CN109402159A

CN109402159A - 一种转Sm1-chit42木霉工程菌构建及其应用

Info

Publication number: CN109402159A
Application number: CN201811298168.XA
Authority: CN
Inventors: 刘宏毅; 夏海; 陈捷; 刘健; 邵家华
Original assignee: Qiaochang Biotechnology (shanghai) Co Ltd; Shanghai Jiao Tong University
Current assignee: Qiaochang Biotechnology (shanghai) Co Ltd; Shanghai Jiao Tong University
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明公开了一种转Sm1‑chit42木霉工程菌构建及其应用；本发明采用哈茨木霉菌T.harzianumT30菌株作为载体，选择其具有激活植物抗病性功能的几丁质酶Chit42基因及疏水蛋白Sm1基因，根据结构生物学和生物信息学原理，对融合基因的过表达进行定向分子设计，构建能够表达融合蛋白的Sm1‑Chit42木霉工程菌，将发酵液制成工程蛋白粗提物原粉。本发明的工程蛋白粗提物原粉能有效防治黄瓜白粉病，并对黄瓜植株具有促进生长的作用；苗期喷洒工程蛋白制剂可提高防效。

Description

一种转Sm1-chit42木霉工程菌构建及其应用

技术领域

本发明涉及一种转Sm1-chit42木霉工程菌构建、粗提物的制备方法及其防治黄瓜白粉病等方面的应用。

背景技术

木霉菌是土壤和根际生态系统中普遍存在有益真菌，木霉定植植物根际土壤和根部后可以诱导农作物对侵染性病害和非生物胁迫的抗性，并提高作物对土壤营养吸收和利用能力。另一方面，木霉菌定植植物叶片后，可通过一系列细胞壁降解酶(如、几丁质酶Chit42、Chit33和β-1，3-葡聚糖酶直接降解所接触的病原菌细胞壁，完成重寄生过程；同时，木霉菌也可分泌激发子类蛋白，如几丁质酶、疏水蛋白等诱导植物叶片防御反应的激发子蛋白，诱导宿主植物产生对病原菌侵染的抗性。

目前研究已表明，木霉菌Sm1蛋白(small one protein)是从Trichoderma virens中分离得到的一种低分子量、富含半胱氨酸的疏水性蛋白，属于蛋白类激发子，与Cerato-platanin基因家族有很高的同源性，cDNA全长为417bp，编码138个氨基酸，具有诱导植物免疫抗性的作用。该小蛋白分子对植物和微生物无毒，能诱导棉花、水稻活性氧的释放以及葡聚糖酶、几丁质酶和过氧化物酶等防御反应基因的局部和系统表达。木霉菌可通过Sm1激发子识别植物或真菌细胞壁寡糖，诱导植物的免疫反应。木霉菌几丁质酶(Chitiniase)能够降解植物病原真菌细胞壁的几丁质成分，使其细胞壁变薄，生长和繁殖速度减慢，在重度降解后，病原菌细胞甚至会出现畸形、原生质外泄和死亡的现象。且几丁质酶可诱导植物抗性，参与对植物碳水化合物代谢和植物生长发育的调控。

通过转基因的方法构建转化木霉菌源的单一几丁质酶基因工程菌已有报导，但构建木霉菌源疏水小蛋白Sm1和绿僵菌源几丁质酶chit42基因的双价工程菌，国内外无报导。双价工程菌可使木霉菌诱导植物抗性和降解病原菌的功能最大化，并有潜在抑虫活性。构建这种定向表达的双价工程菌，萃取其高效表达的融合蛋白，制备植物免疫新型蛋白农药，其防病促生功能超出了单一工程蛋白或野生株蛋白的效果。该类蛋白无毒、无害、无污染，将成为未来农业植物保护工程蛋白开发趋势。

发明内容

本发明的目的在于构建双价生防基因(Sm1-chit42)共表达工程菌和工程菌粗提物制备方法，验证了工程菌粗提物诱导防治白粉病功能，具体是提供了一种转Sm1-chit42木霉工程菌构建及其应用。通过构建Sm1-Chit42融合基因表达框，经双酶切法构建过表达载体，并转化木霉菌，获得Sm1-Chi42融合基因过表达工程菌。工程菌的粗提物能够有效防治黄瓜白粉病，并对黄瓜植株具有促进生长的作用。本发明为新型木霉菌工程蛋白农药的开发提供技术支撑。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42，所述融合基因过表达载体是通过融合PCR的方法，将TrpC启动子序列、TrpC终止子序列和Sm1-Chi42基因融合成表达框，并通过双酶切的方法构建而得的。

所述融合基因过表达载体的具体构建方式如下：

以Sm1-F SEQ ID No：4、Sm1-R SEQ ID No：5为引物扩增Sm1(SEQ ID No：3)序列；

以SEQ ID No：7、SEQ ID No：8为引物扩增Chit42(SEQ ID No：6)序列；

以人工合成的方式合成按照Sm1-Linker-Chit42-His Tag(SEQ ID No：3-SEQ IDNo：6-SEQ ID No：9(Linker)-SEQ ID No：10(His Tag))的顺序人工合成SEQ ID No：2；其对应的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；

