CN104651264B

CN104651264B - 解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN104651264B
Application number: CN201410811744.1A
Authority: CN
Inventors: 耿伟华; 杨海艳; 安德荣; 谢咸升; 田佳; 安天赐
Original assignee: Baoji Guangren Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shaanxi Guangren Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN104651264A

Abstract

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌及其应用，所涉及的菌的分类命名为：解淀粉芽孢杆(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏编号为CGMCC NO.9847。所涉及的应用为上述解淀粉芽孢杆菌用于生产超敏蛋白的应用。本发明同时还涉及一种超敏蛋白水剂生物农药。本发明利用制备的超敏蛋白水剂，对烟草、西瓜、水稻三种作物做防效及增产效果试验。试验结果均表明，超敏蛋白水剂不仅对植物起促生壮苗作用，而且能有效提高植株抗病能力。

Description

解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及农药技术，具体涉及解淀粉芽孢杆菌发酵生产超敏蛋白的应用及利用超敏蛋白开发的农药。

背景技术

1992年WEI等首次从梨火疫欧文氏病菌(Erwinia amylovora)Ea321hrp基因簇中分离到由hrpN基因编码的蛋白类激发子Harpin_Ea，这种稳定的多肽类化合物命名为超敏蛋白(Harpins)。随后，各国的生物科学工作者又先后从丁香假单胞菌和青枯假单胞菌中分离到类似的富含甘氨酸、对蛋白酶敏感、热稳定的亲水性蛋白分子。这些蛋白均能诱导植物产生过敏性坏死反应，与植物的抗病性有关。

2001年美国Cornell大学和EDEN生物科技公司基于对Harpins的研究，共同开发和成功研制出具有抗病防虫功能的广谱性微生物蛋白农药Messenger。该产品是2001年生物农药中最具代表性的新产品之一，也是当前国际上利用高新技术手段开发生物农药最成功的例子。Harpins既能诱导植物产生过敏性坏死反应，同时也能诱导一系列的防卫反应。例如活性氧的迸发、细胞胞外pH的升高、Ga²⁺的进入和K⁺的排出、细胞胞壁富含羟脯氨酸的自动聚合、蛋白质磷酸化等。如过敏素类蛋白mvN在拟南芥悬浮细胞培养中，刺激K⁺外渗，同时也减少阴离子的产生，这说明Harpins具有调节不同细胞质膜离子通道的能力。

发明内容

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌的分类命名为：Bacillusamyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC NO.9847。本发明的解淀粉芽孢杆菌已于2014年10月27日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌用于生产超敏蛋白的应用。

可选的，上述应用包括将所述解淀粉芽孢杆在添加有异丙基-β-D巯基半乳糖苷的LB液体培养基中发酵培养生产超敏蛋白。

本发明同时提供了一种生物农药，该生物农药为超敏蛋白水剂。

可选的，上述生物农药由以下原料按质量百分比制成：harpins原药10％、表面活性剂2％～3％、抗冻剂1％～3％、稳定剂0.2％～0.4％、防腐剂0.1％～0.5％、pH调整剂0.5％～1.5％，余量为水，原料的重量百分比之和为100％。

可选的，上述表面活性剂选用烷基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚类中的其中一种。

可选的，上述抗冻剂选用乙二醇或丙二醇。

可选的，上述稳定剂选用柠檬酸或对甲苯磺酸。

可选的，上述防腐剂选用山梨酸、山梨酸钾和丙酸钙其中一种。

可选的，上述pH调整剂选用木质素磺酸钠。

本发明的有益效果在于：

本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌能够用于生产超敏蛋白。

本发明的超敏蛋白生产方法与一般生物蛋白质生产方法相比，其优点在于：培养基添加异丙基-β-D巯基半乳糖苷，可诱导细菌内蛋白的产生，增加蛋白提取量；。

目前对Harpins的研究与应用一直局限于病原细菌，而本发明利用生防细菌解淀粉芽孢杆菌制备harpins制剂。将本发明的制剂通过烟草、水稻、西瓜三种农作物进行药效及增产试验。试验结果表明，该制剂不仅能有效地促进植物的自身保护，激活植株自身防卫系统、预防和治疗多种植物病毒、真菌性病害，同时具有促生壮苗、增产效果。本产品安全性能高，无污染，无残留，与生态环境相融合，绿色环保。

