CN101514331B

CN101514331B - 绿针假单胞桔黄亚种Pa40及其应用

Info

Publication number: CN101514331B
Application number: CN2009100762023A
Authority: CN
Inventors: 郭岩彬; 邬娜; 吴文良; 孟凡乔; 赵桂慎
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-01-05
Filing date: 2009-01-05
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2029-01-05
Also published as: CN101514331A

Abstract

本发明提供了绿针假单胞桔黄亚种菌株(Pseudomonas.chlororaphis subsp.Aurantiaca)Pa40，菌种保藏编号为CGMCCNo.2764。该菌株产生与抗菌相关的HCN、蛋白酶和嗜铁素。对测定的大部分植物病原真菌和部分植物病原细菌有平板抑制作用。在平板、温室和田间，以小麦为指示作物检测了生防菌株Pa40对小麦纹枯病菌的防治效果，结果表明Pa40对平板、温室和田间小麦纹枯病的防治效果分别为53.97％、68.10％和72.46％，其中温室和田间对小麦纹枯病的防治效果均高于井冈霉素。

Description

绿针假单胞桔黄亚种Pa40及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，具体涉及一种绿针假单胞桔黄亚种菌株及其在病害生物防治中的应用。

背景技术

小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)又称立枯病、尖眼斑病，是分布范围甚广的世界性病害之一。主要发生在世界各温带小麦区。早在1934年国外即有报道。此病在我国虽早有发生，但危害较轻。自70年代中后期开始，随着小麦品种的更换及丰产栽培措施的推广应用(如早播、灌溉、高肥等)，该病在我国各冬麦区普遍发生，并有逐年加重的趋势。病区由南向北扩展，对小麦的高产稳产构成较大的威胁。尤以江苏、浙江、安徽、山东、河南、陕西、贵州、湖北及四川等省麦区发生普遍且危害严重。一般病田病株率为10％-20％，重病田块病株率可达60％-80％以上，特别严重的田块枯白穗率可高达20％以上。小麦纹枯病发病越早，造成的产量损失越重，轻的减产5％-10％，重的可减产20％-40％，甚至造成枯孕穗、枯白穗，更为严重的可导致颗粒无收。

目前防治小麦纹枯病主要采取的还是“一拌一喷”的化学防治技术。药剂拌种以三唑类药剂为主。药剂拌种的防病效果因田间病情的轻重而有高低，在轻病田和一般病田，防病效果可持续到小麦生长后期，但在发病较重的麦田只持续到3月中下旬或4月上旬，此后病情会激增。目前防治小麦纹枯病药剂主要为井冈霉素和三唑类药剂。化学药剂能有效防治病害，但对小麦产量有不同程度的影响。

目前国内已发现对小麦纹枯病菌具有较强抑制作用的生防菌株有放线菌S024、蜡样芽孢杆菌2011、2012、2013和枯草芽孢杆菌2014等，这些菌株处理种植或植株后均能在植株内定殖，且能促进小麦生长，提高品质及抗逆性。南京农业大学植保系王金生等人经多年研究，筛选出对小麦纹枯病有明显抑制作用的B3菌株(商品名为麦丰宁)，在自然条件下，B3菌粉拌种防效可达60％以上，可促进小麦种子发芽，提高发芽率和出苗率，并增产13.7％。陈延熙等用拮抗真菌和细菌防治小麦纹枯病，田间防效为20％。史建荣等人从小麦植株上分离筛选出Rb2、Rb26等芽孢杆菌，室内抑苗测定及苗期盆栽实验表明它们对小麦纹枯病有一定抑制作用；陈厚德等人通过盆栽和田间试验表明，接种一种滑刃线虫能明显降低小麦纹枯病的发病程度；Innocenti等在温室条件下测定了Trichoderma atroviride、T.harzianum、T.longibrachiatum、Clonostachys rosea和Bacillus subtilis对小麦纹枯病的拮抗效果，发现与对照相比，用Trichiderma属菌株处理种子后长出的麦苗纹枯病的发生明显减少了，Bacillus subtilis对小麦纹枯病也有较好的拮抗作用，但拮抗性稍微弱于Trichiderma属菌株。但将绿针假单胞桔黄亚种用于小麦纹枯病的防治中国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株绿针假单胞桔黄亚种新菌株及其在植物病害生物防治以及促生中的应用。