以PtrpC-F SEQ ID No：12、PtrpC-R SEQ ID No：13为引物扩增PtrpC启动子序列(SEQ ID No：11，pSlient-1)；

以SEQ ID No：15、SEQ ID No：16为引物扩增TtrpC启动子序列(SEQ ID No：14，pSlient-1)；

以SEQ ID No：12、Fragment1-R SEQ ID No：17为引物，以SEQ ID No：2和SEQ IDNo：11为模板扩增融合片段1；

以Fragment2-F SEQ ID No：18、SEQ ID No：16为引物，以SEQ ID No：2和SEQ IDNo：6为模板扩增得片段2；

以SEQ ID No：12、SEQ ID No：16为引物以所述片段1、片段2为模板，融合扩增得过表达框ORF(即Sm1-linker-chit42融合过表达框)；

通过BamHI和KpnI双酶切的方式，将过表达框ORF连接至载体pCAMBIA1300th，获得所述过表达载体。

第二方面，本发明还涉及一种转双价Sm1-chit42木霉工程菌，所述工程菌的构建包括：以哈茨木霉Trichoderma harzianumT30(即，T.harzianumT30)菌株为出发菌株，构建融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42，整合到基因组上，表达获得Sm1-Chit42工程蛋白。本发明的研究发现，通过ATMT方法将pCAMBIA1300th-Sm1-Linker-Chit42-His过表达载体转化至哈茨木霉菌Trichoderma harzianum T30菌株中，通过潮霉素抗性标记及PCR扩增筛选获得木霉阳性转化子，检测发现，Sm1与Chit42编码的蛋白活性高于野生型。由此，利用转基因技术，过表达某些Sm1与Chit42，可为获得高Sm1与Chit42产量的木霉工程菌种提供重要的科学依据。鉴于该类融合基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。

优选的，通过重叠PCR构建Sm1-linker-chit42融合过表达框。

优选的，所述Sm1-linker-chit42融合过表达框采用柔性甘氨酸重复序列作为linker连接Sm1和Chit42。

优选的，采用BamH I和Kpn I双酶切，将所述Sm1-linker-chit42融合过表达框连接到载体pCAMBIA1300th上，转化至大肠杆菌上后筛选获得所述融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42。

优选的，通过ATMT的方法将所述融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42导入哈茨木霉T30菌株中，筛选获得阳性过表达转双价Sm1-chit42木霉工程菌。

优选的，所述Sm1-Chit42工程蛋白大小为54.6Kda。

优选的，所述Sm1-Chit42工程蛋白用于激活植株的防御反应。

第三方面，本发明涉及本发明的转双价Sm1-chit42木霉工程菌在防治植物白粉病和/或植物灰霉病中的用途。

优选的，所述转双价Sm1-chit42木霉工程菌粗提物用于防治植物白粉病和/或植物灰霉病。

优选的，所述粗提物是将所述转双价Sm1-chit42木霉工程菌的发酵液与麦芽糊精混合，匀浆，再喷雾干燥获得的。每毫升所述发酵液中加入麦芽糊精1g。所述均浆是在均质机压强为70～90MPa的条件下进行的。

优选的，所述粗提物的具体制备方法如下：

发酵培养：采用PD培养基28℃发酵培养4-5d；作为一级发酵，再接种产孢液体培养基，利用发酵罐发酵获得生产用发酵液；

混料：500mL发酵液加500g麦芽糊精，放入胶磨机中混合完全后，用均质机在80MPa的条件下进行匀浆；

喷雾干燥：出风温度设置为80℃；进料速度设置为80。

优选的，所述转双价Sm1-chit42木霉工程菌发酵提取得到的Sm1-Chit42工程蛋白为防治植物白粉病和/或植物灰霉病药剂的活性组分。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过重叠PCR技术构建了Sm1-Chit42过表达框(图2)和过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42(图1)，并通过ATMT的方法将过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42转入哈茨木霉T30菌株中，通过潮霉素抗性标记筛选获得转Sm1-Chit42木霉工程菌株(图4、5)。通过胶磨、均质和喷雾干燥的方式获得工程蛋白粗提物。本发明的工程蛋白粗提物原粉能有效防治黄瓜白粉病(图9)，并对黄瓜种子萌发和植株生长具有促进作用(图10、图11)。鉴于该类工程菌及其融合蛋白粗提物的应用价值，有必要通过国家发明专利的形式加以保护。本发明将为新型蛋白农药的研究提供重要的科学依据和技术支撑。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明所用载体示意图：其中，A为扩增启动子PtrpC和终止子TtrpC的载体，B为过表达所用载体；

