CN102703355B

CN102703355B - 葡萄球菌lz16株及其应用

Info

Publication number: CN102703355B
Application number: CN 201210189708
Authority: CN
Inventors: 刘柱; 余琴; 孙群; 张维; 朱建清; 林敏�
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Shantou University
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2032-06-08
Also published as: CN102703355A

Abstract

本发明提供了一株葡萄球菌(Staphylococcus sp.)LZ16株，其保藏编号为CGMCC No.6121。该菌具有嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase，PNP)蛋白，对植物病原菌具有抑制作用，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码该抗菌蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的葡萄球菌LZ16株对水稻稻瘟病有明显的抑制作用，将本发明的菌株LZ16制成抗菌剂或生物农药可对水稻的稻瘟病防治产生明显的促进作用，可在农业生产中推广使用，有效提高水稻的生产性能。

Description

葡萄球菌LZ16株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种对水稻稻瘟病有拮抗作用的葡萄球菌LZ16株及其应用。

背景技术

稻瘟病、白叶枯病和纹枯病被列为水稻三大主要病害。稻瘟病是由稻瘟霉(Magnaporthe grisea)引起的水稻真菌性病害，分布范围十分广泛，90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在5700万亩以上，年损失稻谷达数亿公斤。广东稻瘟病年发生面积不少于50万亩，而且出现逐年增加趋势。稻瘟病的发生不但影响产量，而且影响米质，因此对稻瘟菌的研究，受到水稻科研的普遍重视和水稻生产的广泛关注，并取得了可喜的成绩和巨大的进步。由于稻瘟病菌生理小种多变、环境气候复杂、水稻品种抗性丧失等诸多因素影响，稻瘟病至今仍然严重威胁着水稻生产，亟待解决的问题还很多。

当前对水稻稻瘟病的防治主要为化学防治。长期使用化学农药，使污染物在农田土壤中大量残留，理化性质恶化，肥力下降。严重的污染，直接影响农田生态系统的结构和功能，使生物种群结构发生改变，生物多样性减少，农田土壤生产力下降，对国家生态安全构成威胁。同时，化学污染造成有害物质在农作物中积累，并通过食物链进入人体，引发各种疾病危害人体健康。如何既能保证农作物健康生长，又可以不对人畜、农田和生态环境造成新的伤害，是当前研究者普遍关注的问题。

生物防治和化学农药相比，具有选择性强、对人畜安全、对环境污染小等优点。海洋微生物具有产生生物活性物质的巨大潜力，又具有生长周期短、代谢易于调控、菌种较易选育、可通过大规模发酵实现工业化等特点，故开发海洋微生物天然产物来作为生物农药制剂，具有潜在的产业化优势。当前生物农药的研制90％以上是杀虫剂，杀菌剂主要针对小麦条锈病、水稻条纹叶枯病等，对防治稻瘟病的生物源农药创制至今未见报道。迫切需要研制有效针对稻瘟霉的生物农药，为稻瘟病的防治和农田土壤可持续利用，改善农村生产环境提供有力保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对水稻稻瘟病有拮抗作用的葡萄球菌LZ16及其应用。

本发明筛选出一株对水稻稻瘟病有拮抗作用的菌株，通过分子鉴定，确定其为葡萄球菌(Staphylococcus sp.)LZ16。该菌株的发酵液平板对峙实验表明，24h后的培养液对稻瘟菌有很好的抑制作用。用24h发酵液的裂解上清对稻瘟菌的分生孢子萌发进行了研究，发现对孢子萌发、芽管伸长及附着胞形成都有很好的抑制作用。24h发酵液裂解上清在pH4-7、7-45℃情况下较稳定。对葡萄球菌LZ16 24h发酵液裂解上清防治水稻稻瘟病进行了离体叶片实验，确定其对叶瘟的防治有很好的效果。本发明提供的葡萄球菌菌株LZ16于2012年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.6121，分类名为葡萄球菌(Staphylococcus sp.)。

