CN103060208A

CN103060208A - 高效表达β-1,4-葡聚糖酶编码基因的木霉工程菌株及其应用

Info

Publication number: CN103060208A
Application number: CN2012101755688A
Authority: CN
Inventors: 李纪顺; 陈凯; 杨合同; 扈进冬; 李红梅; 魏艳丽; 张广志; 周红姿; 赵晓燕; 王贻莲; 郭凯
Original assignee: BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: ECOLOGY INSTITUTE OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES (THE SINO-JAPANESE FRIENDSHIP BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER, SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES)
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: CN103060208B

Abstract

本发明公开了一种高效表达巨大芽孢杆菌Ap25来源的?-1,4-葡聚糖酶编码基因glu14的木霉工程菌株及其应用。本发明的工程菌株L-10是通过REMI转化方法将含?-1,4-葡聚糖酶编码基因glu14的真菌表达载体pSilent/glu14整合到具有植物病害生物防治功能的绿色木霉LTR-2染色体中获得的。工程菌株L-10可以组成型、高效表达?-1,4-葡聚糖酶编码基因glu14，其生长速率及产生分生孢子的能力较原始菌株LTR-2明显提高。工程菌株L-10的工业化生产采用液体发酵，诱导剂诱导产生厚垣孢子的新型工艺，并采用麦饭石等载体制备成可湿性粉剂，保存期达2年。温室试验表明工程菌株L-10对小麦纹枯病和黄瓜灰霉病的防治效果比原始菌株LTR-2有显著提高。

Description

高效表达β-1,4-葡聚糖酶编码基因的木霉工程菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域。具体涉及一种高效表达巨大芽孢杆菌Ap25的葡聚糖酶编码基因的木霉生防重组工程菌株及其应用。

背景技术

木霉(Trichoderma)属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、粘孢菌类，菌丝有隔，能产生分生孢子，细胞为单核结构，有性态为肉座菌(Hyporcrea)。木霉是自然界广泛分布的生防真菌，至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌有拮抗作用，目前国际上五大洲60多个国家使用100多种含有木霉菌成分的生物制剂产品。

木霉能够产生多种细胞壁降解酶，其中的葡聚糖酶成为目前研究的热点，被公认为是影响生防真菌重寄生能力的重要因子之一。而植物病原真菌细胞壁的主要组成成分是葡聚糖和几丁质，葡聚糖酶能够水解植物病原真菌细胞壁最外层覆盖的葡聚糖层，导致细胞壁骨架受损，细胞因此而受到杀伤，体外抑菌实验表明，葡聚糖酶对许多真菌菌丝生长有抑制作用，葡聚糖酶广泛存在于动植物、藻类、细菌和真菌体内，在植物病害生物防治领域具有良好的应用前景，但自然来源的木霉菌株产生的葡聚糖酶活性偏低。

对生防菌的遗传改良是获得优良菌株的有效途径，尤其可以有目的地对菌株进行改造，使生防菌获得兼治多种病害的功能。近年来，已成功将20余种来自木霉菌本身和外源生物活性分子的编码基因转入木霉菌中，明显提高了木霉菌的拮抗能力，但利用葡聚糖酶基因转化木霉获得高效工程菌株的报道较少。

发明内容

为了提高木霉的生防效果，本发明人利用β-1,4-葡聚糖酶基因glu14构建真菌表达载体，并利用限制性内切酶介导法（REMI）转化绿色木霉(T. viride)LTR-2，获得具有外源功能基因的木霉生防重组工程菌株。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏, 名称为绿色木霉（Trichoderma-viride）L-10，保藏号为CGMCC NO.5938，保藏日期为2012年3月27日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号3号院，中国科学院微生物研究所。

本发明利用葡聚糖酶编码基因glu14转化绿色木霉LTR-2，得到具有外源功能基因的木霉工程菌株，其中工程菌株绿色木霉（Trchoderma-uiride）L-10的生长速率比原始菌株LTR-2明显提高，产生分生孢子能力也明显增强，其高效、稳定的表达葡聚糖酶活性，对蔬菜灰霉病和小麦纹枯病等植物真菌病害的防治效果均较原始菌株LTR-2有显著提高，为更好地防治植物真菌病害奠定基础。