本发明菌株是从山东省桓台县小麦实验田中分离得到的绿针假单胞桔黄亚种(Pseudomonas.chlororaphis subsp.Aurantiaca)新菌株Pa40。该菌株已于2008年11月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为绿针假单胞桔黄亚种(Pseudomonas.chlororaphis subsp.Aurantiaca)，保藏号为CGMCCNo.2764。

Pa40具体通过如下方法分离得到：从小麦实验田中采集土样，取5g的土溶解到在45ml无菌生理盐水的三角瓶中，28℃，120rpm摇床震荡10min后静止10min，取100μl的上清液加入到装有900μl生理盐水的Eppendorf管中，进行连续梯度稀释。分别取以上土壤悬浮液和10^-2，10^-3，10^-4倍土壤悬浮液稀释液100μl在NA培养基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼脂15g/l)平板上均匀涂板，超净工作台内吹干，每个浓度重复3次，，28℃温箱内培养36h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，以小麦纹枯病菌为靶标菌，利用平板对峙法进行拮抗菌的初步筛选；对获得的拮抗菌进行平板、温室和田间防治小麦纹枯病实验，最终筛选出性状优良的生防菌株绿针假单胞桔黄亚种(Pseudomonas.chlororaphis subsp.Aurantiaca)Pa40CGMCCNo.2764。

综合假单胞菌的形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列、atpD基因序列、recA基因序列和carA基因序列和BIOLOG碳源代谢谱结果，将其鉴定为绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas.chlororaphis subsp.aurantiaca。

生防相关性状检测表明，Pa40能够产生蛋白酶、HCN以及嗜铁素。抑菌实验表明，Pa40对部分病原真菌具有抑制作用，例如对串珠镰刀病菌、小长喙霉病菌、百合根腐病菌、桃褐病菌、番茄早疫病菌、稻瘟病菌、辣椒灰霉病菌、番茄灰霉病菌、棉花枯萎病菌、芹菜斑枯病菌、番茄叶霉病菌等均有平板抑制作用。对部分病原细菌亦具有抑制作用，例如对葡萄根癌病菌、土壤根癌病菌、棉花角斑病菌、茄青枯病菌、丁香假单胞菌、褶皱假单胞菌等均有平板抑制作用。

在平板、温室和田间，以小麦为指示作物检测了生防菌株Pa40对小麦纹枯病菌的防治效果，结果表明Pa40对平板、温室和田间小麦纹枯病的防治效果分别为53.97％、68.10％和72.46％，其中温室和田间对小麦纹枯病的防治效果均高于井冈霉素。

本领域技术人员很容易想到将本发明菌株发酵液或菌悬液作为农药的有效成分用于植物病害的生物防治。

本发明还提供Pa40发酵培养方法，包括菌种活化、种子液培养、发酵罐发酵等步骤，具体包括如下步骤：

1、菌种活化

使用KB培养基，培养基配方为：蛋白胨20g/l，甘油10ml/l，MgSO₄·7H₂O 1.5g/l，K₂HPO₄1.5g/l，琼脂15g/l。将绿针假单胞桔黄亚种接种Pa40接种于KB培养基斜面上，28℃培养48h。

2、种子液的培养

种子培养用NY培养基，NY培养基的组成：葡萄糖5-8g/l，酵母膏5-8g/l，NaCl 2-4g/l，KH₂PO₄0.5-0.8g，MgSO₄·7H₂O 1-1.2g/l，pH值为7.0-7.2。将活化好的将绿针假单胞桔黄亚种Pa40用生理盐水配制成10⁸cfu/ml的菌悬液，以0.1％的接种量接种于NY液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为180-200rpm，培养时间为40-48h。

3、发酵罐发酵

发酵培养基组成为：蔗糖10-12g/l，黄豆粉5-8g/l，(NH₄)₂SO₄8-10g/l，KH₂PO₄1-1.2g，MgSO₄·7H₂O 1-1.2g/l，CaCO₃1-1.5g/l，pH值为7.0-7.5。把培养好的绿针假单胞桔黄亚种Pa40种子液以2％的接种量接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为180rpm，通气量为1∶0.6-0.8(发酵液体积∶每分钟通气量体积)、罐压1.5-2.0F/cm²。发酵48h菌量达到8-10×10⁸cfu/ml，获得绿针假单胞桔黄亚种Pa40发酵液。

