR 생성물을 사용하여, 어떠한 제한 효소도 첨가하지 않고서 또는 PacI 제한 효소를 이용하여 티. 레에세이 원형질체를 형질전환시켰다. 형질전환체를 10 mM NH4Cl이 보충된 AmdS 배지 상에서 우리딘 원영양성(prototrophy)에 대하여 선발하였다. 이 배지를 제조하기 위하여, 2X AmdS 용액 (30 g/L KH2PO4, 20 mM 아세트아미드, 1.2 g/L MgSO4*7H2O, 1.2 g/L CaCl2*2H2O, 0.48 g/L 시트르산*H2O, 0.5 g/L FeSO4*7H2O, 40 mg/L ZnSO4*7H2O, 8 mg/L CuSO4.5H2O, 3.5 mg/L MnSO4.H2O, 2 mg/L H3BO3 (붕산), 40 g/L 글루코스 (pH 4.5))을 2 M 소르비톨을 포함하는 동일한 부피의 4% 한천과 혼합하였다.
트리코데르마 형질전환의 예가 도 4a 내지 도 4e에 예시되어 있다. 도 4a, 도 4c 및 도 4d는 REMI를 이용하지 않은 전형적인 형질전환 실험에서의 티. 레에세이 형질전환체의 사진 및 백분율을 나타낸다--대략 10 내지 20%의 형질전환체가 형태학적으로 안정하다. 도 4b 및 4e는 REMI를 적용한 전형적인 형질전환 실험에서의 티. 레에세이 형질전환체의 사진 및 백분율을 나타낸다--대략 80 내지 90%의 형질전환체가 형태학적으로 안정하다.
3.형질전환체의 선발
글루코스/소포로스 생성 배지에서의 성장 후, 발효 샘플을 영국 소재의 메가자임(Megazyme)으로부터의 α-아밀라아제 활성 키트를 이용한 활성 분석법 ("세랄파법(Ceralpha Method)")을 사용하여 에이. 클라반투스 알파 아밀라아제의 발현 수준에 대하여 분석하였다.
이와 동시에, 발현을 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 라이프 테크놀로지즈).
C. 트리코데르마의 발효 및 아밀라아제 활성의 분석
티. 레에세이 주 RL-P37의 상기에 설명된 유도체로부터의 트리코데르마 형질전환체를 고형의 다공성 매트릭스로부터 락토스를 방출하도록 구성된 24웰 플레이트에 접종하였다. 각각의 웰은 1.25 mL의 NREL 배지 (9 g/L 카사미노산, 5 g/L (NH4)2SO4, 4.5 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4*7H2O, 1 g/L CaCl2*2H2O, 33 g/L PIPPS 완충액 (pH 5.5), 0.25% 티. 레에세이용 미량 원소 (100%:175 g/L 시트르산 (무수), 200 g/L FeSO4*7H2O, 16 g/L ZnSO4*7H2O, 3.2 g/L CuSO4.5H2O, 1.4 g/L MnSO4.H2O, 0.8 g/L H3BO3 (붕산), 16 g/L 글루코스)를 포함하였다. 청징된 상청액을 세랄파법 (영국 소재의 메가자임)을 이용하여 α-아밀라아제 활성에 대하여 분석하였다.
세랄파를 p-니트로페닐 α-D-말토헵타오시드시드 + 곡류, 진균 및 박테리아 α-아밀라아제의 측정을 위한 과량의 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제로 차단한다. 청징화한 상청액을 36 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.5)에서 100 내지 500배 희석시켰다 (이는 예상되는 α-아밀라아제 활성에 의존적이다).
대안적으로, 청징화한 상청액을 10 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, 0.005% 트윈(Tween) 80의 용액에서 100 내지 500배 희석시켰다 (이것도 예상되는 α-아밀라아제 활성에 따라 의존적임). 사십 (40) μL의 희석시킨 청징화 상청액을 동일한 부피의 세랄파 기질과 혼합하고, 28℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 200 mM 붕산나트륨 용액 (pH 10.2)의 첨가에 의해 반응을 중단시켰다. 흡광도를 405 nM에서 측정하고, 희석 계수에 대하여 보정하고, 분당 α-아밀라아제 활성으로 표현하였다. 청징화한 상청액을 또한 SDS-PAGE (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 라이프 테크놀로지즈)로 분석하였다.
도 5는 α-아밀라아제 생성 수준에서의 차이를 나타낸다. 활성 PacI 효소의 존재 하에 수득된 안정한 트리코데르마 iRNAxyn1,3 형질전환체는 더 높은 절대 수준의 α-아밀라아제 활성 및 α-아밀라아제의 발현이 상승된 더 많은 수의 안정한 형질전환체 둘 모두를 나타냈다. REMI는 안정한 형질전환체의 백분율을 (불안정한 것과 비교하여) 증가시켰으며, 안정한 형질전환체는 또한 더 높은 역가의 α-아밀라아제를 생성하였다.
이러한 결과를 제한 효소 SspI의 존재 하에서의 또 다른 플라스미드 pTrex8gM AGL2 (α-갈락토시다아제를 발현함)를 사용한 티. 레에세이 iRNAxyn1,3의 형질전환 실험에 의해 확인하였다.
제한 효소를 첨가하자마자, 불안정한 형질전환체의 배경은 유의하게 감소하였으며, 안정한 α-갈락토시다아제 생성 형질전환체의 백분율은 증가하였다.
실시예 2: 티. 레에세이에서의 I- SceI를 이용한 표적화 통합의 개선
A. 티. 레에세이에서의 I-SceI 활성의 측정을 위한 리포터 주의 구성
1.I - SceI 랜딩 부위 카세트의 구성: 방법
I-SceI 랜딩 부위를 갖는 플라스미드 pBJP6을 하기와 같이 그리고 도 6에 나타낸 바와 같이 설계하고 구성하였다.
5'UTR cbh2, Pcbh1 및 Tcbh2를 각각 프라이머 GSP1 및 GSP2, PP1 및 PP2, GSP3 및 GSP4 (표 2) 및 본원에서의 하기의 목록을 이용하여, 티. 레에세이 주 QM6A의 게놈 DNA (제한 없이, http://www.uniprot.org/taxonomy/431241을 비롯하여 다양한 소스로부터 공개적으로 입수가능함)로부터 증폭시켰다. PCR 단편들을 퓨전(phusion) DNA 폴리머라아제 (퍼멘타스(Fermentas))를 이용하여 융합시키고, pBluescriptSK(+)의 XbaI 및 KpnI 제한효소 부위 내에 클로닝하여 플라스미드 pBJP4를 생성하였다 (도 6).