图2为木霉表达载体构建示意图，该载体中，Sm1-Chit42过表达引导和终止序列分别为TrpC启动子和终止序列，Hyg表示潮霉素抗性基因；

图3为Sm1和Chit42基因克隆结果；Chit42基因序列长度为1991bp，Sm1基因序列长度为417bp；

图4为过表达框连接pCAMBIA1300th载体双酶切验证：图中左侧片段长度较长的条带为载体片段，图中左侧片段长度较短的的条带为基因融合后过表达框片段；

图5为木霉工程菌转化子PCR验证；

图6为木霉工程菌与木霉野生株：其中左侧为哈茨木霉T30，右侧为Sm1-Chit42工程菌；

图7为纯化后Sm1-Chit42蛋白Chit42分子量分别约为54.6KDa；

图8为转Sm1-Chit42木霉工程菌粗提液(A)及粗提物原粉(B)外观图：粗提液在均质机压强为80MPa的条件下获得；粗提物原粉采用喷雾干燥的方式获得；

图9为转Sm1-Chit42木霉工程菌粗提物对黄瓜种子的促生作用示意图；

图10为转Sm1-Chi42木霉工程菌粗提物对黄瓜植株生长的影响示意图；

图11为转Sm1-Chit42木霉工程菌粗提物防治黄瓜盆栽白粉病效果示意图：方式一为先接种白粉病菌，再进行融合基因工程菌粗提物原粉溶液喷施，方式二为先喷施融合基因工程菌粗提物原粉溶液，再接种白粉病病菌；

图12为转Sm1-Chit42木霉工程菌粗提物防治黄瓜灰霉病效果示意。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实验材料：哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是木霉菌属(Trichoderma)的一个种，对多种病原菌具有拮抗作用的生防菌，其分布非常广泛。按照经典分类系统其属于半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丝孢科(Hyphomycetaceae)。本实施例涉及的哈茨木霉菌为T.harzianumT30(该菌株已公开发表在国际杂志“范莉莉傅科鹤余传金陈捷 Thc6 protein，isolated from Trichodermaharzianum，can induce maize defense response against Curvularia lunata.Journalof Basic Microbiology，2015，55，591-600。)。该菌株保存于上海交通大学农业与生物学院农业部都市农业(南方)重点开放实验。

实施例1、Sm1及Chit42基因的克隆

以在PDA上培养7d的木霉菌T.harzianum T30和金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae为总RNA提取的材料。通过天根RNA提取试剂盒及反转录试剂盒对木霉菌总RNA进行抽提和反转录PCR。Chit42及Sm1基因以NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的同源目的基因序列JF345997和XM_014104331.1为依据，利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，克隆Chit42及Sm1基因，引物由生工(上海)生物工程有限公司合成。

SEQ ID No：4 Chit42-F：5′-ATGCCGTCGTTATTTGCTCAGT-3’

SEQ ID No：5 Chit42-R：5′-CTAAGCCATCTGCTTCCTCATAT-3’

SEQ ID No：7 Sm1-F：5′-CGCGGATCCATGCAACTGTCCAACA-3’

SEQ ID No：8 Sm1-R：5′-CCGCTCGAGGAGACCGCAGTTCT-3’

PCR反应总体系25μL，模板1μL，高保真酶Premix Star 12.5μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，加ddH₂O补足至25μL。PCR扩增程序：94℃5min；94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min 30s，共30个循环；72℃延伸10min。

取10μL模板加至100μL大肠杆菌感受态细胞DH5α中，冰浴30min，42℃热激90s，迅速置于冰上2-3min，加入900μL液体LB培养基37℃培养1h，离心后留100μL上清液重悬菌体，涂布于氨苄青霉素终浓度为100μg/mL的LB固体平板上，置于37℃培养箱12h。采用菌液PCR的方法初步筛选阳性克隆，由生工(上海)生物工程有限公司测序验证。

图3为Sm1和Chit42基因克隆结果；可知，Chit42基因序列长度为1991bp，Sm1基因序列长度为417bp。

实施例2、Sm1-Chit42过表达木霉工程菌的构建

融合基因过表达框由五部分构成，启动子和终止子选择trpC启动子和终止子，设计引物，将模板逐次混合。将两个融合基因表达框分为片段1与片段2，以SEQ ID No：12、SEQID No：17为引物，以SEQ ID No：2和SEQ ID No：11为模板扩增融合片段1；以SEQ ID No：18、SEQ ID No：16为引物，以SEQ ID No：2和SEQ ID No：6和扩增得片段2；以SEQ ID No：12、SEQID No：16为引物以所述片段1、片段2为模板，融合扩增得过表达框ORF(即Sm1-linker-chit42融合过表达框)。采用酶切连接方法将该过表达框构建pCAMBIA1300th载体上。

SEQ ID No：12 PtrpC 5’-GGATCCGAATTCATGCCAG-3’

SEQ ID No：16 Fragment1-R 5’-GGTACCAAACCCGGGGCTGGTG-3’

SEQ ID No：17 Fragment2-F 5’-CTTGACACAGCCATAGACAT-3’

