CN109355219B - 一株假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一株假单胞菌及其应用，所述菌为假单胞菌（Pseudomonas sp.）NP‑1，已于2018年7月25日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO.2018494。NP‑1菌株对桉树焦枯病菌生长抑制上具有显著的效果，是1株具有生防潜力的假单胞菌菌株。对该菌株生防潜力的探究，使其更好地运用于桉树焦枯病的生物防治实践中，为建立友好型生态环境提供科学依据。

Description

一株假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株假单胞菌及其应用。

背景技术

假单胞菌为直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，是无核细菌，以极生鞭毛运动，不形成芽孢，化能有机营养，严格好氧，呼吸代谢，从不发酵。模式属为假单胞菌属。此属有29种。其中至少有3种对动物或人类致病（见假单胞菌感染）。多分布于土壤和水中及各种植物体，有极强分解有机物的能力，可以将多种有机物作为能量来源。

植物病害生物防治主要是指运用对生物有益的微生物和其生产的代谢产物对病害进行预防和治理的技术。实质是利用微生物直接或间接的竞争、抗生以及溶菌的作用，又或者通过微生物产生的激素等物质进行对病菌的抗性，从而达到抑制病原体的效果。内生菌生存的环境与病菌的相似，因此内生真菌与病原菌存在相似的生态位，而其与病原菌竞争有限的养分和活动空间，能很好的抑制病原菌的生长，提高宿主抵抗病害的能力，该技术具有不容易产生抗性、不污染环境、对人和其他生物安全且生防材料容易获取等优点，在有害生物综合防治中发挥着重要的作用。随着化学农药的减施、减用，生物防治将逐步取代传统的化学防治手段，具有较为广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一株假单胞菌及其应用，应用于植物病原菌引起的植物病害的防治。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株假单胞菌，所述菌为假单胞菌（Pseudomonas sp.）NP-1，已于2018年7月25日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2018494，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学 。

所述假单胞菌在制备抑菌剂中的应用。所述菌为焦枯病菌、拟盘多毛孢、核盘菌、桃褐腐病菌、黑孢霉菌、稻瘟病菌、层生镰刀菌和禾谷镰刀菌。

本发明的优点在于：

NP-1菌株对桉树焦枯病菌生长抑制上具有显著的效果，是1株具有生防潜力的假单胞菌菌株。对该菌株生防潜力的探究，使其更好地运用于桉树焦枯病的生物防治实践中，为建立友好型生态环境提供科学依据。

附图说明

图1 NP-1菌株16S rDNA的PCR扩增产物电泳图片。M为Maker D2000。

图2用Maximum Likelihood 方法构建的 NP-1ITS 树。

图3 NP-1与真菌拮抗图，其中A-G分别为焦枯病菌、拟盘多毛孢、核盘菌、黑孢霉菌、禾谷镰刀菌、层生镰刀菌、桃褐腐病菌和稻瘟病菌。

具体实施方式

实施例1

1.NP-1菌株从南平地区桉树叶片上分离筛选获得。

取自福建南平（26°46′N，117°18′E）随机选择健康桉树5株，进行健康桉树叶片采集。采集时将选择的健康桉树叶片剪下，随即放入自封袋带回实验室进行内生细菌分离前期处理。

将采集回的桉树叶片用水冲洗叶片表面，清洗干净的桉树叶片置于干燥的吸水纸上，吸干表面水分，放置4℃保藏。

在超净工作台内进行桉树叶片内生细菌分离。将桉树叶片切成2 cm×2 cm的方形块状。切好的桉树叶片样品按照以下表面消毒方法进行：

先利用75%的酒精对桉树叶片样本消毒10 s，然后用3%的次氯酸钠消毒1 min，再次用75%的酒精毒10 s，最后使用无菌水依次漂洗3次，每次2 min。

漂洗完成后，将叶片样本正反面贴于PDA平板上作为对照，若对照平板长出菌落，则说明样本表面未消毒彻底，反之，则消毒彻底。

待桉树叶片样品消毒完成，将消毒完的桉树叶片样品放在已灭菌的吸水纸上，在超净工作台中风干表面的水分。用已灭菌的剪刀剪掉叶片边缘，余留主体部分剪成4 mm×4mm正方形小块，一个叶片约剪成10个方形小块，将5个小块贴于1个PDA平板表面。

将平板放置在28℃恒温培养箱中培养10 d，1d观察一次，查看是否有新的细菌长出。若发现有新的内生细菌长出，则挑取新的单菌落移至新的PDA平板划线纯化培养，并继续放置于25℃培养。将已获得的细菌菌落进一步的纯化。最后将得到的有抑菌效果并且经过鉴定为假单胞菌的细菌纯培养物装入盛有50%（v/v）的灭菌甘油的2 mL冻存管，-80℃冷冻保存。