게다가, 또 다른 플라스미드 pGFPrep를 C-말단 절두 GFP (GFPn* 또는 GFPΔC)를 코딩하는 DNA 단편 (GFPn*-GFPc* 구성물) 및 N-말단 절두 GFP (GFPc* 또는 ΔNGFP)를 코딩하는 DNA 단편 (600-bp 중첩 GFP 서열을 포함함) (해치 바아(hatched bar) 영역)을 지니도록 구성하였다. GFPn*-GFPc* 구성물은 프틸로사르쿠스(Ptilosarcus) sp.의 GFP 서열을 기반으로 하여 설계되었으며, 이를 독일 소재의 진아트(Geneart)로부터 합성 주문하였다. 그 후, GFPn*-GFPc* 구성물을 pBJP4의 NdeI 제한효소 부위 내에, cbhI 프로모터와 cbhI 종결자 사이에 클로닝하여 플라스미드 pBJP5를 생성하였다. 플라스미드로부터의 두 프라이머 (FwpGAN-ISceIPmeI 및 RevpGAN-ISceIPmeI)를 이용한 아스페르길루스 니둘란스의 pyrG 마커의 증폭 및 pBJP5의 PmeI 부위 (GFPn*-GFPc* 구성물에서 상기 두 600-bp 중첩 GFP 서열들 사이) 내로의 클로닝에 의해 최종 pBJP6 플라스미드를 수득하였다. 프라이머를 PCR 증폭 동안 pyrG 마커의 하류 및 상류에 I-SceI 제한효소 부위 및 PmeI 부위를 포함하도록 설계하여, 2개의 I-SceI 부위가 측면에 있는 pyrG 마커를 지닌 PCR 증폭 단편을 생성하였다. 생성된 플라스미드 pBJP6은 5'UTR cbh2-Pcbh1-GFPn*-I-SceI-pyrG-I-SceI-GFPc*-Tcbh2 구성물을 포함하며, 이는 도 6에 나타낸 바와 같다. pBJP6 플라스미드의 서열을 제한효소 분석 및 서열 결정에 의해 확인하였다.
이 실시예에서 사용한 프라이머 서열이 하기에 그리고 또한 표 2로서 제시되어 있다.
GSP1 (정방향) 5'-TCTAGAGGCTGTGCATTTCCGTTCTC-3' (서열 번호 7)
GSP2 (역방향) 5'-TGGTTACGGCAACAAACCTG-3' (서열 번호 8)
PP1 (정방향)
5'-CAGGTTTGTTGCCGTAACCAATTTGCCTGCTTGACCGACTG-3' (서열 번호 9)
PP2 (역방향)
5'-GGAACGATGGGTTTGCGTCCATATGGGGTAAGTCACTTACGGCAGC-3' (서열 번호 10)
GSP3 (정방향) 5'-CCATATGGACGCAAACCCATCGTTCC-3' (서열 번호 11)
GSP4 (역방향) 5'-GGTACCGGTTCACCGCCTTATGTGAG-3'(서열 번호 12)
FwpGAN-ISceIPmel (정방향)
5'-GGTTTAAACCTAGGGATAACAGGGTAATTCGCCCTTGCTCTAGATAAC-3' (서열 번호 13)
RevpGAN-ISCELPmel (역방향)
5'-GGTTTAAACCTAGGGATAACAGGGTAATAATTCGCCCTTGACTAGTGC-3' (서열 번호 14)
GSP5 (정방향) 5'-GCGATCGCACGCAAACCCATCGTTCC-3' (서열 번호 15)
GPS6 (역방향) 5'- GCGATCGCGGTTCACCGCCTTATGTGAG -3' (서열 번호 16)
Figure 112017061384936-pct00005
2. I- SceI 활성의 모니터링을 위한 마커 절제법의 설계: 기작
티. 레에세이에서 메가뉴클레아제 I-SceI 의 활성을 모니터링하기 위하여, 리포터 구성물 pBJP6을 사용하였으며, 분석 방법은 도 8에 도시되어 있다.
도 7의 상부에 개략적으로 도시된 바와 같이, pBJP6은 5'UTR cbh2-Pcbh1-GFPn*-I-SceI-pyrG-I-SceI-GFPc*-Tcbh2 구성물을 포함한다. 5'UTR cbh2 및 Tcbh2의 포함은 숙주 세포에서의 cbh2 유전자좌에서의 표적화 통합에 이용된다. 선발 마커 pyrG의 측면에 있는 두 I-SceI 인식 부위 (회색 박스, 이때 위에 가위가 도시되어 있음)를 이용하여 I-SceI의 활성을 모니터링한다.
이 전략의 근거는 GFPn*-I-SceI-pyrG-I-SceI-GFPc* 구성물을 포함하는 티. 레에세이 주에서의 활성 I-SceI의 발현이 GFP 반복체 (해치 박스로 나타냄)에 의한 이중 가닥 파괴의 복구 및 pyrG 마커의 절제로 이어진다는 것이었다. 상기 반복체들을 통한 완벽한 복구는 GFP를 발현하는 우리딘 영양요구성(pyrG-) 주를 생성한다 (도 7에 도시됨).
3. cbh2 유전자좌에서 I- SceI 제한효소 부위를 갖는 티. 레에세이 주의 구성: 결과
pBJP6을 프라이머 GSP1 및 GSP4 (프라이머 위치는 도 6에 예시되어 있음)를 이용하여 PCR 증폭시켰으며, 상기에 기술된 바와 같이 I-SceI 활성을 모니터링하기 위한 7.5 kb PCR 생성물/카세트 (5'UTR cbh2-Pcbh1-GFPn*-I-SceI-pyrG-I-SceI-GFPc*-Tcbh2 구성물)로, PEG-매개된 원형질체 형질전환 방법에 의해 티. 레에세이 주 P37Δ cbhIpyrG-26을 형질전환시킨다.
우리딘 원영양성 형질전환체를 정제하고, 전체 카세트가 cbh2 유전자좌에 통합된 형질전환체에 대하여 서던 블롯에 의해 분석하였다. 처음의 진단적 PCR (결과를 예시하지 않음)을 기반으로 하여, 9개의 형질전환체를 서던 블롯 분석용으로 선발하였다. 세 개(3개)의 상이한 프로브로 단일 카피 형질전환체를 선발하고 cbh2 유전자좌에서의 게놈 내로의 전체 카세트의 적당한 통합을 확인하였다.