将本发明的超敏蛋白水剂用于烟草的药效及增产试验，结果表明不仅可以显著促进烟苗健康旺盛生长，并能有效提高烟草植株的免疫抗病性。

将本发明的超敏蛋白水剂用于西瓜的药效及增产试验，结果表明不仅可以显著促进西瓜植株营养生长，还能有效提高瓜苗的免疫抗病性。

将本发明的超敏蛋白水剂用于水稻的药效及增产试验，结果表明10％有益微生物超敏蛋白水剂相比水稻专用肥，水稻秧苗植株干重、株高、分蘖数、根干重、根长分别增加，并有效提高水稻植株的免疫抗病性。

附图说明

图1为实施例2的harpins聚丙烯酰氨凝胶电泳图(SDS-PAGE)，其中：M：引物；1：沸水浴处理3min；2：沸水浴处理5min；3：沸水浴8min；4：沸水浴10min。

具体实施方式

本发明提供的利用解淀粉芽孢杆菌BCQ-19生产超敏蛋白的方法包括定向培养、液体发酵，取对数生长期的菌液经高速离心收集细胞、超声破碎、去沉淀、沸水浴、浓缩纯化即得harpins。利用超敏蛋白热稳定及水溶性的特点，沸水浴后离心可去除变形蛋白，提高提取蛋白的纯度

实施例1：

本发明解淀粉芽孢杆菌BCQ-19的分离与纯化：

(1)土样采集：

从秦岭深山原始森林土壤中选取多个地点，每个地点取3到15cm处土壤，混合过粗筛，取25g做分离用；

(2)培养基平板制备：

将NA培养基和LB培养基加热融化倒入培养皿内冷却，制成NA培养基和LB培养基平板。所述的NA培养基配方为：葡萄糖10g，琼脂15g，牛肉浸膏3g，酵母膏1g，蛋白胨5g，水1L，pH 6.8～7.0；LB液体培养基配方为：蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，pH 7.0；

(3)细菌的分离：

平板接种分别采用涂抹法和混菌法接种。

涂抹法：分别取上述5个浓度土壤稀释液0.05ml，分别加入已做好的NA、LB平板上，用灭菌的玻璃刮刀将稀释液均匀的涂布开。放入32℃恒温箱中培养，设三个重复。

混菌法：分别取上述5个浓度土壤稀释液1ml，加入培养皿中，将已熔化的45～50℃的NA、LB培养基倒入，轻轻摇转使样品和培养基混合均匀，待培养基凝固后放入培养箱32℃恒温培养，设三个重复；

(4)菌种的纯化：

随时观察并记录菌株的原始培养结果，统一编号。根据细菌的特征及时挑取单个细菌落至LB平板上，采用划线分离的方法纯化。

解淀粉芽孢杆菌BCQ-19的鉴定：

(1)形态特征：在LB培养基上菌落呈圆形，表面有明显光泽，不光滑；边缘不规则，有扩散，表面褶皱；菌落呈乳白色，不透明，浑浊；具有一定的粘附性；所述的LB培养基配方为：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂18g，水1000ml，pH为7.0。

培养前期(5～12h)菌落呈无色透明液滴，有光泽；后期(24h后)呈白色不透明状，较为暗淡。菌体杆状，长约2μm，单生，周生鞭毛，产芽孢。革兰氏染色呈阳性。

(2)生理生化实验：通过对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BCQ-19的生理生化特性试验(如表1所示)并结合该菌株的形态特征，对照《伯杰氏细菌手册》(Buchanan&Gibbons，1984)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行检索，鉴定BCQ-19菌株为芽孢杆菌属。

表1解淀粉芽孢杆菌BCQ-19菌株的生理生化特征

(3)分子生物学鉴定：采用碱裂解法提取细菌基因组，用细菌通用引物(PrimerF27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，PrimerR1492:

5’-TACGGTACCTTGTTACGACT-3’)进行PCR，PCR条件95℃5min，(95℃30s，55℃1min，72℃1.5min)35个循环，72℃10min PCR产物经胶回收纯化与PMD-18T载体连接，送测序公司测16S rRNA序列，其16S rDNA序列如下：