SEQ ID No：18 TrpC-R 5’-GCTGCTTCTGGCTTCAA-3’

将5μL阳性质粒加入200μL农杆菌感受态细胞AGL1中，置于冰上30min，液氮速冻2min后，37℃水浴5min，置于冰上2min，加入800μL液体LB，28℃摇床培养6h；菌液离心，加入200μL液体LB培养基重悬菌体，将菌液涂布在LB抗性平板(含终浓度为100μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素)，28℃倒置培养2d。

采用ATMT的方法将Chit42及Sm1融合基因过表达框导入木霉菌基因组中。取1mL农杆菌菌液10000rpm离心2min后，重悬于0.2mL IM液体培养基，并转入含40mL IM液体的三角瓶中，分光光度计测定OD600在0.18-0.24范围内；28℃、250rpm振荡培养5-6h，使OD600达到0.6-0.8。将农杆菌与5mL IM溶液洗下的1×10⁶CFU/mL木霉菌分生孢子等量混匀后，取200μL涂布已加玻璃纸的IM平板，28℃培养24h；将玻璃纸转移到CYA培养基含终浓度为300μg/mL的特美汀和250μg/mL的潮霉素，培养3d后挑选产生的菌落到新的同抗性平板上培养，继代4次后，再进行验证。所获工程菌株如图6所示。

取活化后的木霉菌饼置于100mLPD中28℃，180rpm振荡培养3d，过滤收集菌丝，利用冷冻干燥将其水分抽干。将干菌丝用液氮研磨成粉末状，迅速转入1.5mL离心管中，加入预热的700μL CTAB，65℃水浴1h，每15min摇匀一次。向离心管中加入700μL苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡混匀，4℃，12000rpm离心10min，将上清转移入新离心管，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，振荡混匀，再4℃离心10min取上清。加入等体积预冷的异丙醇，混匀冰浴30min。4℃离心10min，向沉淀中加入300μL TE，再加入3μLRNA酶，37℃水浴1h，加入30μL3MNaAC，600μL预冷的无水乙醇，冰浴中30min，4℃离心10min，70％乙醇洗涤沉淀两次，加入100μLTE溶解沉淀。并采用以下引物对转化子进行验证：

SEQ ID No：4 Chit42-F：5′-ATGCCGTCGTTATTTGCTCAGT-3’

SEQ ID No：5 Chit42-R：5′-CTAAGCCATCTGCTTCCTCATAT-3’

SEQ ID No：7 Sm1-F：5′-CGCGGATCCATGCAACTGTCCAACA-3’

SEQ ID No：8 Sm1-R：5′-CCGCTCGAGGAGACCGCAGTTCT-3’

实施例3、融合蛋白纯化

取液体培养的工程菌菌株，抽滤以去除游离的菌丝，使用0.22μm的滤菌器再次过滤，得到含有胞外蛋的澄清液体。使用超滤离心管保留分子量在3KD以上的物质，在4000g下离心10min，收集滤管中液体，并吸取PBS缓冲液冲洗滤膜四次，以获取残留在滤膜上的蛋白，重复超滤粗提物溶液提高蛋白浓度。工程菌株蛋白具有His标签，使用GE公司的Superdex20010/300GL高表现液柱及AKTA primeplus色谱系统进行FPLC(快速蛋白质液相色谱)，以0.4mL/min 1MTris-HCl(pH6.8)为流动相，对收集到的蛋白进行分析。图6结果说明，本发明成功获得Sm1-Chit42纯化蛋白。

实施例4、工程菌粗提物制备方法

在PDA平板培养基上28℃培养木霉工程菌及野生型菌株，在无菌环境中利用打孔器打取菌饼，接入种子菌液体培养基，作为一级发酵，再转入二级发酵液培养基，获得生产用发酵液。发酵液经均质机处理、分子筛过滤，进口温度180℃，出口温度80℃喷雾干燥获得木霉工程菌粗提物产品，该粗提物主要含蛋白等成分(图7)。该转Sm1-Chit42木霉工程菌粗提液及粗提物原粉外观图如图8所示。

实施例5、工程菌粗提物激活黄瓜抗病性试验

1、对病原菌的抑制作用：利用移液枪从菌种保存管中吸取5μl灰霉菌与尖孢镰刀菌(Fusarum oxysporum)菌液，滴加到凝固的PDA平板培养基上，无菌密封培养皿，28℃倒置培养4d后，利用打孔器在菌落边缘的菌丝上打菌饼，分别接种于PD液体培养基(CK)和含工程菌粗提物溶液的PD液体培养基中，28℃摇床培养7d后观察病原菌生长情况，该试验重复三次。