本发明绿针假单胞桔黄亚种Pa40除对小麦纹枯病有防治效果外，对串珠镰刀病、甘薯黑斑病、百合根腐病、桃褐病、番茄早疫病、稻瘟病、辣椒灰霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、芹菜斑枯病、番茄叶霉病等由病原真菌引起的病害和对葡萄根癌病、土壤根癌病、棉花角斑病等由病原细菌引起的病害均有潜在的防治效果，具有很高的研究和应用价值。

附图说明

图1显示的是Pa40的16S rDNA、carA、recA和atpD基因PCR扩增产物的凝胶电泳图片，图中1、Marker，2、空白对照；3、以Pa40基因组为模板扩增的16S rDNA(a)、carA(b)、atpD(c)和recA(d)基因。

图2显示的是Pa40对小麦纹枯病温室防治效果，其中，左边植株为无菌水阴性对照，中间为20％井冈霉素可湿性粉剂阳性对照，右为Pa40菌悬液处理。

图3显示的是用脱脂牛奶平板对Pa40产蛋白酶的检测。

图4显示的是对Pa40产HCN酸的检测，图中，左为阴性对照，右为PA40菌株。

图5显示的是对Pa40嗜铁素产生的检测。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 Pa40的鉴定

综合假单胞菌的形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列、atpD基因序列、recA基因序列和carA基因序列和BIOLOG碳源代谢谱结果，将其鉴定为绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas.chlororaphis subsp.aurantiaca。具体鉴定结果如下：

1、菌体形态特征

革兰氏染色阴性，电子显微镜观察，菌体长椭圆形。

2、生理生化特性

绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas.chlororaphis subsp.Aurantiaca Pa40 CGMCCNo.2764生理生化特性如表1所示：革兰氏阴性菌，严格好氧，硝酸盐还原、淀粉水解、七叶灵利用、α半乳糖酶反应阴性，氧化酶、精氨酸双水解、明胶水解、卵磷脂酶、脂肪酶、葡萄糖氧化产酸产气、过氧化氢酶、脲酶、H₂S产生、过敏性坏死反应阳性；可以利用海藻糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-阿拉伯糖等作为唯一碳源，不能利用5-酮基葡糖酸、山梨醇、L-岩藻糖等作为唯一碳源。

表1、绿针假单胞桔黄亚种PA40生理生化特性

+，阳性反应；-，阴性反应；^a，BIOLOG测试结果

3、16S rDNA序列分析

方法是：提取绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca Pa40 CGMCCNo.2764的基因组，用16S扩增通用引物8F：5`CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT3`和1506R：5`CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC3`.在如下PCR体系中扩增：50μl扩增体系，10pmol引物，0.2mMdNTP，1.5mM MgCl₂，2.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，1×PCRbuffer(TaKaRa)，25ng基因组DNA作模板。PCR反应条件为：94℃5min预变性，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后72℃充分延伸5min。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，用OMEGA公司的纯化试剂盒Gel Extraction Kit纯化回收后连接TaKaRa公司的T载体pMD18T。在Invitrogen公司用ABI3730DNA测序仪进行测序，结果如SEQ ID No.1所示。用BLAST程序在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)相应序列比对的结果表明绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiacaPa40的16S rDNA序列与目前发表的绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphis subsp.Aurantiaca其他菌株相比相似性达到98.39％。

4.atpD基因序列、recA基因序列和carA基因序列测定。提取菌株Pa40基因组，atpD基因选用引物为：atpD-f 5`CTGGGCCGSATCATGGACG3`和atpD-d5`GTCCATGCCCAGGATSGCG3`PCR反应体系同16SrDNA中反应体系，PCR反应条件为：94℃5min预变性，94℃变性30s，63℃～55℃touchdown每度2个循环，时间30s；94℃30S，53℃30S，72℃1min，72℃延伸1min，8个循环后72℃充分延伸5min。recA基因和carA基因选用引物分别为：carA-f 5`TTCAACACCGCCATGACCGG 3`和carA-d 5`TGATGRCCSAGGCAGATRCC 3`；recA-f 5`TCSGGYAARACCACSCTGAC3`和recA-d 5`RTACCAGGCRCCGGACTTCT3`；PCR反应体系同16SrDNA中反应体系，反应条件为：94℃5min预变性，94℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸1min，25个循环后72℃充分延伸5min。atpD基因、recA基因和carA基因PCR纯化、连接T载体、转化大肠杆菌DH5a，以及测序比对均与16S rDNA序列测定方法相同。Pa40的atpD基因、carA基因和recA基因序列分别如SEQ ID No.2～4所示。atpD基因、carA基因和recA基因序列在NCBI用BLAST程序比对结果显示，菌株Pa40的atpD、carA和recA三个基因序列与绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca对应的atpD、carA和recA三个基因序列分别有98.97％、99.2％和98.83％的相似性。