本发明提供了含有葡萄球菌LZ16株的菌剂。

本发明提供了含有葡萄球菌LZ16株的生物制品。

本发明发现葡萄球菌LZ16株产生的具有抗菌活性的嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，PNP)，其氨基酸序列为：

1)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或

2)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID No.3)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将G23替换为A23，将L26替换为A26，将V45替换为A45，将G50替换为A50，将G57替换为A57，将G95替换为A95，将D105替换为A105，将G154替换为A154，将G177替换为A177，将M183替换为A183，将第A140位增加一个A或几个AA，将第A192位增加一个A或几个AA，不影响其活性。因此，本发明的嘌呤核苷磷酸化酶PNP还包括SEQ ID No.3所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与嘌呤核苷磷酸化酶同等活性的由嘌呤核苷磷酸化酶衍生得到的蛋白质。

编码上述嘌呤核苷磷酸化酶PNP的基因，是如下a)或b)：

a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；或

b)由SEQ ID No.2所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码嘌呤核苷磷酸化酶的核苷酸序列。

应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明提供了上述的嘌呤核苷磷酸化酶PNP或PNP编码基因在抑制植物病原菌上的应用。

所述的植物病原菌为稻瘟菌(Magnaporthe grisea)。

进一步，本发明提供了用PCR方法扩增编码PNP基因的引物，其为引物1：5’-CAGTCCATGGGCACAAAAGCAACACCTCATATTC-3’引物2：5’-CCGCTCGAGTTCAGCAATTTCTAATGCTATTTC-3’。

本发明提供一种重组表达载体，其为以含上述基因为目的基因的表达盒。

本发明还提供了含有上述重组表达载体的转化体。

本发明提供葡萄球菌LZ16株或其发酵产物或含有葡萄球菌LZ16株的菌剂或生物制品在抑制植物病原菌上的应用。

所述的植物病原菌为稻瘟菌(Magnaporthe grisea)。

本发明提供葡萄球菌LZ16株或其发酵产物或含有葡萄球菌LZ16株的菌剂或生物制品在促进植物生长上的应用。

本发明提供了葡萄球菌LZ16株在制备生物有机肥中的应用。

本发明提供了以葡萄球菌LZ16株为有效成分的制剂在农业上的应用。

本发明提供的葡萄球菌LZ16株对水稻稻瘟病有明显的抑制作用，将LZ16制成抗菌剂或生物农药可对水稻的稻瘟病防治产生明显的促进作用，可在农业生产中推广使用，有效提高水稻的生产性能。本发明还发现嘌呤核苷磷酸化酶PNP在抑制植物病原菌上具有优异的效果。

附图说明

图1为菌株LZ16在PDA培养基上对稻瘟病菌的对峙试验结果。

图2为粗提物不同处理条件下平板对峙比较，其中NC、阴性对照；A、12h未裂解上清；B、12h裂解上清；C、12h裂解沉淀；D、12h未裂解上清加热；E、12h裂解上清加热；F、12h裂解沉淀加热；G、24h未裂解上清；H、24h裂解上清；I、24h裂解沉淀；J、24h未裂解上清加热；K、24h裂解上清加热；L、24h裂解沉淀加热。

图3为粗提物对稻瘟菌分生孢子萌发的抑制。

图4为水稻离体叶片实验。

图5为菌株LZ16拮抗菌活性物质的热稳定性实验，其中，NC阴性对照；PC阳性对照；图中a-d表示差异显著p＜0.05。

图6为菌株LZ16拮抗菌活性物质的pH稳定性实验，其中，NC阴性对照；PC阳性对照；图中a-f表示差异显著p＜0.05。

图7为菌株LZ1616s rDNA序列的系统进化树。

图8为菌株LZ16中的PNP蛋白的MALDI-TOF-TOF质谱分析图。

图9为PNP表达后抑菌实验，其中，NC阴性对照；PC阳性对照；图中a、b表示差异显著p＜0.05。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1葡萄球菌LZ16株菌株的培养和鉴定