分别接种拟轮枝镰刀菌(Fusaruim verticilloides)、灰霉菌(Botrytiscinerea)与尖孢镰刀菌(F.oxysporum)于PDA平板，28℃培养3d，在无菌操作下打菌饼。将Sm1-Chit42工程菌粗提物溶液通过0.22μm微孔滤膜，与融化的PDA培养基混合，融化的PDA培养基温度要适宜以免导致发酵液中酶类物质及代谢产物的失活。混合液倒平板，待培养基凝固之后，接种病原菌菌饼，28℃培养箱倒置培养，培养3d后观察病原菌生长情况，该实验重复三次。

2.对黄瓜生长的促进作用：将滤纸剪成适合直径90mm培养皿的圆形，并置于培养皿底部。将10粒黄瓜种子用清水冲洗后，置于滤纸上。称取各种5.0g工程菌粗提物原粉完全溶于8mL清水中，配置浓度为100％Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉溶液母液。分别喷施1.5mL浓度为40％，60％，80％及100％的Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉溶液于各培养皿内，野生型T30粗提物原粉溶液和清水CK作为对照，观察各黄瓜种子萌发情况(图9)。

黄瓜种子处理第6d时，各处理组的所有种子均完全萌发。图10所示为黄瓜种子处理第6d与第8d时的萌发状态。Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉溶液，每隔三天喷施一次，发现Sm1-Chit42工.程.菌粗.提物原粉.对黄.瓜幼.苗具有一定促进生长的作用(图10)。

3、对黄瓜白粉病和灰霉病的防治作用：黄瓜种子用25％次氯酸钠浸泡10min，进行表面消毒，再浸种3h去除种子表明黏性物质后进行催芽播种。待黄瓜长到3叶期后，进行两种接种处理。向叶片喷施Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉溶液，24h后，喷施白粉菌孢子悬液(10⁶CFU/m1)，T30分沁物及分泌蛋白、无菌水对照，重复三次，调查发病后病情指数与相对防效

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高病级值)×100％

相对防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

3.1防治白粉病

先接种白粉病菌，后接种野生株和工程菌粗提物(方式一)：T30菌株粗提物原粉及Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉处理的病情指数，在第7d时分别为78.3、73.3，相对防效达51.6％(图11)；

先接种T30和工程菌粗提物，再接种白粉病病菌(方式二)：T30和工程菌粗提物的白粉病病情指数在第7d时分别为78.3、73.3，相对防效为18.6％

与对照相比，Sm1-Chit42工程菌粗提物原粉和溶液在白粉病发病初期显示出明显的防病效果。接种方式二的防病效果好于方式一(图11)。

3.2防治黄瓜灰霉病

先接种灰霉菌，后接种工程菌：接种后第7dSm1-Chit42工程菌粗提物原粉对灰霉病的相对防效为37％(图12)。

表1黄瓜白粉病病情指数

表2黄瓜白粉病相对防效

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

侨昌生物科技（上海）有限公司

<120> 一种转Sm1-chit42木霉工程菌构建及其应用

<130> DAG37840

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 551

<212> PRT

<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)

<400> 1

Met Gly Leu Ser Ala Ile Pro Thr Leu Ala Leu Pro Thr Ala Ala Val

1 5 10 15

Ser Ala Ala Thr Val Ser Thr Val Gly Thr Ala Thr His Thr Ser Thr

20 25 30

Gly Gly Gly Ile Pro Ala Pro Pro Thr Ile Gly Gly Ala Ala Ala Val

35 40 45

Ala Gly Thr Ala Ser Ala Ser Cys Gly Thr Cys Thr Leu Leu Gly Thr

50 55 60

Ser Gly His Thr Ile Thr Val Leu Ala Val Ala His Ala Ala Ser Gly

65 70 75 80

Pro Ala Ile Ala Leu Ala Ala Met Ala Ala Leu Thr Gly Gly Gly Ala

85 90 95

Val Gly Leu Gly Ala Val Ser Ala Thr Ala Thr Gly Val Pro Val Leu

100 105 110

Ala Cys Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

115 120 125

Pro Ser Leu Pro Ala Gly Ser Leu Ala Ile Ile Ala Thr Leu Gly Ala

130 135 140

Thr Leu Gly Leu Ala Thr Pro Val Ser Ala Pro Ala Thr Val Ile Gly

145 150 155 160

Leu His Ala Gly Gly Thr Val Ala Ala Val Thr Pro Thr Ala Thr Gly

165 170 175

Ile Thr Gly Ala Ala Thr Gly Pro Ala Ala Leu Pro Ala Ser Gly Ile

180 185 190

Ser His Val Leu Thr Ser Pro Leu Ala Leu Ser Ala Ala Gly Thr Val

195 200 205

Thr Ser Gly Ala Ser Thr Ala Ala Ile Ala Leu His Thr Pro Ala Ala

210 215 220

Ser Thr Ala Ala Val Gly Ala Ala Val Thr Gly Cys Val Leu Gly Leu

225 230 235 240

Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala Met Leu Thr Met Leu Ser Ile

245 250 255

Gly Gly Thr Thr Thr Ser Thr Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Thr Ala