综合菌体形态、生理生化特性、Biolog碳源代谢谱和16S rDNA、atpD、carA和recA基因序列，将生防菌株Pa40鉴定为：绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca。

实施例2抑菌谱分析

对病原真菌的平板抑制检测方法。用打空器打取5mm直径的靶标病原真菌接种于PDA平板中央，假单胞与靶标菌成180°接种于靶标病原真菌两测2.5cm处，25℃培养4到6天后测量病原真菌菌落直径。以接种靶标真菌而不接种假单胞的平板为对照。抑制生长率按照如下公式计算：

抑制生长率＝(C-T)/C×100％

C：对照真菌生长直径

T：接种假单胞后真菌生长直径

对病原细菌平板抑制检测方法。用双层培养法检测假单胞对病原细菌的抑制情况。用King`B(蛋白胨20g，甘油10ml，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，pH 7.2.)培养基活化假单胞后用生理盐水配成10⁸cfu/ml的菌悬液，用移液枪吸取5μl接种于King`B平板中央，培养48h后用3ml的氯仿以其蒸汽杀死菌体。将活化好的靶标细菌配成10⁸cfu/ml的菌悬液，吸取50μl菌悬液加入到加入3ml融化后冷却到50℃的水琼脂(0.7％琼脂，pH7.0)中，迅速混匀，立即倒入三氯甲烷杀死Pa40菌体的培养基上，铺成均匀的薄层，28℃培养36小时，观察抑菌圈的情况。

绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca Pa40对部分病原真菌抑制结果如表2所示，其对串珠镰刀病菌、小长喙霉病菌、百合根腐病菌、桃褐病菌、番茄早疫病菌、稻瘟病菌、辣椒灰霉病菌、番茄灰霉病菌、棉花枯萎病菌、芹菜斑枯病菌、番茄叶霉病菌等均有平板抑制作用。

表2.绿针假单胞桔黄亚种Pa40对病原真菌平板抑制

^a；标准差 ^b-，没有抑制作用

绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca Pa40对部分病原细菌抑制结果如表3所示，其对葡萄根癌病菌、土壤根癌病菌、棉花角斑病菌、茄青枯病菌、丁香假单胞菌、褶皱假单胞菌等均有平板抑制作用。

表3.绿针假单胞桔黄亚种Pa40对病原细菌平板抑制

^a标准差

实施例3生防相关性状检测

蛋白酶检测：用脱脂牛奶平板(胰蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g，葡萄糖1g，7％的脱脂牛奶250ml，琼脂15g，用水补足1000ml)检测蛋白酶。把Pa40接种到平板中央，28℃培养72h，菌落周围有透明圈，如图3所示，绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca Pa40 CGMCCNo.2764产生蛋白酶。

HCN检测：HCN检测试纸准备，10mg乙酰乙酸铜(copper(II)ethyl acetoacetate)和10mg 4，4′-甲基双(二甲苯胺)[4，4’-methylenebis-(N，N-dimethylaniline)]溶于4ml的氯仿中，剪切Whatman滤纸条，浸泡于配制好的溶液中，氯仿挥发完全后就制备成了HCN检测试纸。在含有1ml PDA培养基的离心管中穿刺接种假单胞，HCN检测试纸悬于离心管中，28℃培养36h，如图4所示，HCN检测试纸显示蓝色，表明绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca Pa40CGMCCNo.2764产生HCN。

嗜铁素的检测：(CAS培养基(嗜铁素检测用培养基)(Schwyn andNeilands，1987)：由4种溶液组成(溶液1～3及casamimo acid)，4种溶液混合前单独灭菌。