서던 블롯 분석은 cbh2 유전자좌에서 전체 I-SceI 카세트의 단일 카피를 갖는 3개의 형질전환체 (JP7.7, JP7.9 및 JP7.12)를 보여주었다 (도 8).
6개의 잔존 형질전환체 중에서 5개는 통합된 카세트의 다수의 카피를 갖는 것으로 밝혀졌거나 (JP7.10, JP7.11, JP7.13, JP7.14, JP7.15) 게놈 내로 통합된 전체 카세트를 갖는 것으로 보이지 않았다 (JP7.8).
형질전환체 JP7.7을 후속 실험에서 사용하였다.
B. I- SceI 발현 구성물의 구성
1. I- SceI 발현 벡터의 구성
I-SceI 서열 (젠뱅크 등록 번호: GU575293.1)의 코돈 최적화 합성 유전자를 티. 레에세이에서의 발현용으로 생성하였다 (독일 소재의 진아트). 합성 I-SceI 뉴클레오티드 서열이 하기에 예시되어 있다 (서열 번호 17):
Figure 112017061384936-pct00006
I-SceI 발현 벡터를 구성하기 위하여, I-SceI 유전자를 공급자 (미국 소재의 라이프 테크놀로지즈)의 권고에 따라 게이트웨이 재조합을 통하여 미국 특허 출원 공개 제20110020899호에 예시된 바와 같이 텔로미어 플라스미드 pTTT 내로 클로닝하였다. cbhI 유전자의 락토스 유도성 프로모터를 사용하여 pTTT 플라스미드에서 I-SceI 유전자의 발현을 유도하였다. 게다가, pTTT 플라스미드는 에이. 니둘란스의 amdS 선발 마커를 지녔으며, 이는 질소원으로서 아세트아미드를 사용한 티. 레에세이에서의 형질전환 및 선발을 허용하였다.
생성된 발현 카세트 pTTT-I-SceI (도 16)에서, cbhI 유전자의 락토스 유도성 프로모터는 I-SceI 유전자의 발현을 유도한다. 게다가, pTTT 플라스미드는 에이. 니둘란스의 amdS 선발 마커를 지녔으며, 이는 질소원으로서 아세트아미드를 사용한 티. 레에세이에서의 형질전환 및 선발을 허용하였다.
2.티 . 레에세이에서의 I- SceI 발현은 표적화 염색체 유전자좌에서 DSB를 유도한다
pTTT-I-SceI 구성물을 이용하여 랜딩 I-SceI 부위를 포함하는 주와, 랜딩 I-SceI 부위를 포함하지 않는 음성 대조 주를 형질전환시켰다. 형질전환 후, amdS 양성 형질전환체를 최소 배지 상에서 정제하고, 질소원으로서 아세트아미드 및 글루코스를 포함하는 것에 도말하고, 탄소원으로서 2% 글루코스 (비-유도 조건) 또는 2% 락토스 (유도 조건)를 포함하는 9 cm 페트리 디쉬(Petri dish)의 중심부에 점 접종하였다. 형질전환 결과가 도 9에 예시되어 있다.
도 9에 예시된 바와 같이, I-SceI를 발현하고 I-SceI 카세트를 포함하는 주에서의 락토스에 의한 유도는 섹터(sector) 형성을 나타내는 콜로니를 생성한다. 섹터들은 성장이 없는 영역을 나타내는 화살표로 표시되어 있다. 이러한 섹터링은 GFP 반복체를 통하여 복구되는 이중 가닥 파괴를 생성하여 pyrG 마커의 손실을 초래하는 I-SceI 활성으로 해석하였다.
pyrG 마커의 상실의 결과로서, 콜로니의 이 부분은 우리딘 없이는 플레이트 상에서 더 이상 성장하지 않으며, 이는 섹터가 생기게 한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 이러한 섹터는 대부분 락토스를 탄소원으로서 사용할 때 존재하지만, 섹터는 또한 글루코스 플레이트 상에서도 관찰되었으며, 이는 심지어 글루코스 상에서도 일부 I-SceI 이 발현됨을 나타낸다.
락토스 상에서의 섹터링이 pTTT-ISceI 을 발현하는 형질전환체에 대하여 관찰되었지만 대조 주에 대해서는 관찰되지 않았다 (도 9). 우리딘을 락토스 플레이트에 첨가했을 때, 섹터링이 더 이상 보이지 않았으며, 이는 섹터가 pyrG 마커의 상실에 의해 야기되었음을 나타낸다 (도 9). 락토스 플레이트 상에서의 형질전환체의 섹터링은 에스. 세레비지애 I-SceI 이 티. 레에세이에서 발현되어 활성을 가짐을 보여주었다.
액체 배양물에서 재조합을 또한 모니터링하였다. 형질전환체를 우리딘을 포함하는 최소 배지에서 액체 배양에서 성장시키고, I-SceI 발현을 소포로스(Sophorose)에 의해 유도하였다. 생성된 형질전환체를 현미경 관찰한 것이 도 10에 예시되어 있다. 균사의 형광 현미경법은 GFP 형광을 나타냈으며, 이는 루프아웃(loopout)의 결과로서의 기능성 GFP의 재구성을 나타낸다. 유도시에 I-SceI 발현 카세트 (JP7.7.12, JP7.7.14, 및 JP7.7.16)를 갖는 주에서만 GFP가 관찰됨에 따라, 이 결과는 I-SceI 이 유도시에 활발히 발현되었음을 추가로 나타낸다 (도 10).
C. 글루코아밀라아제의 개선된 형질전환 및 표적화 통합 효율
1. 표적화 통합을 위한 글루코아밀라아제 발현 카세트의 구성
cbhI 프로모터의 제어 하에 티. 레에세이의 야생형 글루코아밀라아제 유전자를 지니는 미국 특허 제8138321호에 기술된 플라스미드 ptrex6gGA/wt를 출발점으로 사용하여 I-SceI 랜딩 부위에서 통합될 수 있는 글루코아밀라아제 발현 카세트를 구성하였다.
I-SceI 랜딩 부위에서의 글루코아밀라아제 카세트의 상동 통합을 허용하기 위하여, cbh2 종결 영역 (Tcbh2)을 ptrex6gGA/wt 내에 클로닝하였다 (도 11). Tcbh2를 주형으로서 QM6a의 게놈 DNA 및 프라이머 GSP5 및 GSP6 (표 2에 제공된 바와 같음)을 사용하여 PCR에 의해 수득하였다.