本发明还提供了一种工程菌株的工业化生产方法，该流程通过液体发酵，诱导剂处理生产得到厚垣孢子。另外，还提供了工程菌株L-10以厚垣孢子为有效活菌成分的可湿性粉剂的制备方法。

本发明用到的菌株与质粒主要有：

巨大芽孢杆菌Ap25：本申请人保存，于1999年分离自澳大利亚的小麦根际土中，对多种植物真菌病害具有防治效果，在羧甲基纤维素钠（CMC）平板上产生明显的水解圈。

葡聚糖酶编码基因(glu14)：片段大小约1.5kb，由PCR扩增自巨大芽孢杆菌Ap25的基因组DNA中，该基因已登录Genbank，序列号为HM130670。

绿色木霉LTR-2：本申请人保存，分离自山东省济南市的蔬菜田土壤中，对多种植物真菌病害具有防治效果，保藏号为CGMCC NO.1498。

本发明提供了用于转化的木霉菌是绿色木霉LTR-2。

本发明提供了用于REMI转化的真菌表达载体pSilent/glu14。

本发明提供了可组成型、稳定表达葡聚糖酶编码基因glu14工程菌株L-10，是由pSilent/glu14载体通过REMI转化法获得的对小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的平板抑制率最高的菌株。

本发明提供了一种工程菌株的工业化生产流程。

本发明还提供了以厚垣孢子为有效活菌成分的可湿性粉剂的配制。

本发明的工程菌株L-10主要用于蔬菜灰霉病、小麦纹枯病等植物真菌病害的防治。

附图说明

图1 表达载体pSilent/glu14的glu14/PCR扩增结果

1 阴性对照的glu14/PCR扩增结果

2 阳性对照的glu14/PCR扩增结果

3 载体pSilent-1的glu14/PCR扩增结果

4 转化子1^#的glu14/PCR扩增结果

5 转化子2^#的glu14/PCR扩增结果

6 转化子3^#的glu14/PCR扩增结果

7 转化子4^#的glu14/PCR扩增结果

8 转化子5^#的glu14/PCR扩增结果

9 转化子6^#的glu14/PCR扩增结果

M D2000 marker (2000,1000,750,500,200,100) bp

图2 表达载体pSilent/glu14的HindⅢ/BglⅡ酶切检测结果

1 质粒pSilent-1的HindⅢ/BglⅡ酶切结果

2 转化子1^#提取质粒pSilent/glu14的HindⅢ/BglⅡ酶切结果

3 转化子3^#提取质粒pSilent/glu14的HindⅢ/BglⅡ酶切结果

4 转化子4^#提取质粒pSilent/glu14的HindⅢ/BglⅡ酶切结果

5 转化子5^#提取质粒pSilent/glu14的HindⅢ/BglⅡ酶切结果

M 1kbDNA marker(10000,8000,7000,6000,5000,4000,3000,2000,1000)bp

图3 表达载体pSilent/glu14的结构图谱

图4 绿色木霉LTR-2产生的原生质体

图5 木霉工程菌株的Southern bloting分析结果

1-7 分别是以glu14基因为探针对野生型菌株LTR-2基因组DNA、阳性对照质粒pSilent/glu14、重组工程菌株L-1、L-4、L-8、L-10、L-20基因组DNA经HindⅢ酶切的Southern bloting结果

图6 木霉工程菌株在PDA(Hyg200μg/mL)平板上的菌落形态

LTR-2(PDA)为原始菌株LTR-2在PDA平板上的菌落形态

LTR-2为原始菌株LTR-2在Hyg200μg/mL平板上的菌落形态

L-1、L-4、L-8、L-10、L-20、L-56为工程菌株在Hyg200μg/mL平板上的菌落形态

图7 木霉工程菌株的葡聚糖酶水解活性检测结果。

具体实施方式

下面用实施例对本发明进行详细说明，实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1：木霉表达载体pSilent/glu14的构建