溶液1.CAS/HDTMA溶液

1)CAS溶液：60.5mg CAS(铬天青)溶解在50ml水中

2)铁溶液：1mMFeCl₃·6H₂O溶解于10mM HCl中，pH为2.0

3)HDTMA溶液：72.9mg溴化十六碳烷基三甲氨溶解于40ml水中

把溶液1)与10ml溶液2)混合后加入溶液3)中并搅拌均匀，把得到的蓝黑色液体灭菌，该液体即CAS/HDTMA溶液。

溶液2.Salts/Buffer溶液

1)Salts(750ml)：K₂PO₄0.3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1.0g，

2)Pipes：30.24g，溶解于Salts中，以50％(W/V)KOH调节pH至6.8，加入15.0g琼脂定容至800ml，高压灭菌冷却至50℃。

溶液3(750ml)：

葡萄糖2g，甘露醇2g，MgSO₄·7H₂O 493mg，CaCl₂11mg，H₃BO₃1.4mg，ZnSO₄·7H₂O 1.2mg，MnSO₄·2H₂O 1.17mg，Na₂MoO₄·2H₂O 1mg，CuSO₄40μg；高压灭菌。

溶液3冷却至50℃后加入溶液2与30ml过滤除菌的10％(W/V)casamino acid(酸水解酪素)混合，再加入溶液1，缓慢搅拌(避免产生泡沫)，铺平板。将活化好的Pa40穿刺接种于平板上。28℃培养24、48、60、72h观察菌落周围是否产生黄色晕圈，如有黄色晕圈表示产生嗜铁素。如图5所示，绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca Pa40CGMCCNo.2764能够产生嗜铁素。

实施例四生防菌Pa40温室和田间防治小麦纹枯病效果检测

温室和田间检测生防菌株Pa40对小麦纹枯病的防治效果，具体方法如下：用NA培养基将生防菌株Pa40活化24小时后，用灭菌牙签将已活化的菌株接到制备好的PDA液体培养基中，28℃，160rpm，摇床摇培72小时，将培养好的Pa40生防菌菌悬液用无菌生理盐水稀释到10⁸cfu/ml(OD600＝0.8)备用。将小麦种子用两层纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿。28℃培养箱中培养，隔天用清水浸湿一次。培养48小时左右种子露白，挑选大小均匀饱满且露白一直的小麦种子备用。将小麦纹枯病菌接入玉米砂培养基中，置室温培养，前两天要稍加摇动，使菌丝生长均匀。菌丝长满(10天左右)后取出。将一定量的玉米砂繁殖的病菌与无菌土(草碳、蛭石、砂土、腐殖酸土以体积比1∶1∶1∶1混合)按1∶30的体积比混合均匀，制成菌土。用制备好的菌悬液、20％井冈霉素、无菌生理盐水浸泡催芽好的小麦种子3h后播种于制备好的病土中。温室实验控制条件为温度20～25℃，12h光照12h黑暗交替，小麦出苗20天后调查病情指数和发病率并计算防效。田间实验播种时间为10月15日，出苗40天后调查病情指数和发病率并计算防效。图2显示了Pa40对小麦纹枯病温室防治效果。实验结果表明绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca Pa40CGMCCNo.2764在温室和田间对小麦纹枯病的防治效果分别为68.1％和72.6％，均高于井冈霉素的防治效果。

以上实验表明，绿针假单胞桔黄亚种Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca Pa40CGMCCNo.2764除对小麦纹枯病有防治效果，对串珠镰刀病、甘薯黑斑病、百合根腐病、桃褐病、番茄早疫病、稻瘟病、辣椒灰霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、芹菜斑枯病、番茄叶霉病等由病原真菌引起的病害和对葡萄根癌病、土壤根癌病、棉花角斑病等由病原细菌引起的病害有潜在的防治效果，有很高的研究和应用价值。

序列表说明：

SEQ ID No.1～4分别是Pa40的16S rDNA、carA、recA和atpD基因的核苷酸序列；SEQ ID No.5 6、7&8、9&10以及11&12分别是用于扩增Pa40的16SrDNA、carA、recA和atpD基因的引物对。在引物对中涉及到的R、S和Y是根据保守的序列进行设计的间并引物，R表示嘌呤(A或G)，Y表示嘧啶(T或C)，S表示强健(C或G)。