PCR 생성물을 AsiSI 로 절단하고, ptrex6gGA/wt의 상기 제한효소 부위 내에 클로닝하여 플라스미드 pJP8을 제공하였다. 10-kb 글루코아밀라아제 발현 카세트를 PsiI 을 이용하여 pJP8로부터 절단하고, 형질전환에 사용하였다. 형질전환체를 클로리뮤론 에틸에 대한 내성을 부여하는 alS 마커를 통하여 선발하였다.
2. I- SceI 발현 하에서의 형질전환 빈도, 안정성, 및 표적화 통합의 효율
I-SceI 에 의해 매개되는 DSB(이중 가닥 파괴)가 티. 레에세이에서의 형질전환 및 재조합 효율을 증가시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, I-SceI 제한효소 부위 및 I-SceI 발현 카세트를 지닌 주 (JP7.7.12)를 선형 단편으로서 표적화 통합하기 위하여 글루코아밀라아제 발현 카세트로 형질전환시켰다.
형질전환체를 선발 배지 (클로리뮤론 에틸 기질을 포함함)에서 (글루코스를 포함하거나 (I-SceI 비-유도 조건) 락토스와 글루코스의 믹스를 포함함 (I-SceI 유도 조건)) 도말하였다. 음성 대조구로서, 단지 I-SceI 제한효소 부위를 지니고 I-SceI 발현 카세트는 지니지 않는 주 (JP7.7)를 동일한 양의 선형 플라스미드로 또한 형질전환시켰다. 다음, 각각의 형질전환 군에서 수득된 형질전환체의 안정성을 분석하였다. 형질전환 결과 및 안정성 분석 결과가 표 3 및 도 12에 예시되어 있다.
Figure 112017061384936-pct00007
a 각각 I-SceI 의 유도된 발현 및 비-유도된 발현으로 칭해지는, 1%의 락토스 및 1%의 글루코스를 포함하는 형질전환용 플레이트 (TrMMsorb + 우리딘 + 클로리뮤론 에틸) 상에서의 일차 형질전환체의 수.대조 형질전환을 모 주 JP7.7을 사용하여 형질전환용 배지를 이용하여 실시함.
b 일차 형질전환체를 TrMM + 우리딘 + 클로리뮤론 에틸 상에서 정제함. 형질전환체의 안정성을 이중 정제 후 선발 TrMM에서 성장하는 그의 능력에 의해 정의함. 안정한 형질전환체는 이러한 선발 플레이트 상에서 잘 성장함. 불발(abortive) 형질전환체 (안정하지 않음)는 성장하지 않음.
c 안정한 형질전환체를 마이크로타이터(microtiter) 기반 성장/활성 분석에서 글루코아밀라아제 활성에 대하여 테스트함. 배경보다 높은 Gla 활성을 나타내는 형질전환체를 Gla 양성 형질전환체로 간주함.
d Gla 양성 형질전환체를 우리딘을 포함하는 TrMM 또는 우리딘을 포함하지 않는 TrMM 상에 각각의 형질전환체의 포자를 접종함으로써 pyrG 표현형에 대하여 테스트함. 주들은 TrMM+우리딘 상에서는 성장하지만 우리딘을 포함하지 않는 TrMM 상에서는 성장하지 않을 때 pyrG 마이너스 (우리딘 영양요구체)로 간주됨.
e GlaA를 발현하는 pyrG 마이너스 주를 서던 블롯에 의해 분석하고, I-SceI 랜딩 부위에서의 glaA 발현 카세트의 상동 통합을 나타내는 통합 패턴을 확인함.
표 3 및 도 12의 결과는 I-SceI 유도가 형질전환체의 수를 각각 비-유도된 조건 및 대조구와 비교하여 3배 및 6배보다 더 많이 증가시킴을 나타냈다 (표 3). 게다가, 거의 모든 JP7.7.12 형질전환체는, I-SceI 의 유도 후 안정하였으며 (90%), 한편, I-SceI 의 유도를 이용하지 않은 JP7.7.12 형질전환체의 44%만이 안정하였고, 음성 대조 주 JP7.7의 형질전환체 (I-SceI 발현 카세트를 포함하지 않음)의 단지 53% 또는 58%가 안정하였다 (표 3). 이는 I-SceI 의 발현이 형질전환 효율을 증가시켰고 또한 형질전환체의 안정성을 증가시켰음을 입증한다.
각각의 군으로부터의 약 40개의 안정한 형질전환체를, 상기 실시예에서 설명한 바와 같이, 다공성 매트릭스로부터 락토스를 서서히 방출하는 24웰 MTP에서 NREL 배지 상에서 정제 형질전환체를 성장시킴으로써 글루코아밀라아제 생성에 대하여 스크리닝하였다. 형질전환체 중 약 55%는, 각각 비-유도 I-SceI 조건 및 대조구에서의 37% 및 30%에 대하여, I-SceI 유도 조건에서 글루코아밀라아제를 발현하고 있었다.
글루코아밀라아제를 발현하는 형질전환체를 후속적으로 그의 pyrG 표현형에 대하여 분석하였다. 이중 교차를 통한 의도된 유전자좌에서의 글루코아밀라아제 발현 카세트의 표적화 통합은 클로리뮤론 에틸 내성 (alS+) 및 pyrG 마커의 손실 (우리딘 영양요구성으로 이어짐)로 이어질 것으로 예상되었다 (도 11).
표 3에 나타낸 바와 같이, 비-유도된 I-SceI 및 대조구에서 각각 단지 46% 및 16%인 것에 대하여, I-SceI 이 유도될 때, 글루코아밀라아제를 발현하는 형질전환체 중 68%가 표적화된 방식으로 통합되었다.
글루코아밀라아제를 발현하는 선발된 pyrG 마이너스 형질전환체의 서던 블롯 분석은, 상기 형질전환체가 예상되는 바와 같이 I-SceI 랜딩 부위에서 GlaA 발현 카세트를 포함함을 나타냈다 (도 13). 글루코아밀라아제를 발현하지 않거나, 글루코아밀라아제를 발현하지만 pyrG 마이너스인 주는 변경된 통합 패턴을 나타냈다 (도 13).