本实施例中得到的表达载体pSilent/glu14，不仅可用于木霉属真菌的转化，还可用于其它丝状真菌的转化。

β-1,4-葡聚糖酶基因glu14大小约1.5kb，已登录Genbank，序列号为HM130670。利用CTAB/NaCl法提取得到巨大芽孢杆菌Ap25的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，根据Genbank上公布的β-1,4-葡聚糖酶基因设计引物并进行PCR扩增，经过反复实验，最后确定了适合Ap25基因组DNA扩增的glu14引物序列为glu14/F：5’-GCGCAAGCTTATGAAACGGTCAATCTCTAT-3’和glu14/R：5’-GCGCAGATCTCTA

ATTTGGTTCTGTTCC-3’进行PCR扩增（下划线分别代表添加的HindⅢ和BglⅡ酶切位点），PCR产物经纯化后，用HindⅢ/BglⅡ双酶切，过胶纯化。载体pSilent-1同样用HindⅢ/BglⅡ双酶切，过胶纯化。两种酶切产物用快速连接液Solution Ⅰ于16℃连接2h，采用热激法转化Top10感受态细胞，涂布Amp平板，37℃过夜培养。

挑取部分转化子进行glu14/PCR检测，见图1，并使用HindⅢ/BglⅡ酶切验证，见图2，转化子1^#、3^#、4^#的PCR和酶切结果均正确，表明这3个转化子为阳性转化子。表达载体pSilent/glu14图谱见图3，基因glu14表达框以PtrpC为启动子，TtrpC为终止子。

实施例2：原生质体制备与再生

本实施例利用木霉的幼嫩气生菌丝为接种物，可以排除接种分生孢子后，在培养过程中，将未萌发的孢子当作原生质体，而造成对后续实验的干扰。同时在再生培养基中添加促再生试剂JC（0.3 mol/L肌醇、5g/L几丁质粉），有利于原生质体产生细胞壁，提高再生率。

从平板上挑取绿色木霉LTR-2的幼嫩气生菌丝接种PDA液体培养基，28℃振荡培养13h，用3层无菌擦镜纸过滤，无菌水冲洗2次，渗透压稳定剂冲洗2次。取适量菌丝悬浮于裂解液（Lysing Enzymes/蜗牛酶/纤维素酶：各5mg/mL，溶入渗透压稳定剂中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌）中，30℃，50r/min振荡，定期镜检，发现有大量原生质体形成后，用3层擦镜纸过滤菌丝，渗透压稳定剂冲洗2次，4℃，7000r/min，离心10min。沉淀用STC洗涤，4℃，7000r/min，离心10min。沉淀用少量STC悬浮，调整原生质体量10⁷个/mL。分别用STC和无菌水稀释原生质体，不同梯度各取1mL，混入45℃的再生培养基或PDA中，28℃培养3d，计数菌落个数，计算再生率。

再生率(%)=100×（高渗稀释液长出的菌落数-无菌水稀释长出的菌落数）/原生质体数

渗透压稳定剂：0.6mol/L NaCl，0.2mol/L PBS，pH5.8。

STC：0.6mol/L山梨醇，10mmol/L Tris，10mmol/L CaC1₂，pH7.5。

再生培养基：PDA+0.3 mol/L KCl+0.3 mol/L JC。

绿色木霉LTR-2的幼嫩菌丝经裂解酶处理后，酶解初期，顶端细胞壁裂解释放出原生质体（图4左）；酶解后期，菌丝裂解成菌丝段，在菌丝段的一端或两端释放出原生质体，最后释放出大量原生质体，产量大约为10⁸个/mL（图4右）。原生质体大多为圆形，大小不一，这与菌丝体间隔大小不同有关。裂解时间以2h为佳。