(1)海洋细菌的分离与培养

样品来源：南澳海水、海泥混合物(取自广东省汕头市南澳县深澳镇吴平寨汕头大学南澳临海实验站)。取样品(海水、海泥混合物)(海水20ml，海泥5g)，放入已灭过菌的三角瓶中，加入30ml灭菌人工海水(NaCl 23.4g、MgSO₄12g、KCl 1.5g、CaCl₂2.2g、蒸馏水1000ml)，激烈振荡(200r/min)制成均匀的混悬液，静置，过滤，取滤液，取0.1ml无菌人工海水梯度稀释10^-1-10^-7梯度，分别吸取0.1ml的稀释液涂布于筛选培养基(Zobell 2216E：胰蛋白胨5g、酵母膏1g、高磷酸铁0.1g、琼脂粉20g、人工海水1000ml、pH7.6)平板上，37℃培养12h。待菌落长出后，挑取形态、色泽、大小不同的单菌落于筛选培养基(Zobell 2216E)平板上划线，37℃恒温培养，菌落长出后4℃保存分离到的细菌(共得到289株海洋细菌)。

(2)对水稻稻瘟病有拮抗作用的腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)LZ16单菌落的获得。

①病原真菌稻瘟菌(Magnaporthe grisea)生理小种yc-25(四川农业大学提供)，作为目标致病真菌。

②初筛首先，刮取少量稻瘟菌菌丝接种于PDB培养基(马铃薯液体培养基，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉16g，加蒸馏水定容至1L)中，28℃、150r/min摇床培养24h，获得稻瘟菌液；将分离得到的海洋细菌接种于Zobell 2216E液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养12h，获得细菌菌液。取稻瘟菌液(950μl)+细菌菌液(50μl)于10ml离心管中混合，28℃、150r/min摇床培养60h，看是否有菌丝体产生。

③复筛

将初筛得到的具有拮抗作用的细菌，通过平板对峙进行复筛。平板对峙法：在PDA培养基(马铃薯固体培养基)平板中心首先接种稻瘟菌菌丝块(直径5mm用蓝色枪头倒着打孔)，放置于28℃恒温箱内培养24h后，在平板的4个角点(距中心2.5cm)接种拮抗菌株(直径约5mm的滤纸片沾取拮抗细菌菌悬液)，于28℃恒温箱中培养7d后观察，并测量各拮抗菌株菌落边缘与稻瘟病菌落边缘之间的抑菌距离，筛选出拮抗作用明显且生长较快的菌株。本发明对其中一株对稻瘟病拮抗作用很明显的菌株命名为LZ16，其在PDA培养基上对稻瘟病菌的对峙试验见图1。

(3)细菌总DNA的提取

①取0.5-2ml处于对数生长期菌液，置于1.5ml离心管中，12000r/min离心1min弃上清。

②向收集到的菌体沉淀中加200μl消化缓冲液Ds，用漩涡振荡器剧烈震荡直至菌体彻底悬浮。

③加入20μl蛋白酶K溶液混匀。

④加入220μl裂解缓冲液Ms，漩涡震荡混匀后，65℃温浴10min，溶液变清凉，简短离心以除去管盖内壁的水珠。

⑤加入220μl无水乙醇，上下颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中，12000r/min离心1min，弃滤液。

⑥加入500μl去蛋白液Ps，12000r/min离心1min，弃滤液。

⑦加入500μl漂洗液PE，12000r/min离心1min，弃滤液。

⑧重复步骤⑦

⑨12000r/min离心3min，以彻底除去纯化柱中残留的液体。

⑩将纯化柱置于新的1.5离心管中，向纯化柱中央处悬空加入20-30μl超纯水，室温放置2min，12000r/min离心2min，管底即为高纯度基因组DNA，-20℃保存。

(4)16s rDNA序列扩增

①PCR扩增引物(细菌通用引物)

27F：GGCAGGCCTAACACATGCAAG

1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT

②PCR扩增体系和程序

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃45s，50℃45s，72℃105s，循环30次，72℃10min。