3. 표적화 통합 대 비 - 표적화 통합 사이의 글루코아밀라아제 발현의 비교
표적화 통합 글루코아밀라아제 발현 카세트를 갖는 형질전환체의 글루코아밀라아제 활성의 가변성을 랜덤 통합으로부터 유래된 것과 비교하기 위하여, 주들을 마이크로타이터 플레이트에서 성장시키고, 배지를 글루코아밀라아제 활성에 대하여 테스트하였다.
각각의 형질전환체를 3개의 마이크로타이터 플레이트 웰에서 독립적으로 성장시키고, 이러한 생물학적 삼중체의 평균 글루코아밀라아제 활성을 측정하고, 표준 편차가 <10%인 고 재현성 결과를 제공하였다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 글루코아밀라아제 카세트가 표적화 통합된 형질전환체는 글루코아밀라아제 카세트가 비-표적화 통합된 것의 발현과 비교하여 글루코아밀라아제 발현의 더 적은 가변성을 나타냈다 (0.9 내지 1.35 상대 단위의 글루코아밀라아제 활성) (도 14). 명백하게, 발현 카세트의 비-표적화 통합은 형질전환체 사이에서 GA 활성 수준의 유의한 변동이 생기게 하였다.
마지막으로, 이러한 데이터는 이중 가닥 파괴가 관심 대상의 유전자를 포함하는 카세트의 I-SceI 촉진된 표적화 통합에 의해 생성되었고 형질전환체 사이에서 단백질 발현의 균질성을 증가시켰음을 입증하였다.
D. 원형질체 혼합물에의 I- SceI의 직접적 첨가에 의한 DSB의 생성 후 글루코아밀라아제 발현 카세트의 개선된 형질전환 및 표적화 통합
1. I- SceI 첨가를 통한 표적화 통합
I-SceI 제한효소 부위를 지닌 원형질체 (JP7.7)와 선형화 글루코아밀라아제 표적화 통합 카세트 (pJP8)의 혼합물 내에 I-SceI 제한 효소를 직접적으로 첨가함으로써 I-SceI 에 의해 매개되는 표적화 통합을 또한 테스트하였다.
간략하게는, 200 μL의 JP7.7 원형질체에 상이한 양의 I-SceI 효소 + 선형화 pJP8 카세트를 첨가하고, 실온에서 15분 인큐베이션하고, 이어서 얼음에서 20분 인큐베이션하였다. I-SceI 을 서모 사이언티픽(Thermo scientific)으로부터 획득하였다. 원형질체에 I-SceI 및 DNA의 혼합물, 1X 최종 농도의 효소 완충제 (예를 들어, 270 μL의 총 부피의 원형질체, I-SceI 및 DNA의 혼합물, 30 μL의 10 X 효소 완충제를 첨가함)를 첨가함으로써 PEG 매개 원형질체 방법에 의해 형질전환을 행하였다. 35분의 인큐베이션 후, 원형질체 혼합물을 10 μM 우리딘 및 5 μg/ml의 클로리뮤론 에틸을 포함하는 형질전환용 플레이트 상에 도말하였다. 결과가 표 4에 요약되어 있다:
Figure 112017061384936-pct00008
a 형질전환용 플레이트 (trMMsorb + 우리딘 +클로리뮤론 에틸) 상의 일차 형질전환체의 수. 일차 형질전환체의 수를 효율을 비교할 수 있도록 동일 원형질체 배치에 대하여 나타냄. 전형적인 실험의 결과가 예시되어 있음.
b 일차 형질전환체를 trMM + 우리딘 + 클로리뮤론 에틸 상에서 정제함. 안정한 형질전환체는 이러한 플레이트 상에서 잘 성장함. 불발 형질전환체 (안정하지 않음)는 성장하지 않음.
c 안정한 형질전환체를 마이크로타이터 기반 성장/활성 분석에서 글루코아밀라아제 활성에 대하여 테스트함. 배경보다 높은 Gla 활성을 나타내는 형질전환체를 Gla 양성 형질전환체로 간주함.
d Gla 양성 형질전환체를 우리딘을 포함하는 trMM 또는 우리딘을 포함하지 않는 trMM 상에 각각의 형질전환체의 포자를 접종함으로써 pyrG 표현형에 대하여 테스트함. 주들은 trMM+우리딘 상에서는 성장하지만 우리딘을 포함하지 않는 trMM 상에서는 성장하지 않을 때 pyrG 마이너스 (우리딘 영양요구체)로 간주됨.
e GlaA를 발현하는 pyrG 마이너스 주를 서던 블롯에 대해 분석하고, I-SceI 랜딩 부위에서의 glaA 발현 카세트의 상동 통합을 나타내는 통합 패턴을 확인함.
f 형질전환체를 우리딘, 클로리뮤론 에틸 배지 및 0.8 mg/ml의 5'플루오로-오로트산(5'FOA)을 함유하는 trMM-Sorb 상에 직접적으로 도말하였다. 콜로니를 우리딘 및 Als 기질 배지를 함유하는 trMM 상에서 1회 정제하였다.
표 4에 나타낸 바와 같이, I-SceI 효소의 직접적 첨가는 형질전환 빈도 및 표적화 통합 형질전환체의 수를 증가시켰다. 수득된 형질전환체의 수는 100 단위의 I-SceI 을 원형질체에 첨가했을 때 3배 증가하였다.
I-SceI 을 첨가했을 때 유의한 수의 일차 형질전환체가 안정한 것으로 밝혀졌다.
형질전환체의 수 및 안정한 형질전환체의 백분율 둘 모두는 I-SceI 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 대략적으로 약 75%의 형질전환체가 I-SceI 의 존재 하에서 Gla 발현 카세트를 포함하는 반면, I-SceI의 부재 하에서는 단지 약 25%의 형질전환체가 글루코아밀라아제 활성을 나타냈다.
글루코아밀라아제를 발현하는 형질전환체의 대부분에서, 발현 카세트는 상동 재조합 사건을 통하여 통합되었다 (각각 50 단위 및 100 단위의 I-SceI 을 첨가할 때 분석한 형질전환체 중 78% 및 85%). 대조 형질전환 (I-SceI을 첨가하지 않음)으로부터의 글루코아밀라아제 발현 형질전환체 중 어떠한 것도 표적화 통합되지 않았다 (표 4).
형질전환용 플레이트에서 I-SceI 첨가를 0.8 mg/mL의 FOA와 조합함으로써, 표적화 통합 형질전환체를 직접적으로 선발할 수 있었다 (표 4). FOA 내성 형질전환체의 정제 후, 모든 안정한 형질전환체를 발현된 글루코아밀라아제에 대해 테스트하였으며, 글루코아밀라아제 발현 카세트는 상동 재조합을 통하여 cbh2 유전자좌에 적당하게 통합되었다 (도 9).