原生质体在再生培养基上培养3d，再生率为29%。

实施例3：REMI法转化绿色木霉LTR-2

利用REMI法进行丝状真菌的转化，相比于其它转化方法，具有转化效率高，单拷贝插入几率增加，能够通过质粒拯救与PCR等技术快速分离被标签的目的基因。

根据重组表达载体pSilent/glu14上的酶切位点，选用SacⅠ进行酶切，酶切产物过胶纯化备用。取线性质粒30μg、限制性内切酶SacⅠ4μL、STC 150μL，混匀，冰浴；加原生质体（10⁷个/mL）150μL，混匀，冰浴20min；缓慢滴加PTC（预冷）1.5mL，混匀，冰浴5min，室温20min；加STC（预冷）5mL，混匀，4℃，7000r/min，离心10min；沉淀加入2mL液体再生培养基，28℃，50r/min，培养12h；平板中预加入一薄层再生培养基，转化液适量与45℃左右的固体再生培养基混匀，倒平板，28℃，培养24h；覆盖PDA（潮霉素Hyg 200μg/mL），28℃，培养3d。结果上层平板长出抗潮霉素的木霉小菌落，将这些木霉单菌落转接PDA（Hyg200μg/mL）继续培养4~5d，并进行单孢分离，获得纯化的木霉重组工程菌株，转化率为240个/μg DNA。

PTC：60% PEG4000，10mmol/L Tris，10mmol/L CaCl₂，pH7.5。

利用CTAB/NaCl法提取得到木霉工程菌株的基因组DNA，以该DNA为模板，用glu14引物进行PCR扩增，结果表明：阳性质粒对照和木霉工程菌株中均得到大小1.5kb的目的片段，而阴性ddH₂O和LTR-2中无扩增条带，与预期结果一致，表明glu14基因已转入木霉工程菌株基因组DNA上。

利用限制性内切酶HindⅢ酶切木霉工程菌株的基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，以β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的RCR产物为探针进行Southern blotting，检测T-DNA的插入拷贝数，实验步骤按Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit及Biotin Chromogenic Detection Kit (Fermentas公司)说明书进行。结果野生型LTR-2无杂交带，而阳性质粒pSilent/glu14出现一条杂交带，木霉工程菌株均出现一条杂交带，说明pSilent/glu14已插入木霉工程菌株的基因组DNA中，且为单拷贝插入（图5）。

实施例4：木霉工程菌株的遗传稳定性及菌落形态的观察

单孢分离得到的木霉转化子在PDA平板上连续传代6次后，重新接种Hyg200 μg/mL平板，28℃培养3 d，结果见图6。所有转化子仍可继续生长（L-1、L-4、L-8、L-10、L-20、L-56），而原始菌株LTR-2在PDA平板上可以生长，但在Hyg200 μg/mL平板上不生长。表明木霉转化子对Hyg具有遗传稳定性。

相比于原始菌株LTR-2，大多数转化子的菌落形态发生了明显变化，这些变化包括：菌丝生长速度大小、菌丝层疏密程度、菌落颜色、分生孢子数量等，其中以分生孢子产生数目和菌落颜色发生变异的较多。转化子L-1、L-10、L-20生长速度较原始菌株LTR-2明显提高，而转化子L-10的产孢能力也明显增强（图6）。

实施例5：木霉工程菌株的葡聚糖酶活性测定

在羧甲基纤维素钠（CMC）平板上28℃培养4d，绿色木霉LTR-2可以生长，但没有明显的水解圈，各工程菌株具有明显的水解活性，经刚果红染色后产生黄色水解圈，不同工程菌株的水解圈大小不同（图7）。

实施例6：木霉工程菌株的抑菌活性检测

利用平板对峙培养实验检测木霉工程菌株对R. cerealis的抑制作用，用直径为5mm的打孔器打取木霉工程菌株与小R. cerealis菌落边缘的菌丝块，然后对接在PDA平板两端，两个菌块相距60mm，对照用无菌琼脂块代替。28℃培养，定期观察二者之间的拮抗情况，计算抑制率（%）。

抑制率（%）=100×（r₀ ²-r²）/r₀ ²

r₀：对照病菌生长半径

r：与木霉对峙培养的病菌生长半径

采用SPSS 10.0统计软件中的Duncan方法进行数据分析，以不同大写字母标记表示在P=0.01水平上存在显著性差异。

绿色木霉LTR-2对R. cerealis的平板抑制率为59.7%，各工程菌株对R. cerealis的平板抑制率比野生型均有显著提高，L-10的抑制效果最高，抑制率达86.7%（表1）。