260 265 270

Ala Thr Ala Ser Ala Pro Ala Leu Ser Ala Val Thr Ile Met Leu Ala

275 280 285

Thr Gly Pro Ala Gly Ile Ala Val Ala Thr Gly Thr Pro Ala Ala Ala

290 295 300

Val Gly Ala Thr Ala Met Val Leu Leu Leu Gly Ala Val Ala Ala Gly

305 310 315 320

Leu Ala Ala Thr Ala Ala Leu Pro Ala Gly Gly Thr His Pro Gly Leu

325 330 335

Ser Ile Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Ala Thr Ala Leu Leu His Leu

340 345 350

Gly Ala Leu Gly Leu Val Leu Ala Thr Ile Ala Leu Met Ala Thr Ala

355 360 365

Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala Ser Ser Ala His Ala Ala Ala Leu Thr

370 375 380

Ala Ala Pro Gly Ala Leu Ala Ala Thr Pro Pro Ala Thr Ala Ala Ala

385 390 395 400

Val Ala Ala Thr Ile Leu Gly Gly Val Pro Ala Ser Leu Ile Val Leu

405 410 415

Gly Met Pro Ile Thr Gly Leu Ser Pro Gly Leu Thr Ala Gly Ile Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ser Gly Val Gly Ala Gly Ser Thr Gly Ala Gly Ile Thr

435 440 445

Ala Thr Leu Val Leu Pro Leu Ala Gly Val Thr Val Ile Thr Ala Ala

450 455 460

Val Ala Leu Gly Thr Thr Ser Thr Ala Ala Ala Thr Gly Gly Leu Ile

465 470 475 480

Ser Thr Ala Thr Pro Ala Ile Thr Leu Gly Leu Val Thr Thr Leu Leu

485 490 495

Ser Leu Gly Leu Gly Gly Ser Met Pro Thr Gly Ala Ser Ala Ala Ala

500 505 510

Gly Gly Pro Ala Ser Leu Ile Gly Thr Ser Ser Ala Leu Leu Gly Gly

515 520 525

Pro Ala Ala Thr Gly Ala Leu Leu Ala Thr Pro Ala Ser Leu Thr Ala

530 535 540

Ala Met Ala Leu Gly Met Ala

545 550

<210> 2

<211> 1671

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcaactgt ccaacatctt cactctcgct ctcttcactg ccgccgtctc cgcggacact 60

gtctcctacg tcgaaaccag ataccactgg tcgacccagg gccagatccc tcgcttccca 120

tacatcggag gtgctgccgc cgtcgccggc tggaactctg ctagctgcgg aacctgctgg 180

aagctgcaat acagcggcca caccatctac gtcttggctg ttgaccacgc tgcttctggc 240

ttcaacattg cgctcgatgc catgaatgct ctgaccggtg gccaggctgt tcagctgggc 300

cgcgtttctg ctaccgctac tcaggttcct gttaagaact gcggtctcgg ggggagcggg 360

gggagcgggg ggagcggggg gagcccgtcg ttatttgctc agtcactggc aatcatcgcc 420

actctgcagg ccactctcgg tcttgccact cctgtatcag ctcctgatac tgtcatcgga 480

aaacatgccg gtggttacgt caacgccgtc tacttcacca attggggaat atacggtcga 540

aactatcagc cagccgacct tcccgcttct cagatatccc atgttctgta ctcgttcttg 600

aacctttcaa ataacggcac cgtttactct ggagattctt gggctgacat agacaagcac 660

tacccaaatg actcttggaa tgatgtcggt aacaatgtct atggctgtgt caagcaatta 720

tatctcctca agaaagcgaa ccgtaatatg aagacgatgt tgtctattgg agggtggacg 780

tggtcaacga acttcccagc cgcggcctcg acggcagcca ctcgaagcaa ctttgcgaag 840

tcggcggtca ctattatgaa agactggggc tttgatggca ttgacgttga ttgggaatac 900

cctgccgacg atgttcaagc cacaaacatg gttcttcttc ttcaagccgt tcgggatgaa 960

ctcgacgcat acgcggcaaa gtttgctcag ggataccatt ttcagctatc gattgccgct 1020

ccggctggcc ctgccaacta taataagttg caccttggcg acctcggaaa ggtgttggat 1080

tatatcaatt tgatggccta tgacttttcc ggttcatgga gcaactccag cgcacacaac 1140

gcaaatcttt acgccaatcc gggcaacctt aatgccacac cattcaacac ggatgatgct 1200

gtcaatgatt acattaaagg cggtgttccg gccagcaaga tcgttcttgg catgccaatt 1260

tatggtaaat cattccagaa gaccaatgga attggaaagc cattctctgg tgttggcgac 1320

ggcagctggg agaatggaat ctgggattac aaggttcttc ccaaagccgg cgtgacggtt 1380

atatatgatg acgtggcaaa gggttactac agctacgata accgcaccca agaacttatt 1440

tcctatgata cccctgatat taccaaggaa aaggttacct acctcaagag caagggatta 1500

gggggcagca tgttttggga ggcatctgct gaccgtcaag ggcccgactc actcattggg 1560

actagtagca acaaacttgg tggaccggac gccactgaga atctactcaa ctaccctgac 1620

tccaaatatg acaatatgag gaagcagatg gctcaccacc accaccacca c 1671

<210> 3

<211> 351

<212> DNA

<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)