2. 유전적 특성화 및 I- SceI 발현을 이용한 표적화 통합 대 비 - 표적화 통합을 비교하는 글루코아밀라아제 발현의 비교
표적화 통합 글루코아밀라아제 발현 카세트를 갖는 형질전환체의 글루코아밀라아제 활성의 가변성을 랜덤 통합으로부터 유래된 것과 비교하기 위하여, 주들을 마이크로타이터 플레이트에서 성장시키고, 배지를 글루코아밀라아제 활성에 대하여 테스트하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 직접적으로 I-SceI 을 첨가하여 수득된 글루코아밀라아제 카세트가 표적화 통합된 형질전환체는 랜덤 형질전환체의 발현과 비교하여 글루코아밀라아제 발현의 더 적은 가변성을 나타냈다. FOA 선발을 이용하여 수득된 형질전환체도 유사한 발현 패턴을 나타냈으며, 이는 FOA의 선발 및 FOA의 가능한 돌연변이 효과가 글루코아밀라아제의 발현 수준에 영향을 주지 않았음을 나타낸다.
실시예 3: REMI를 사용한 다른 안정한 티. 레에세이 주의 구성
A. 2개의 상이한 DNA 단편을 이용한 티. 레에세이의 형질전환
2개의 상이한 선형 DNA 단편을 관심 대상의 또 다른 단백질을 발현하도록 구성하고, 동시 형질전환(co-transformation)에 의해 티. 레에세이 내에 도입하였다. 하나의 단편은 선발가능 마커로서 pyr2 유전자를 가지며, 다른 하나의 단편은 선발가능 마커로서 amdS 유전자를 가졌다. 어떠한 제한 효소도 이용하지 않고서 또는 제한 효소 SwaI 또는 PacI을 이용하여 형질전환을 수행하였다. 형질전환체를 동시적으로 상기 둘 모두의 마커의 존재에 대하여 선발하였다. 몇몇 형질전환을 수행하여 형질전환 동안 다양한 양의 상이한 제한 효소들의 포함의 영향을 제한 효소를 첨가하지 않은 것과 비교하여 결정하였다. 수득된 형질전환체의 수 및 안정한 것의 %를 나타내는 결과가 하기에 요약되어 있다.
Figure 112017061384936-pct00009
B. 다수의 제한 효소로 처리된 티. 레에세이의 형질전환
형질전환 효율 및 형질전환체의 안정성에 대한 다수의 제한 효소의 사용의 영향을 알아내기 위하여, 분해성 셀룰로오스 모노옥시게나아제 (EG4)-코딩 서열 및 pyr2 선발가능 마커를 포함하는 PCR 단편을 이용하여 티. 레에세이 주를 형질전환시켰으며, 이를 어떠한 제한 효소로도 처리하지 않거나, 20 단위의 단지 AsiSI로 처리하거나, 7 단위의 각각의 AsiSI, PacI 및 SwaI로 처리하거나, 7 단위의 각각의 AsiSI, PacI 및 PmeI로 처리하였다. 형질전환을 이상에서 설명된 바와 같이 표준 PEG 프로토콜에 따라 수행하고, 형질전환체를 1 M 소르비톨을 포함하는 최소 배지 플레이트 상에서 성장시켰다. 그 결과가 도 17a 및 17b에 예시되어 있다. 동일한 총 양의 제한 효소에 의한 절단에서, 3가지 상이한 효소를 이용한 절단은 단지 하나의 제한 효소를 이용한 절단과 비교하여 (50%) 안정한 티. 레에세이 형질전환체의 백분율을 증가시켰지만 (80%까지), 이것은 형질전환 효율을 저하시키는 것으로 보였다.
전술한 조성물 및 방법을 이해의 명확함을 위해 예시 및 예로 약간 상세하게 설명하였지만, 본원의 교시를 고려하여 특정한 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고서 이것에 대하여 이루어질 수 있음이 당업자에게 기꺼이 명백하다.
따라서, 전술한 것은 단순히 본 발명의 조성물 및 방법의 원리를 예시한다. 당업자라면, 본원에서 명백하게 기술되어 있지 않거나 예시되어 있지는 않지만 본 발명의 조성물 및 방법의 원리를 구현하고 그의 사상 및 범주 내에 포함되는 다양한 계획(arrangement)을 고안할 수 있을 것임을 알 것이다. 더욱이, 본원에서 인용된 모든 실시예 및 조건부 언어는 주로 독자가 본 발명의 조성물 및 방법의 원리 및 본 발명자가 본 기술 분야를 발전시키는 데 기여하는 개념을 이해하는 것을 돕고자 하는 것이며, 그렇게 구체적으로 인용된 실시예 및 조건을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 게다가, 본원에서 본 발명의 조성물 및 방법의 원리, 측면 및 실시 양태와, 이의 구체적인 실시예를 나열하는 모든 진술은 이의 구조적 및 기능적 등가물 둘 모두를 포함하고자 하는 것이다. 부가적으로, 그러한 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발될 등가물 (즉, 구조와는 관계 없이 동일한 기능을 수행하는, 개발되는 임의의 요소) 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법의 범주는 본원에서 예시되고 기술된 예시적인 실시 양태에 한정되는 것으로 의도되지 않는다.