表1 木霉工程菌株对R. cerealis的平板抑制活性检测结果

木霉转化子（transformants）	对小麦纹枯病菌的抑制率（Inhibition ratio against R. cerealis）（%）
		LTR-2	59.7 A
L-1	74.2 B
		L-4	82.3 C
L-8	84.9 C
		L-10	86.7 C
L-20	70.9 B

实施例7：工程菌株L-10厚垣孢子可湿性粉剂的工业化生产流程

通过实施例5和实施例6的结果，初步确定工程菌株L-10为效果较好的工程菌株，故下面的工作以工程菌株L-10进行验证。以工程菌株L-10为例，介绍厚垣孢子可湿性粉剂的工业化生产流程，该工艺采用液体发酵，获得木霉厚垣孢子，并利用麦饭石为载体制备可湿性粉剂，较其它工艺更简单，得到的制剂保存期更长。

（1）斜面菌种：采用固体PDA培养基，将该工程菌株L-10接种在试管培养基上，28℃培养3～4d。

（2）茄瓶菌种：采用液体PDA培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28℃振荡培养1～2d。

（3）液体培养：采用发酵培养基（羧甲基纤维素钠1%，玉米粉1%，葡萄糖0.5%，豆饼粉2%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.2%，碳酸钙0.5%，pH6.0），121℃灭菌20min，将三角瓶种接种发酵罐，接种量0.2%，28℃培养，溶氧量40-50%，通气量1：0.6～0.8，搅拌速度为160r/min，培养30hr后，调整发酵参数：25℃培养，溶氧量20～30%，通气量1：0.4～0.6，搅拌速度为120r/min，添加0.1%的诱导剂甲醛，避光培养6～8hr，至其中厚垣孢子量达到2×10⁹个/mL以上时，结束发酵；所制得的发酵液经简单调配、分装后，可直接作为液体制剂用于作物病害防治。

实施例8：工程菌株L-10可湿性粉剂制备，

利用上述工业方法制备的厚垣孢子量达到2×10⁹个/mL以上的发酵液，添加适当助剂和载体，即可制备可湿性粉剂；其原料用量配方如下：

L-10发酵液（厚垣孢子量达到2×10⁹个/mL） 10mL

麦饭石（300目） 89g

羧甲基纤维素钠 0.5g

几丁质粉 0.2g

黄原胶 0.3g

实施例9：工程菌株L-10可湿性粉剂的保存期实验

利用经典加速实验测定工程菌株L-10可湿性粉剂的保存期。取制剂10 g，以铂纸密封，分别于45、50、55、60 ℃下隔不同时间间隔取样，测其中的活菌数C_t，初始制剂中活菌数为C₀，求出各温度下保存不同时间后的相对活性（C_r=C_t/C₀）。以lgC_r对时间t进行线性回归分析，求出斜率，利用K=-2.303×斜率，求出各温度下制剂的失活速度常数（K），将lgK对1/T×10³进行线性回归分析，得Arrhenius方程。根据25 ℃条件下的K²⁵ ^℃值，利用有效期t_0.9=0.1054/K²⁵ ^℃，求出制剂中活菌存活90%所需的时间，即为保存期。

结果见表2：分别求出不同温度下的失活速度常数K，将lgK对1/T×10³进行回归分析，得出Arrhenius方程：lgK=33.8290-11.6329×10³/T，r=-0.9975。在T=25+273.15时，求出K²⁵ ^℃值。lgK²⁵ ^℃=-5.1881，K=6.4851×10^-6，根据t_0.9=0.1054/K²⁵ ^℃=2（年）。在25 ℃的条件下，制剂保存2年后，菌株L-10存活率仍在90%以上。