③PCR产物纯化

④PCR纯化产物电泳检测

⑤DNA与PMD19-T载体连接

I：连接体系

II：16℃连接4h，-20℃保存。

⑥重组质粒转化与筛选

用CaCl₂制备感受态E.coli细胞：

I：在新鲜生长的E.coli DH5a平板上挑取但菌落，接种与LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养

II：吸取0.1ml过夜培养的菌液转接到装有100mlLB培养液的三角烧瓶中，37℃震荡培养3h至OD₆₀₀＝0.4左右，4℃，4000r/min离心5min，弃上清；

III：加0.5ml 0.1MCaCl₂溶液重悬，4℃，4000r/min离心10min，弃上清；IV：加0.5ml 0.1MCaCl₂溶液重悬，冰浴15min，4℃，4000r/min离心5min，弃上清；

V：加200μl 0.1MCaCl₂溶液重悬，加15％甘油100μl，-20℃保存。

VI：加质粒DNA1μl，轻轻摇匀，冰上放置30min

VII：42℃，水浴热激90s，立即放入冰上冷却2min

VIII：加800μlLLB液体培养基，37℃震荡培养，温育1h

IX：4000r，离心3min，留200μl重悬菌体，涂布于AMP、IPTG/X-gal平板上，37℃培养

X：挑取白斑(阳性克隆)，提取质粒，测序(深圳华大基因)。

(5)系统发育树构建

从本发明菌株LZ16的纯培养物提取基因组DNA，并以此为模板，以细菌16s rDNA序列通用引物27F和1492R为上下游引物，PCR扩增LZ16的16s rDNA序列，得到了大小约为1430bp的条带。将此条带进行回收纯化后，送交公司进行测序。16s rDNA序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。将得到的测序结果(16s rDNA序列)在EzTaxon数据库中通过Blast进行序列比对，获得与测序菌株序列同源性较高的相关序列(Staphylococcus Saprophyticus sp.AB233327同源性达99％)；再用CLUSAL X1.83软件进行序列比对，然后用MEGA 4.0软件构建系统进化树，如图7。

结果显示此分离的菌株LZ16属于葡萄球菌。该菌株LZ16于2012年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.6121，分类名为葡萄球菌(Staphylococcus sp)。

实施例2葡萄球菌LZ16抗稻瘟菌试验

(1)平板对峙实验

将LZ16菌分别培养12、24h再超声波破碎得到粗提物：未裂解上清，裂解上清，裂解沉淀三种粗提物各10ml分成两份，每份5ml，一份加热一份不加热，然后待PDA培养基冷却至50℃左右分别加入不同粗提物各5ml混匀倒平板。待平板冷却后，在正中央接种稻瘟菌菌丝块(直径5mm用与标准移液器配套使用的1ml规格的枪头倒着打孔)，28℃恒温箱内培养4d，测稻瘟菌菌斑直径(图2)。如图2所示，LZ16菌培养24h时的裂解上清处理下yc-25菌斑直径最小，抑制效果最佳。

(2)分生孢子生长的影响

孢子生长分为三个阶段：孢子的萌发，芽管的生长，附着胞的形成。将24h裂解上清、阴性对照(PBS)、阳性对照(三环唑)各300μl分别与200μl稻瘟菌孢子悬液(孢子浓度约为2.5×10⁵个/ml)混匀点在载玻片上，28℃恒温箱内培养，分别在0h、3h、7h、11h观察孢子萌发、芽管生长、附着胞形成过程。并在同一时间(7h)显微镜观察比较芽管长度(图3)。如图3所示，LZ16菌培养24h时的裂解上清能够抑制稻瘟菌孢子的萌发和附着胞的形成。