참고 문헌
Figure 112017061384936-pct00010
Figure 112017061384936-pct00011
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Phe His Ser Tyr Cys Pro Ile Asn Asn Tyr Asn Asp 165 170 175 Gln Ser Gln Val Glu Asn Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ala Leu 180 185 190 Ala Asp Leu Tyr Thr Gln His Ser Asp Val Arg Asn Ile Trp Tyr Ser 195 200 205 Trp Ile Lys Glu Ile Val Gly Asn Tyr Ser Ala Asp Gly Leu Arg Ile 210 215 220 Asp Thr Val Lys His Val Glu Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Thr Gln 225 230 235 240 Ala Ala Gly Val Tyr Thr Val Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro Ala 245 250 255 Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Gly Tyr Val Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro 260 265 270 Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Arg Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Met 275 280 285 Gly Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Ser Val Ala Ser Asp Cys Lys Asp 290 295 300 Pro Thr Val Leu Gly Ser Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe 305 310 315 320 Ala Ser Tyr Thr Lys Asp Met Ser Gln Ala Lys Ala Val Ile Ser Tyr 325 330 335 Val Ile Leu Ser Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ser Gly Gln Glu Gln 340 345 350 His Tyr Ser Gly Gly Asn Asp Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Ile Trp Leu 355 360 365 Ser Gly Tyr Ser Thr Thr Ser Glu Leu Tyr Lys Phe Ile Ala Thr Thr 370 375 380 Asn Lys Ile Arg Gln Leu Ala Ile Ser Lys Asp Ser Ser Tyr Leu Thr 385 390 395 400 Ser Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Arg 405 410 415 Lys Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Ser Gly 420 425 430 Ser Asn Gly Gly Ser Tyr Thr Leu Asn Leu Gly Asn Ser Gly Tyr Ser 435 440 445 Ser Gly Ala Asn Leu Val Glu Val Tyr Thr Cys Ser Ser Val Thr Val 450 455 460 Gly Ser Asp Gly Lys Ile Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Arg 465 470 475 480 Val Leu Val Pro Ala Ser Trp Met Ser Gly Ser Gly Leu Cys Gly Ser 485 490 495 Ser Ser Thr Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser 500 505 510 Ser Ser Ser Thr Thr Leu Ala Thr Ala Val Thr Thr Pro Thr Gly Ser 515 520 525 Cys Lys Thr Ala Thr Thr Val Pro Val Val Leu Glu Glu Ser Val Arg 530 535 540 Thr Ser Tyr Gly Glu Asn Ile Phe Ile Ser Gly Ser Ile Pro Gln Leu 545 550 555 560 Gly Ser Trp Asn Pro Asp Lys Ala Val Ala Leu Ser Ser Ser Gln Tyr 565 570 575 Thr Ser Ser Asn Pro Leu Trp Ala Val Thr Leu Asp Leu Pro Val Gly 580 585 590 Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Gln Asn Gly Gly Val 595 600 605 Ala Trp Glu Asn Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Glu Ala Cys 610 615 620 Ala Gly Thr Ser Gln Lys Val Asp Ser Ser Trp Arg 625 630 635 <210> 2 <211> 2316 <212> DNA <213> Aspergillus clavatus <400> 2 atgaagcttc tagctttgac aactgccttc gccctgttgg gcaaaggggt atttggtcta 60 actccggccg aatggcgggg ccagtctatc tacttcctga taacggaccg gtttgctcgt 120 acagatggct caacaaccgc tccatgtgat ctcagccaga gggttagtga tttcatcgta 180 ttctttgtca tgtgtcatga cgctgacgat ttcaggcgta ctgtggtgga agctggcagg 240 gtattatcaa gcaagtaagc ctactggttt ccaattttgt tgaattcctt tctgactcgg 300 ccagctcgat tatatccaag gaatgggctt cactgctatt tggatcacac ccattacgga 360 gcaaatccca caggataccg ctgaaggatc agcattccac ggctattggc agaaggatat 420 gtgagtttcc ttataacatt cactacgttt tgctaatata gaacagttac aatgtcaact 480 cccatttcgg aaccgccgat gacattcggg cattgtccaa ggcccttcac gacaggggaa 540 tgtacctgat gattgacgtt gttgccaacc acatggtagg tgatatctca ctgattgagt 600 tataccattc ctactgacag cccgacctca acaaaagggt tacaatggac ctggtgcctc 660 gactgatttt agcaccttta ccccgttcaa ctctgcctcc tacttccact cgtactgccc 720 gatcaacaac tataacgacc agtctcaggt agagaactgt tggttgggag acaacactgt 780 ggctctggca gacctataca cccagcattc ggatgtgcgg aacatctggt acagctggat 840 caaagaaatt gttggcaatt actctggtta gtaatccaat ccaagtcccg tcccctggcg 900 tctttcagaa ctaacagaaa cagctgatgg tctgcgtatc gacaccgtca agcacgttga 960 aaaggatttc tggactggct acacccaagc tgctggtgtt tataccgttg gcgaggtatt 1020 agatggggac ccggcttata cctgccccta tcagggatat gtggacggtg tcctgaatta 1080 tcccatgtga gttcaccctt tcatatacag attgatgtac taaccaatca gctattatcc 1140 cctcctgaga gcgttcgaat cgtcgagtgg tagcatgggt gatctttaca atatgatcaa 1200 ctctgtggcc tcggattgta aagaccccac cgtgctagga agtttcattg agaaccatga 1260 caatcctcgc ttcgctaggt aggccaatac tgacatagga aaggagaaga ggctaactgt 1320 tgcagctata ccaaggatat gtcccaggcc aaggctgtta ttagctatgt catactatcg 1380 gacggaatcc ccatcatcta ttctggacag gagcagcact actctggtgg aaatgacccg 1440 tacaaccgcg aagctatctg gttgtcgggt tactctacca cctcagagct gtataaattc 1500 attgccacca cgaacaagat ccgtcagctc gccatttcaa aggattcaag ctatcttact 1560 tcacgagtat gtgttctggc cagactcaca ctgcaatact aaccggtata gaacaatccc 1620 ttctacactg atagcaacac cattgcaatg cgaaagggct ccgggggctc gcaggtcatc 1680 actgtacttt ccaactctgg ttccaacggt ggatcgtaca cgctcaactt gggtaacagc 1740 ggatactcgt ctggagccaa tctagtggag gtgtacacct gctcgtctgt cacggtcggt 1800 tccgacggca agatccccgt ccccatggca tctggtcttc cccgtgtcct tgttccggca 1860 tcttggatgt ccggaagtgg attgtgcggc agctcttcca ccactaccct cgtcaccgcc 1920 accacgactc caactggcag ctcttccagc actaccctcg ccaccgccgt cacgactcca 1980 actggtagct gcaaaactgc gacgaccgtt ccagtggtcc ttgaagagag cgtgagaaca 2040 tcctacggcg agaacatctt catctccggc tccatccctc agctcggtag ctggaacccg 2100 gataaagcag tcgctctttc ttccagccag tacacttcgt cgaatccttt gtgggccgtc 2160 actctcgacc tccccgtggg aacttcgttt gaatacaaat tcctcaagaa ggagcagaat 2220 ggtggcgtcg cttgggagaa tgaccctaac cggtcttaca ctgttcccga agcgtgtgcc 2280 ggtacctccc aaaaggtgga cagctcttgg aggtga 2316 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of AclAmy1 gene encoding AclAmy1 <400> 3 ggggcggccg ccaccatgaa gcttctagct ttgacaac 38 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of AclAmy1 gene encoding AclAmy1 <400> 4 cccggcgcgc cttatcacct ccaagagctg tccac 35 