表 2木霉工程菌株L-10可湿性粉剂在各温度下不同时间的相对活性及其失活速度常数

表 2

实施例10：工程菌株L-10在温室条件下对小麦纹枯病的防治效果。

温室试验用植物病原真菌为R. cerealis，对照药剂为井冈霉素(Jinggangcymin)，对照菌剂为山东泰诺药业有限公司生产的康吉牌木霉菌（KJ）：有效成分含量：1亿活孢子/克，水分散粒剂。试验设9个处理：小麦+R. cerealis、小麦+Jinggangcymin+R. cerealis、小麦+KJ+R. cerealis、小麦+LTR-2+R. cerealis、小麦+L-1+R. cerealis、小麦+L-4+R. cerealis、小麦+L-8+R. cerealis、小麦+L-10+R. cerealis、小麦+L-20+R. cerealis，每处理设3个重复，随机区组排列。

试验用土为田间健康土，肥力中等，等量分装一次性干净花盆中。病原真菌R. cerealis在PDA培养基上培养3d，用无菌打孔器挖取直径5mm的菌块放入花盆内，预培养1周。小麦种子30℃预催芽24hr，挑取出芽一致的种子待用。木霉菌LTR-2及其工程菌株用实施例6得到的制剂，用清水稀释100倍，井冈霉素(Jinggangcymin)将使用浓度稀释为150μg/mL，将上述生防菌液和对照药液浸种1hr，清水对照直接使用出芽的种子。播种时，每个花盆均匀播种25粒种子，出苗后定为20棵。常规管理，试验期为42d。

试验结束，将植株小心从土中拔出，冲净根际土，吸干根际水分，按5级分级标准进行病害调查。小麦纹枯病病情调查分级标准：0级，叶鞘、茎秆均未被侵染；1级，病斑只限制在叶鞘上，茎秆上无病斑；2级，茎秆上虽有病斑，但病斑横长达不到茎秆周长有1/3；3级，病斑横长达到茎秆周长的1/3，但达不到茎秆周长的2/3；4级，病斑横长达到茎秆周长的2/3，直至病斑环绕茎秆。

病株率%=100×每个处理的病株数 /每个处理的总株数

病情指数%=100×∑(各病级×各病级株数) /(最高病级×总调查株数)

防治效果%=100×(对照病情指数－处理病情指数) /对照病情指数

数据采用SPSS 10.0统计软件中的Duncan方法进行分析，以不同大写字母表示各处理间在P=0.01水平上存在显著性差异。

木霉工程菌株在温室条件下对小麦纹枯病有较好的防治效果，与LTR-2、KJ及井刚霉素处理间存在显著性差异（P=0.01），不同工程菌株之间也存在显著性差异（P=0.01），其中工程菌株L-10的防治效果最高，达83.6%（表3）。

表 3木霉工程菌株L-10在温室条件下对小麦纹枯病的防治效果

表3

处理（Treatment）	病情指数（disease index）（%）	防治效果（control efficiency）（%）
			CK	58.0 A	-
井冈霉素（Jinggangcymin）	27.0 B	53.4
			KJ	26.7 B	54.0
LTR-2	25.0 B	56.9
			L-1	15.3 CD	73.6
L-4	14.2 D	75.6
			L-8	10.7 E	81.6
L-10	9.5 E	83.6
			L-20	17.0 C	70.7

实施例11：木霉工程菌株在温室条件下对黄瓜灰霉病的防治效果

黄瓜灰霉病是黄瓜生产中的主要病害之一，危害叶、花和果实，影响黄瓜产量和品质。本试验对照药剂采用50%速克灵，对照菌剂为山东泰诺药业有限公司生产的康吉牌木霉菌（KJ）：有效成分含量：1亿活孢子/克，水分散粒剂。试验设9个处理：黄瓜+ B. cinerea、黄瓜+Jinggangcymin+B. cinerea、黄瓜+KJ+ B. cinerea、黄瓜+LTR-2+ B. cinerea、黄瓜+L-1+ B. cinerea、黄瓜+L-4+ B. cinerea、黄瓜+L-8+ B. cinerea、黄瓜+L-10+ B. cinerea、黄瓜+L-20+ B. cinerea，每处理设3个重复，随机排列。