<400> 3

atgcaactgt ccaacatctt cactctcgct ctcttcactg ccgccgtctc cgcggacact 60

gtctcctacg tcgaaaccag ataccactgg tcgacccagg gccagatccc tcgcttccca 120

tacatcggag gtgctgccgc cgtcgccggc tggaactctg ctagctgcgg aacctgctgg 180

aagctgcaat acagcggcca caccatctac gtcttggctg ttgaccacgc tgcttctggc 240

ttcaacattg cgctcgatgc catgaatgct ctgaccggtg gccaggctgt tcagctgggc 300

cgcgtttctg ctaccgctac tcaggttcct gttaagaact gcggtctcat c 351

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcggatcca tgcaactgtc caaca 25

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctcgagg agaccgcagt tct 23

<210> 6

<211> 1269

<212> DNA

<213> 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)

<400> 6

ccgtcgttat ttgctcagtc actggcaatc atcgccactc tgcaggccac tctcggtctt 60

gccactcctg tatcagctcc tgatactgtc atcggaaaac atgccggtgg ttacgtcaac 120

gccgtctact tcaccaattg gggaatatac ggtcgaaact atcagccagc cgaccttccc 180

gcttctcaga tatcccatgt tctgtactcg ttcttgaacc tttcaaataa cggcaccgtt 240

tactctggag attcttgggc tgacatagac aagcactacc caaatgactc ttggaatgat 300

gtcggtaaca atgtctatgg ctgtgtcaag caattatatc tcctcaagaa agcgaaccgt 360

aatatgaaga cgatgttgtc tattggaggg tggacgtggt caacgaactt cccagccgcg 420

gcctcgacgg cagccactcg aagcaacttt gcgaagtcgg cggtcactat tatgaaagac 480

tggggctttg atggcattga cgttgattgg gaataccctg ccgacgatgt tcaagccaca 540

aacatggttc ttcttcttca agccgttcgg gatgaactcg acgcatacgc ggcaaagttt 600

gctcagggat accattttca gctatcgatt gccgctccgg ctggccctgc caactataat 660

aagttgcacc ttggcgacct cggaaaggtg ttggattata tcaatttgat ggcctatgac 720

ttttccggtt catggagcaa ctccagcgca cacaacgcaa atctttacgc caatccgggc 780

aaccttaatg ccacaccatt caacacggat gatgctgtca atgattacat taaaggcggt 840

gttccggcca gcaagatcgt tcttggcatg ccaatttatg gtaaatcatt ccagaagacc 900

aatggaattg gaaagccatt ctctggtgtt ggcgacggca gctgggagaa tggaatctgg 960

gattacaagg ttcttcccaa agccggcgtg acggttatat atgatgacgt ggcaaagggt 1020

tactacagct acgataaccg cacccaagaa cttatttcct atgatacccc tgatattacc 1080

aaggaaaagg ttacctacct caagagcaag ggattagggg gcagcatgtt ttgggaggca 1140

tctgctgacc gtcaagggcc cgactcactc attgggacta gtagcaacaa acttggtgga 1200

ccggacgcca ctgagaatct actcaactac cctgactcca aatatgacaa tatgaggaag 1260

cagatggct 1269

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgccgtcgt tatttgctca gt 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctaagccatc tgcttcctca tat 23

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggggagcg gggggagcgg ggggagcggg gggagc 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggggggagcg gggggagcgg ggggagcggg gggagc 36

<210> 11

<211> 1310

<212> DNA

<213> PtrpC 启动子(pSlient-1)