2.NP-1 菌株的分子鉴定

对细菌NP-1菌株进行分子生物学方法鉴定，则需要获得其DNA。将保存在-80℃的NP-1菌株活化后，离心收集菌体，利用CTAB法提取细菌基因组总DNA。

采用细菌通用引物27f和1492r扩增NP-1菌株16S rDNA的序列。

引物序列：

PCR扩增反应体系的试剂浓度及用量

PCR扩增程序

NP-1菌株的PCR产物凝胶电泳检测，利用凝胶回收试剂盒回收目标片段。检测结果如图1所示。

菌株的16SrDNA-PCR产物的序列分析

将PCR扩增获得的NP-1菌株16S rDNA约1.2 kb-1.5 kb的扩增片段。对PCR产物测序结果显示NP-1菌株的16S rDNA全序列由1203个碱基构成。通过BLAST（NCBI）比对分析结果显示NP-1菌株的16S rDNA序列（如SEQ ID NO.1所示）与假单胞菌菌株的同源性达到98%。

系统发育树的构建

将NP-1菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST序列分析，结果表明：NP-1菌株与假单胞菌属（Pseudomonas sp.）菌株的16S rDNA相似度最高在Ezbiocloud数据库中下载与NP-1 16S rDNA序列相似度最大的典型菌株，用Maximum Likelihood 方法构建的 NP-116S树（-logL=-6816.11）（图2所示）。重复计算1000 次。

菌株的培养性状

NP-1菌株在PDA培养基上菌落圆形，乳白色，培养3-4d后，菌落颜色慢慢变深，菌株及培养基颜色转变成棕褐色，在King’s A培养基上菌落乳白色，粘稠易挑起，King’s B培养基上，未检测到水溶性荧光色素。在LA培养基上菌落圆形，乳白色，质地粘稠不透明，菌落直径1.5mm。在NA培养基上，菌落乳白色，圆形，直径大小0.8mm，表面光滑，粘稠不透明。培养3d后，培养基颜色逐步变深，呈棕色。

浓缩液获得及对峙试验

将NP-1接种于PDA培养基，在28℃培养箱培养5-7天后用500 ml无菌水浸泡，超声波萃取3次，一次30 min，获得萃取液，55℃减压旋转蒸发到剩余5 mL浓缩液，浓缩液用022μm微孔滤膜过滤后，4℃保存备用。在距离PDA平板中央2.5 cm处接种致病真菌菌块（6 mm），另一端距离平板中心2.5 cm处放置牛津杯，然后向牛津杯中加入200 μL浓缩液，对照组牛津杯加入200 μL无菌水。每个处理组重复三次，设三个对照。28℃恒温培养若干天（根据不同真菌生长时间），观察有无抑菌圈的出现，若有，则测量抑菌圈直径。

NP-1菌株与9种不同供试病原真菌的PDA平板对峙试验，检测NP-1菌株对9种病原真菌的抑制作用，结果显示，每种病原真菌对峙处理都具有明显的抑制效果。当NP-1菌株接菌时间至72h，再接上病原真菌时，其中抑制半径效果最明显的为焦枯病菌，抑制半径能达到56 mm，其次是拟盘多毛孢、核盘菌、桃褐腐病菌、黑孢霉菌、稻瘟病菌、层生镰刀菌和禾谷镰刀菌，抑制半径分别为38、38、36、36、35、31、26 mm。抑菌率效果上，每组对峙试验抑制效果随时间的延长，抑菌率逐步上升，在接菌48-72h期间，抑菌率趋于平缓，保持在一定值。抑菌率最高的菌株为核盘菌，抑菌率能达到86%，其次是稻瘟病菌、焦枯病菌、黑孢霉菌、拟盘多毛孢、禾谷镰刀菌、层生镰刀菌、桃褐腐病菌，抑制率分别为84%、83%、79%、76%、68%、68%、63%。抑制效果见图3。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株假单胞菌及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1645

<212> DNA

<213> NP-1菌株16S rDNA序列

<400> 1

aaaacttcta cgagctcgga tccactagta acggccgcca gtgtgctgga attgccctta 60

gagtttgatc ctggctcaga ttgaacgctg gcggcaggcc taacacatgc aagtcgagcg 120

gatgaagaga gcttgctctc tgattcagcg gcggacgggt gagtaatgcc taggaatctg 180

cctggtagtg ggggacaacg tttcgaaagg aacgctaata ccgcatacgt cctacgggag 240

aaagcagggg accttcgggc cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat tagctagttg 300

gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc cgtaactggt ctgagaggat gatcagtcac 360

actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 420

tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc 480

actttaagtt gggaggaagg gttgtagatt aatactctgc aattttgacg ttaccgacag 540

aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa 600

tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gtggtttgtt aagtcggatg tgaaatcccc 660

cgggctcaac ctgggaactg catccgaaac tggcaagcta gagtatggta gagggtagtg 720

gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg 780

actacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 840

accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tggggtcctt gagactttag 900

tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca 960

aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 1020

aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttccag agatggattg gtgccttcgg 1080

gaacattgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1140

gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa 1200

ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1260

acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa gccgcgaggt 1320

ggagctaatc tcacaaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1380

agtcggaatc gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1440

tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag tctaaccttc 1500

gggaggacgg ttaccacggt gtgattcatg catggggtga agtcgtaaca aggtagccgt 1560

aagggcaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct cgcagccatc atgagggggc 1620

cataattcgc ctttaaaaat aaaat 1645

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (2)

1.一株假单胞菌，其特征在于：所述菌为假单胞菌（Pseudomonas sp.）NP-1，已于2018年7月25日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO.2018494。

2.如权利要求1所述的一株假单胞菌在制备抑菌剂中的应用。

Images