第一次喷药时间为黄瓜灰霉病发生初期，隔7d放药1次，50%速克灵按说明喷施，木霉菌LTR-2及其工程菌株用实施例6得到的制剂，用清水稀释100倍。

调查内容及方法：第一次喷药前调查发病基数，药后10天调查发生情况。

分级标准：0级，无病斑；1级，残茎留花发病；3级，果脐部发病；5级，病斑长度占果的10%以下；7级，病斑长度占果的11～25%；9级，病斑长度占果的26%以上。

病株率%=100×每个处理的病株数/ 每个处理的总株数

病情指数%=100×∑（各病级×各级株数）/ （最高病级×总调查株数）

防治效果%=100×（对照病指增加－处理病指增加）/对照病指增加

采用SPSS 10.0统计软件中的Duncan方法，以不同大写字母标记表示在P=0.01水平上存在显著性差异。

木霉工程菌株对温室黄瓜灰霉病有较好的防治效果，与LTR-2、KJ及速克灵处理间存在显著性差异（P=0.01），不同工程菌株之间也存在显著性差异（P=0.01），其中工程菌株L-10的防治效果最高，达82.4%（表4）。

[0058] 表 4木霉工程菌株L-10在温室条件下对黄瓜灰霉病的防治效果

表4

处理（Treatment）	病情指数（disease index increase）（%）	防治效果（control efficiency）（%）
			CK	10.6 A	-
井冈霉素（Jinggangcymin）	6.3 B	40.6
			KJ	5.8 B	45.3
LTR-2	5.3 B	50.2
			L-1	3.5 C	66.8
L-4	3.3 CD	69.0
			L-8	2.2 DE	79.4
L-10	1.9 E	82.4
			L-20	3.7 C	65.4

Claims

1.一种高效表达ß-1,4-葡聚糖酶编码基因的木霉工程菌株绿色木霉（Trichodermaviride）L-10，其特征在于该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.5938，保藏时间2012年03月27日。

2.

如权利要求1 所述的木霉工程菌株绿色木霉（T. viride）L-10，其特征为利用ß-1,4-葡聚糖酶编码基因glu14，通过REMI法转化绿色木霉LTR-2，获得了具有外源功能基因的工程菌株绿色木霉（T. viride）L-10。

3.

如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉（T. viride）L-10，其特征在于重组木霉工程菌株L-10染色体中含有所述ß-1,4-葡聚糖酶编码基因；该ß-1,4-葡聚糖酶编码基因在Genbank登录序列号为HM130670。

4.如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉（T. viride）L-10，其特征在于选用了含来自构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的PtrpC为启动子，TtrpC为终止子构成的真菌表达载体pSilent/glu14，通过REMI法转化实现ß-1,4-葡聚糖酶在宿主菌的高效表达。

5.如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉（T. viride）L-10的厚垣孢子发酵液的工业生产方法，其特征在于具体步骤和工艺条件如下：

（1）斜面菌种：采用固体PDA培养基，将工程菌株L-10接种在试管内，28℃培养3～4d；

（2）茄瓶菌种：采用液体PDA培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28℃振荡培养1～2d；

（3）液体培养：采用发酵培养基（羧甲基纤维素钠1%，玉米粉1%，葡萄糖0.5%，豆饼粉2%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.2%，碳酸钙0.5%，pH6.0），121℃灭菌20min，将三角瓶种接种发酵罐，接种量0.2%，28℃培养，溶氧量40～50%，通气量1：0.6～0.8，搅拌速度为160r/min，培养30hr后，调整发酵参数：25℃培养，溶氧量20～30%，通气量1：0.4～0.6，搅拌速度为120r/min，添加0.1%的诱导剂甲醛，避光培养6～8hr，至厚垣孢子量达到2×10⁹个/mL以上时，结束发酵；即获得所述绿色木霉（T. viride）L-10的厚垣孢子发酵液。

6.如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉（T. viride）L-10的可湿性粉剂制备方法，其特征在于原料配方如下：

L-10发酵液 10mL

麦饭石（300目） 89g

羧甲基纤维素钠 0.5g

几丁质粉 0.2g

黄原胶 0.3g 。

7.

如权利要求1所述的木霉工程菌株绿色木霉（T. viride）L-10的应用，其特征在于用于制备防治蔬菜灰霉病、小麦纹枯病以及其他植物真菌病害的生防制剂。