测得的序列在国际核酸数据库NCBI中进行同源序列搜索Blast，比较实验菌株与已知菌株在相应区域序列的相似性；根据同源序列搜索的结果，下载相关菌种的序列，与实验菌株用Clustal X软件进行匹配结果显示，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BCQ-19与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolquefacienssubsp.plantarum FZB42T)进化关系最近，同源性达到99.728％。

综合BCQ-19细菌的形态、培养特征、生理生化测定和16S rRNA同源序列比对分析，初步鉴定解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BCQ-19为解淀粉芽孢杆菌。

实施例2：

该实施例为利用本发明的解淀粉芽孢杆菌BCQ-19用于生产超敏蛋白，具体方法如下：

(1)培养：有益微生物在28～32℃下，200ml LB液体培养基过夜培养，培养基中外加0.5mM异丙基-β-D巯基半乳糖苷；

(2)细胞收集：取对数生长期的有益微生物菌液离心，15000g，10min；

(3)洗涤：用50ml buffer(0～4℃)外加5mM 2-(4-吗啉代)-乙烷磺酸(MES)洗涤步骤(2)离心后的沉淀，洗涤三次，pH5.5；

(4)超声破碎：在与步骤(3)相同的10ml buffer内，外加1mM苯甲基磺酰氟(蛋白酶抑制剂)的溶液中超声处理10min；

(5)离心：15000g，30min离心步骤(4)超声处理后的溶液，离心后弃不溶物；

(6)水浴：将步骤(5)中得到的悬浮液沸水浴10min；

(7)再离心：将步骤(6)中沸水浴后的悬浮液离心，15000g，30min，去除沉淀(变性蛋白)；

(8)浓缩纯化：步骤(7)中离心后的悬浮液经Sephadex G-25浓缩纯化，并用5mMMES buffer(pH5.5)平衡，将获得的harpins原药保存备用；

(9)干燥：利用步骤(8)获得的harpins原药采用高速离心喷雾干燥：离心转子转速：7000～15000r/min；进风温度：100℃～300℃(优选为150℃～200℃)；风量：1000～8000m³/h；物料的进料速度：5kg/h～200kg/h(根据进料的固含量、进风温度和出风温度来调整)、设备负压：100～1000Pa、气锤频率：0.1～1Hz。

依据harpins热稳定及水溶性的特性，图1为harpins提取过程中经不同沸水浴时间处理后得到的结果，其中44KD处条带为harpins，其余为无活性蛋白(杂质)条带。根据图1显示的结果说明随沸水浴时间延长，可有效提高harpins提取纯度。且条带1、2、3、4中的harpins均能诱导烟草叶片产生过敏性坏死反应，说明图中44KD处条带即为目标蛋白——harpins。

实施例3:

该实施例的10％有益微生物超敏蛋白水剂具体配方：

harpins原药10％、烷基酚聚氧乙烯醚类2.5％、丙二醇1.3％、柠檬酸0.3％、山梨酸钾0.4％、木质素磺酸钠1.2％，余量为水，原料的重量百分比之和为100％。该实施例的harpins原药为实施例2制备的产品。

对烟草的具体药效试验如下：

供试作物：烟草，品种烤烟NC89。

本试验设2个处理组:

①烟草普通复合肥+10％有益微生物超敏蛋白水剂；②烟草普通复合肥+与处理①同期喷洒等量清水；对照组CK：空白对照。每一处理3次重复，共9个小区，采用完全随机区组排列。栽培规格为120cm×50cm。试验地施用纯氮75kg/hm²，每个小区种植不少于40株。分别在烟草苗床和生长期，稀释至800倍液叶面喷雾3次。该试验肥料只用作基肥，其他生产措施与当地优质烟生产措施一致。

试验结果表明，10％有益微生物超敏蛋白水剂不仅可以显著促进烟苗健康旺盛生长，并能有效提高烟草植株的免疫抗病性；烟苗旺长期，株高、茎围、烟叶最大叶面积分别增加了12.3％、6.5％、1.7％；现蕾期，株高、茎围、烟叶最大叶面积分别增加了7.5％、9.8％、2.1％；打顶后，株高、茎围、烟叶最大叶面积分别增加了5.3％、8.3％、1.7％。对烟草普通花叶病的防治效果达71.8％，对烟草黄瓜花叶病的防治效果达67.9％。