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for a PCR fragment encompassing the region from the cbhI promoter through AclAmy1 coding region to the 3' part of pyr2 <400> 5 gagttgtgaa gtcggtaatc ccgctg 26 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for a PCR fragment encompassing the region from the cbhI promoter through AclAmy1 coding region to the 3' part of pyr2 <400> 6 cgatacacgc accaggtacc ccagtgggga agc 33 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for confirming the sequence of pBJP6 plasmid (GSP1 ) <400> 7 tctagaggct gtgcatttcc gttctc 26 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for confirming the sequence of pBJP6 plasmid (GSP2) <400> 8 tggttacggc aacaaacctg 20 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer PP1 for confirmation of the sequence of the pBJP6 plasmid <400> 9 caggtttgtt gccgtaacca atttgcctgc ttgaccgact g 41 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer PP2 for confirmation of the sequence of the pBJP6 plasmid <400> 10 ggaacgatgg gtttgcgtcc atatggggta agtcacttac ggcagc 46 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer GSP3 for amplification of 5'UTR cbh2, Pcbh1 and Tcbh2 from genomic DNA of T. reesei strain <400> 11 ccatatggac gcaaacccat cgttcc 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer GSP4 for amplification of 5'UTR cbh2, Pcbh1 and Tcbh2 from genomic DNA of T. reesei strain <400> 12 ggtaccggtt caccgcctta tgtgag 26 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer GAN-ISceIPmel for amplification of the pyrG marker of Aspergillus nidulans <400> 13 ggtttaaacc tagggataac agggtaattc gcccttgctc tagataac 48 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer GAN-ISCELPmel for amplification of the pyrG marker of Aspergillus nidulans <400> 14 ggtttaaacc tagggataac agggtaataa ttcgcccttg actagtgc 48 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer GSP5 for obtaining the PCR product Tcbh2 using the genomic DNA of QM6a <400> 15 gcgatcgcac gcaaacccat cgttcc 26 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer GPS6 for obtaining the PCR product Tcbh2 using the genomic DNA of QM6a <400> 16 gcgatcgcgg ttcaccgcct tatgtgag 28 <210> 17 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized synthetic gene of I-SceI sequence for expression in T. reesei <400> 17 atgaagaaca tcaagaagaa ccaggtcatg aacctcggcc ccaacagcaa gctcctcaag 60 gagtacaaga gccagctcat cgagctcaac atcgagcagt tcgaggccgg catcggcctc 120 atcctcggcg acgcctacat ccgcagccgc gacgagggca agacctactg catgcagttc 180 gagtggaaga acaaggccta catggaccac gtctgcctcc tctacgacca gtgggtcctc 240 agcccccccc acaagaagga gcgcgtcaac cacctcggca acctcgtcat cacctggggc 300 gcccagacct tcaagcacca ggccttcaac aagctcgcca acctcttcat cgtcaacaac 360 aagaagacca tccccaacaa cctcgtcgag aactacctca cccccatgag cctcgcctac 420 tggttcatgg acgacggcgg caagtgggac tacaacaaga acagcaccaa caagagcatc 480 gtcctcaaca cccagagctt caccttcgag gaggtcgagt acctcgtcaa gggcctccgc 540 aacaagttcc agctcaactg ctacgtcaag atcaacaaga acaagcccat catctacatc 600 gacagcatga gctacctcat cttctacaac ctcatcaagc cctacctcat cccccagatg 660 atgtacaagc tccccaacac catcagcagc gagaccttcc tcaagtaa 708

Claims (38)

  1. 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마(Trichoderma) 주(strain)를 구성하기 위해 트리코데르마 형질전환체의 안정성을 향상시키는 방법으로서, 하기 단계를 포함하고:
    a) 관심 대상의 하나 이상의 유전자를 포함하는 선형화 또는 원형 DNA와 복수의 제한 효소의 혼합물을 이용하여 트리코데르마 세포를 형질전환시키는 단계로서, 제한 효소가 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 이중 가닥 파괴(double strand break; DSB)를 생성할 수 있는, 단계; 및
    b) a)에서 생성된 유전적으로 안정한 형질전환 트리코데르마 주를 선발하는 단계로서, 제한 효소의 처리를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율이 제한 효소의 처리 없이 수득가능한 안정한 형질전환체의 백분율보다 더 높은, 단계,
    제한 효소가 적어도 8개의 염기쌍의 제한 효소 부위를 인식하고, PacI, SwaI, PmeI, AscI, AsiSI, FseI, NotI, SrfI 및 SgfI로부터 선택되는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용하지 않은 안정한 형질전환체의 백분율보다 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 높은 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용하지 않은 안정한 형질전환체의 백분율보다 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 6배 더 높은 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 안정한 형질전환체의 백분율은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용한 형질전환의 효율은 제한 효소의 처리 또는 유도를 이용하지 않은 형질전환의 효율보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 높은 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제한 효소는 형질전환된 트리코데르마 세포의 염색체 DNA에서 양립가능한 돌출(cohesive) 말단을 생성할 수 있는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 트리코데르마 세포를 선형화 DNA로 형질전환시키는 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 트리코데르마 세포를 원형 DNA로 형질전환시키는 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 대상의 유전자는 헤미셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀룰라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만난아제, 베타-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 이들의 변이체, 이들의 기능성 단편, 또는 이들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩하는 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 대상의 유전자는 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 유착 분자, 미생물 항원, 이들의 변이체, 이들의 기능성 단편, 또는 이들 중 2가지 이상의 혼합물을 코딩하는 방법.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 선형화 또는 원형 DNA는 선발 마커를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 선발 마커는 als1, amdS, hygR, pyr2, pyr4, sucA, 블레오마이신 내성 마커, 블라스티시딘 내성 마커, 피리티아민 내성 마커, 클로리뮤론 에틸 내성 마커, 네오마이신 내성 마커, 아데닌 경로 유전자, 트립토판 경로 유전자, 또는 티미딘 키나아제 마커인 방법.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 또는 RNA 서열을 사용하는 단계를 포함하지 않는 방법.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 또는 RNA 서열을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 제한 효소에 의해 절단되는 부위에서의 상동 재조합에 의해 트리코데르마 염색체 DNA와 재조합되는, 트리코데르마 게놈 서열에 대하여 상동성인 DNA 서열을 사용하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 트리코데르마 주는 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 주인 방법.
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