序列表

<110>中国农业大学

<120>绿针假单胞桔黄亚种Pa40及其应用

<130>KHP08113411.9

<160>12

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1516

<212>DNA

<213>Pseudomonas chlororaphis subsp.Aurantiaca Pa40

<400>1

cgggatccta cggctacctt gttacgactt caccccagtc atgaatcaca ccgtggtaac 60

cgtcctcccg aaggttagac tagctacttc tggtgcaacc cactcccatg gtgtgacggg 120

cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcgacatt ctgattcgcg attactagcg 180

attccgactt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccgg actacgatcg gttttatggg 240

attagctcca cctcgcggct tggcaaccct ctgtaccgac cattgtagca cgtgtgtagc 300

ccaggccgta agggccatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg 360

gcagtctcct tagagtgccc accataacgt gctggtaact aaggacaagg gttgcgctcg 420

ttacgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtc 480

tcaatgctcc cgaaggcacc aatccatctc tggaaagttc attggatgtc aaggcctggt 540

aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 600

caattcattt gagttttaac cttgcggccg tactccccaa gcggtcaact taatgcgtta 660

gctgcgccac taagagctca aggctcccaa cggctagttg acatcgttta cggcgtggac 720

taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc acctcagtgt cagtatcagt 780

ccaggtggtc gccttcgcca ctggtgttcc ttcctatatc tacgcatttc accgctacac 840

aggaaattcc accaccctct accatactct agctcgccag gtttggatgc agttcccagg 900

ttgagcccgg ggatttcaca tccacttaac gaaccaccta cgcgcgcttt acgcccagta 960

attccgatta acgcttgcac cctctgtatt accgcggctg ctggcacaga gttagccggt 1020

gcttattctg tcggtaacgt caaaatactc acgtattagg taagtaccct tcctcccaac 1080

ttaaagtgct ttacaatccg aagaccttct tcacacacgc ggcatggctg gatcaggctt 1140

tcgcccattg tccaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag 1200

ttccagtgtg actgatcatc ctctcagacc agttacggat cgtcgccttg gtgagccatt 1260

acctcaccaa ctagctaatc cgacctaggc tcatctgata gcgcaaggcc cgaaggtccc 1320

ctgctttctc ccgtaggacg tatgcggtat tagcgtccgt ttccggacgt tatcccccac 1380

taccaggcag attcctaggc attactcacc cgtccgccgc tctcaagaga agcaagcttc 1440

tctctaccgc tcgacttgca tgtgttaggc ctgccgccag cgttcgttct gagccaggat 1500

caaactctgg atcccg 1516

<210>2

<211>725

<212>DNA

<213>Pseudomonas chlororaphis subsp.Aurantiaca PA40

<400>2

ttcaacaccg ccatgaccgg ctatcaggaa atccttaccg atccttccta cgcccaacag 60

atcgttaccc tgacttaccc acatatcggc aataccggca ccacgccgga agacgccgag 120

tccgatcgtg tctggtcggc cggtctggtg attcgcgacc tgccactggt tgcgagcaac 180

tggcgtaaca ccttgtccct gtccgactac ctgaaagcca gcaatgttgt ggcgatcgcc 240

ggtatcgaca cccgtcgtct gacgcgcatc ctgcgcgaga aaggcgcgca gaacggctgc 300

atcatggccg gcgacaatat ctccgacgaa gcggcgattg ccgctgcgcg cggcttcccg 360

ggcctgaaag gcatggatct ggcgaaggtc gtcagcacca aggaaagcta cgagtggcgc 420

tccagcgtct ggagcctgaa gaccgacagt cacccgacca tcgaggcttc cgagctgcct 480

taccacgtgg ttgcctacga ctacggcgtc aagctgaaca tcctgcgcat gctggtcgag 540

cgcggttgcc gcgtgaccgt ggtacctgcg caaaccccga ccagcgacgt cctggcgctc 600

aagcctgacg gtgtgttcct gtccaacggt cctggcgacc ccgagccttg cgattacgcc 660

atccaggcga tcaaggacgt gctggaaacc gagattccgg tcttcggcat ctgcctcggt 720