实施例4：

该实施例的10％有益微生物超敏蛋白水剂具体配方：

harpins原药10％、烷基酚聚氧乙烯醚类2.5％、丙二醇1.3％、柠檬酸0.3％、山梨酸钾0.4％、木质素磺酸钠1.2％，余量为水，原料的重量百分比之和为100％。

对西瓜的具体药效试验如下：

供试作物：西瓜，品种西农8号。

本试验设2个处理:①西瓜普通复合肥+10％有益微生物超敏蛋白水剂；②西瓜普通复合肥+与处理①同期喷洒等量清水；对照组CK：空白对照。每一处理3次重复，共9个小区，采用完全随机区组排列。栽前7d，划分小区，打好垄，施足基肥，每个小区移栽180株西瓜幼苗。各处理均设在地形一致、土壤类型相同的地块进行。全生育期共喷施4次，第一次于西瓜种植后10d叶面喷施，第二次于西瓜伸蔓期喷施，第三次于西瓜开花前喷施，第四次于西瓜膨大期喷施，其他生产措施与当地优质西瓜生产措施一致。

试验结果表明：10％有益微生物超敏蛋白水剂不仅可以显著促进西瓜植株营养生长，还能有效提高瓜苗的免疫抗病性；叶面喷施10％有益微生物超敏蛋白水剂的西瓜植株，其株高在幼苗期、伸蔓期、开花期及膨瓜期分别增高39.8％、59.1％、26.2％、23.6％，茎粗分别增加了28.4％、26.6％、29.6％、33.7％，最后总产量增加44.8％。对西瓜花叶病毒病的防治效果达81.1％，对西瓜蕨叶病毒病的防治效果达83.4％。

实施例5：

该实施例的10％有益微生物超敏蛋白水剂具体配方：

对水稻的具体药效试验如下：

供试作物：水稻，中花10号。

本试验设2个处理:①水稻专用肥+10％有益微生物超敏蛋白水剂；②水稻专用肥+与处理①同期喷洒等量清水；对照组CK：空白对照。每一处理3次重复，共9个小区，采用完全随机区组排列，小区间设有保护行。分别在水稻苗床和生长期，稀释至800倍液叶面喷雾2-3次。该试验肥料只用作基肥，其他生产措施与当地优质水稻生产措施一致。

试验结果表明，在水稻苗期，喷施10％有益微生物超敏蛋白水剂的水稻秧苗长势最佳，其对水稻秧苗株高、分蘖数及根长等农艺性状的影响，相比普通水稻专用肥及空白对照差异显著。10％有益微生物超敏蛋白水剂相比水稻专用肥，水稻秧苗植株干重、株高、分蘖数、根干重、根长分别增加32.1％、16.3％、59.1％、45.4％、24.5％。且喷施该制剂的水稻对纹枯病的防治效果达64.9％，对水稻矮缩病的防治效果达77.6％。

Claims

1.解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌的分类命名为：Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC NO.9847。

2.一种具有促进植物生长、防治病害作用的蛋白的制备方法，其特征在于，方法包括：将权利要求1所述解淀粉芽孢杆在添加有异丙基-β-D巯基半乳糖苷的LB液体培养基中发酵培养，然后依次经细胞收集、超声破碎、离心、沸水浴、再离心和浓缩纯化制得，所述浓缩纯化采用Sephadex G-25浓缩纯化。

3.一种生物农药，其特征在于，该生物农药为蛋白水剂，所述蛋白为权利要求2所述方法制备的蛋白。

4.如权利要求3所述的生物农药，其特征在于，该生物农药由以下原料按质量百分比制成：蛋白10％、表面活性剂2％～3％、抗冻剂1％～3％、稳定剂0.2％～0.4％、防腐剂0.1％～0.5％、pH调整剂0.5％～1.5％，余量为水，原料的重量百分比之和为100％。

5.如权利要求4所述的生物农药，其特征在于，所述表面活性剂选用：烷基酚聚氧乙烯醚类、苯乙基酚聚氧乙烯醚类中的其中一种。

6.如权利要求4所述的生物农药，其特征在于，所述抗冻剂选用：乙二醇或丙二醇。

7.如权利要求4所述的生物农药，其特征在于，所述稳定剂选用：柠檬酸或对甲苯磺酸。

8.如权利要求4所述的生物农药，其特征在于，所述防腐剂选用：山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙其中一种。

9.如权利要求4所述的生物农药，其特征在于，所述pH调整剂选用：木质素磺酸钠。