<400> 11

aattcatgcc agttgttccc agtgatcttc gtttcgaaga tggacactcc caatttgtgc 60

aagttattcg gcctacctgg ctgtggccga ggcgcgttat catgaccgtc gctgttcaaa 120

gataaggcga gaagtttgcg ggctgtcttg acgatatggc ttcgttcaga cagatatagt 180

tcccggagtc gcaggcgtct attcttctcc gaaacaaact cggctgcact gtttccatca 240

ccgggtctgg cgttgaggat gtcagcgaaa ctcggcccgg caagtgacac ccgaaaagta 300

tcgactccgg ctgcccgttt caagctagtg gcttcctcat cagcgagtcg gccaaggaga 360

cgtgaagcag gacgggtttg ccattccaag accgtgatcc gaagcgcgtt gatttcatca 420

atcccagcct tttcgctcaa ccaaagagca tcggctttga tttccttcag gtcatacgag 480

gcttgtgcaa tggtctccgc atggatcgct gctgttctcc tatcaaactc ggattttgtc 540

ttaggggatg gcgtaggaaa gacgctgccg cggttcagaa gcacctcgat gctatcagga 600

tgtgacaaaa acgactcgaa aacccgggat tcatcggtga tgctttcggg atcgcaagcg 660

taaagaaaga ctctcttcca agacctagaa gtatagcaaa atcagcagca gaccatcaat 720

gtatagcgaa tgcgcccata caaaagctga acgtccccgg agaagcactt gtccagggac 780

gggaaatagg cttccggaac gggagccatt ggcagcacag ctatatcatt ctaagtaaac 840

aaatgtaatg agcaagcgga cggagtgctg aaacctccgt atgcctgaag ccgacgaaag 900

cgcgttggat tagaggtcga cagaagatga tattgaagga gcactttttg ggcttggctg 960

gagctagtgg aggtcaacaa tgaatgccta ttttggttta gtcgtccagg cggtgagcac 1020

aaaatttgtg tcgtttgaca agatggttca tttaggcaac tggtcagatc agccccactt 1080

gtagcagtag cggcggcgct cgaagtgtga ctcttattag cagacaggaa cgaggacatt 1140

attatcatct gctgcttggt gcacgataac ttggtgcgtt tgtcaagcaa ggtaagtgaa 1200

cgacccggtc ataccttctt aagttcgccc ttcctccctt tatttcagat tcaatctgac 1260

ttacctattc tacccaagca tcgatcgcgg atccatgcaa ctgtccaaca 1310

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatccgaat tcatgccag 19

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaacctgtc aacgtaccta ggcgcatcga tgcttgggta gaatag 46

<210> 14

<211> 504

<212> DNA

<213> TtrpC 启动子(pSlient-1)

<400> 14

gagcgggggg agcgggggga gcacttaacg ttactgaaat catcaaacag cttgacgaat 60

ctggatataa gatcgttggt gtcgatgtca gctccggagt tgagacaaat ggtgttcagg 120

atctcgataa gatacgttca tttgtccaag cagcaaagag tgccttctag tgatttaata 180

gctccatgtc aacaagaata aaacgcgttt cgggtttacc tcttccagat acagctcatc 240

tgcaatgcat taatgcattg gacctcgcaa ccctagtacg cccttcaggc tccggcgaag 300

cagaagaata gcttagcaga gtctattttc attttcggga gacgagatca agcagatcaa 360

cggtcgtcaa gagacctacg agactgagga atccgctctt ggctccacgc gactatatat 420

ttgtctctaa ttgtactttg acatgctcct cttctttact ctgatagctt gactatgaaa 480

attccgtcac cagcccctgg gttt 504

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagcgggggg agcgggggga gcacttaacg ttactgaaat catcaa 46

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggtaccaaac ccaggggctg gtg 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cttgacacag ccatagacat 20

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctgcttctg gcttcaa 17

Claims

1.一种融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42，其特征在于，所述融合基因过表达载体是通过融合PCR的方法，将TrpC启动子序列、TrpC终止子序列和Sm1-Chi42基因融合成表达框，并通过双酶切的方法构建而得的。

2.一种转双价Sm1-chit42木霉工程菌，其特征在于，所述工程菌的构建包括：以哈茨木霉T.harzianumT30菌株为出发菌株，构建融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42，整合到基因组上，表达获得Sm1-Chit42工程蛋白。

3.如权利要求2所述的转双价Sm1-chit42木霉工程菌，其特征在于，通过重叠PCR构建Sm1-linker-chit42融合过表达框。

4.如权利要求3所述的转双价Sm1-chit42木霉工程菌，其特征在于，所述Sm1-linke r-chit42融合过表达框采用柔性甘氨酸重复序列作为linker连接Sm1和Chit42。

5.如权利要求3所述的转双价Sm1-chit42木霉工程菌，其特征在于，采用BamH I和KpnI双酶切，将所述Sm1-linkker-chit42融合过表达框连接到载体pCAMBIM1300th上，转化至大肠杆菌上后筛选获得所述融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Ch it42。

6.如权利要求2所述的转双价Sm1-chit42木霉工程菌，其特征在于，通过ATMT的方法将所述融合基因过表达载体pCAMBIA1300th-Sm1-linker-Chit42导入哈茨木霉T.harzianumT30菌株中，筛选获得阳性过表达转双价Sm1-chit42木霉工程菌。

7.如权利要求2所述的转双价Sm1-chit42木霉工程菌，其特征在于，所述Sm1-Chit42工程蛋白大小为54.6Kda。

8.如权利要求7所述的转双价Sm1-chit42木霉工程菌，其特征在于，所述Sm1-Chit42工程蛋白用于激活植株的防御反应。

9.一种如权利要求2所述的转双价Sm1-chit42木霉工程菌在防治植物白粉病和/或植物灰霉病中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述转双价Sm1-chit42木霉工程菌发酵提取得到的Sm1-Chit42工程蛋白作为防治植物白粉病和/或植物灰霉病药剂的活性组分。