catca 725

<210>3

<211>891

<212>DNA

<213>Pseudomonas chlororaphis subsp.Aurantiaca Pa40

<400>3

ctgggccgga tcatggacgt actgggcaac ccgatcgacg aagctggccc gatcggcgaa 60

gaagagcgtt ggggcattca ccgtcctgcg ccgaccttcg ctgaacaagc tggcggcaac 120

gacctgctgg aaaccggcat caaggttatc gacctggttt gcccgttcgc caagggcggt 180

aaagtcggtc tgttcggtgg tgccggtgtg ggcaaaaccg taaacatgat ggaactgatc 240

cgtaacatcg ccatcgagca cagcggttat tccgtgttcg ccggtgtggg tgagcgtact 300

cgtgagggta acgacttcta ccacgagatg aaggattcca acgttctgga caaagtggca 360

ctggtatacg gccagatgaa cgagccgccg ggaaaccgtc tgcgcgtagc tctgaccggc 420

ctgaccatgg ccgagaagtt ccgtgacgaa ggtaacgacg ttctgctgtt cgtcgacaac 480

atctatcgtt acaccctggc cggtaccgaa gtatccgcac tgctgggccg tatgccttcg 540

gcagtaggtt accagccgac cctggctgaa gagatgggcg ttctgcaaga acgtatcact 600

tcgaccaagc aaggctcgat cacctcgatc caagcggtat acgtgcctgc ggacgacttg 660

accgacccgt cgccagcgac caccttcgcc cacttggacg ccaccgtcgt tctgtcccgt 720

gacatcgctt ccctgggtat ctacccagcg gtagacccac tggactcgac ttcccgtcag 780

ctggacccga acgtgatcgg caacgagcac tacgaaaccg ctcgcggcgt tcagtacgtg 840

ctgcagcgct acaaagagct gaaggacatc atcgcgatcc tgggcatgga c 891

<210>4

<211>666

<212>DNA

<213>Pseudomonas chlororaphis subsp.Aurantiaca Pa40

<400>4

tccggcaaga ccacgctgac cctgtcggtg attgcccagg cacagaagat gggcgccacc 60

tgcgccttcg tcgacgccga gcacgcactg gacccggaat acgccggcaa actgggggtc 120

aacgttgacg acctgctggt ttcccagccg gacaccggcg aacaggcgct ggaaatcacc 180

gacatgctgg tgcgctccaa tgccatcgac gtgatcgtga tcgactccgt ggcggcactg 240

gtgcccaagg ccgagatcga aggcgagatg ggcgacatgc acgtgggcct gcaggcccgc 300

ctgatgtccc aggcgctgcg caagatcacc ggtaacatca agaacgccaa ctgcctggtg 360

atcttcatca accagatccg tatgaaaatc ggcgtgatgt tcggcagccc ggaaaccacc 420

accggtggta acgcgctgaa gttctacgct tcggttcgtc tggacatccg tcgtactggc 480

gcggtgaagg aaggcgacga agtcgtcggt agtgaaaccc gagtcaagat cgtcaagaac 540

aaggtggctc caccgttccg tcaggctgaa ttccagatcc tgtacggcaa gggtatctac 600

ctgaacggcg agatcatcga tctgggcgtg ctgcacggtt tcctcgagaa gtccggtgcc 660

tggtat 666

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgggatccag agtttgatcc tggctcagaa cgaacgct 38

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgggatccta cggctacctt gttacgactt cacccc 36

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ctgggccgsa tcatggacg 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gtccatgccc aggatsgcg 19

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ttcaacaccg ccatgaccgg 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tgatgrccsa ggcagatrcc 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tcsggyaara ccacsctgac 20

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

rtaccaggcr ccggacttct 20

Claims

1.绿针假单胞桔黄亚种(Pseudomonas.chlororaphis subsp.Aurantiaca)Pa40，保藏号为CGMCC No.2764。

2.含有权利要求1所述菌株或其发酵菌液的生物农药。

3.含有权利要求1所述菌株的菌剂。

4.权利要求1所述菌株、权利要求2所述的生物农药或权利要求3所述的菌剂在植物病害生物防治中的应用，所述植物病害为串珠镰刀病、百合根腐病、桃褐病、番茄早疫病、稻瘟病、辣椒灰霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、芹菜斑枯病、番茄叶霉病、葡萄根癌病、土壤根癌病、棉花角斑病或小麦纹枯病。