(3)水稻离体叶片实验

水稻稻苗第4叶叶片中上部剪成约长2厘米的叶段，每钵5叶，每1处理重复3钵。将供试叶段置于稻瘟菌生理小种yc-25孢子浓度为为2.5×10⁵个/mL的悬浮液中浸泡，表面完全湿润后，再分别喷上LZ16菌培养24h的等量发酵液、裂解上清液、三环唑(阳性对照)、磷酸缓冲液(阴性对照)，最后将叶片放在保绿培养基(供应商：MBCHEM)上。保湿培养8天，进行病级调查(图4)。如图4所示，阴性对照的叶片上出现很多病斑，而裂解上清和阳性对照叶片上病斑很少；说明裂解上清具备与三环唑相似的抑制稻瘟菌感染水稻的作用。

实施例3葡萄球菌LZ16株菌株的抑菌活性物质稳定性试验

(1)热稳定性实验

葡萄球菌LZ16株的24h发酵液裂解上清分别在-20℃、7℃、28℃、37℃、45℃、55℃、65℃、80℃下处理30min。各取300μl分别与200μl稻瘟菌孢子悬液(孢子浓度约为2.5×10⁵个/ml)混匀点在载玻片上，28℃恒温箱内培养7h，显微镜观察比较芽管长度(图5)。

(2)pH稳定性实验

葡萄球菌LZ16株的24h发酵液裂解上清分别在pH2、4、6、7、8、10条件下4℃放置24h。各取300μl分别与200μl稻瘟菌孢子悬液(孢子浓度约为2.5×10⁵个/ml)混匀点在载玻片上，28℃恒温箱内培养7h，显微镜观察比较芽管长度(图6)。

实施例4葡萄球菌LZ16株菌株活性物质的分离纯化和鉴定

24h发酵液裂解上清经过Phenyl-sepharose CL-4B和Sephacryl S-200High resolution层析柱后，通过观察对分生孢子生长的影响选出主要活性组分用于MALDI-TOF-TOF质谱分析，鉴定为嘌呤核苷磷酸化酶。基因核苷酸序列及对应氨基酸序列如序列表2、3所示。MALDI-TOF-TOF质谱分析如图8。

实施例5嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)原核表达及抑菌试验

①设计特异性引物扩增pnp

引物15’-CAGTCCATGGGCACAAAAGCAACACCTCATATTC-3’

引物25’-CCGCTCGAGTTCAGCAATTTCTAATGCTATTTC-3’

I、葡萄球菌LZ16总DNA提取

II、PCR扩增pnp体系和程序

PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃45s，57℃45s，72℃60s，循环30次，72℃10min。

III、纯化

IV、NcoI、XhoI双酶切

V、纯化测浓度

②载体准备

I、质粒pET-28a提取

II、NcoI、XhoI双酶切

II、纯化测浓度

③连接反应：连接体系如下：

连接条件：16℃连接4h，-20℃保存。

④重组质粒转化大肠杆菌BL21并筛选阳性克隆

⑤0.2uM IPTG诱导PNP表达

⑥抑菌实验

观察表达后的PNP对稻瘟菌分生孢子生长的影响。结果如图9所示，NC表示阴性对照(PBS)，PC表示阳性对照(三环唑)，未表达组表示空质粒pET-28a转化大肠杆菌BL21，表达组表示重组质粒转化大肠杆菌BL21并IPTG诱导PNP表达添加鸟嘌呤(G)；由图可以看出，PNP诱导表达组具有明显抑菌作用，与阳性对照无显著性差别。

Claims

1.葡萄球菌（Staphylococcus sp.）LZ16，其保藏编号为CGMCC No.6121。

2.含有权利要求1所述葡萄球菌的菌剂。

3.权利要求1所述的葡萄球菌或其发酵产物在抑制植物病原菌上的应用，所述的植物病原菌为稻瘟菌（Magnaporthe grisea）。

4.权利要求2所述的菌剂在抑制植物病原菌上的应用，所述的植物病原菌为稻瘟菌（ Magnaporthe grisea）。

5.权利要求1所述的葡萄球菌产生的具有抗菌活性的嘌呤核苷磷酸化酶PNP或其编码基因在抑制植物病原菌上的应用，所述的植物病原菌为稻瘟菌（Magnaporthe grisea），所述的嘌呤核苷磷酸化酶PNP的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的序列。