CN105925501B - 一种假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及假单胞菌技术领域，特别涉及一种摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12222。其对水稻稻瘟病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病的病原菌具有抑菌效果。

Description

一种假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及假单胞菌(Pseudomonas)技术领域，特别涉及一种摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。
背景技术
真菌病害严重危及全球粮食安全，植物病害中有70％-80％是病原真菌的侵染所导致。水稻稻瘟病(Magnaporthe oryzae)在全球85个国家中的爆发，造成了10％-35％的粮食损失，甚至一些真菌类病害还导致了严重的动植物死亡和灭绝。化学防治是目前防治真菌病害最有效的措施，我国每年化学农药的使用量为50-60万吨，对环境和生态带来了严重的污染和危害，在一些国家和地区化学杀菌剂已经被限制使用。而生物防治因其见效快、杀菌谱广、环境友好和不易产生抗性等特点，具有广阔的应用前景。
用于生物防治的微生物种类主要有细菌、真菌、放线菌和病毒。然而，近年来，随着生防细菌的发掘和研究，寻找新的具有病原真菌拮抗作用的细菌难度越来越大，但是筛选新的具有病原真菌拮抗作用的细菌仍然具有重要的科学价值的实用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足之处，结合我国的种植资源，从云南丽江中分离得到了众多细菌菌株，并对这些细菌的16S rDNA进行测序分析，以确定这些细菌种属分类关系。并利用其对病原真菌拮抗能力等进行检测分析，旨在获得高效广谱的生防菌，以期为植物真菌病害的防治提供材料。
因此，本发明提供了一种假单胞菌(Pseudomonas)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12222。具体地该假单胞菌(Pseudomonas)为摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。
一种如本发明的假单胞菌CGMCC No.12222的应用。
在一个具体实施方式中，所述假单胞菌用于防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述假单胞菌用于保护植物；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种对本发明的假单胞菌CGMCC No.12222进行遗传改良后得到的工程菌。其中，由于该工程菌是以本发明的假单胞菌CGMCC No.12222为靶标，而且采取的手段一般是向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，该工程菌仍然为假单胞菌，特别是应为摩氏假单胞菌。另外，该工程菌可以为提高了对上述病害活性的工程菌。还可以为兼具其他病虫害活性以及获得了其他特性的工程菌株。
一种如本发明的工程菌的应用。
在一个具体实施方式中，所述工程菌用于防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述工程菌用于保护植物；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种包含如本发明的假单胞菌的组合物。其中的假单胞菌可以包括本发明的野生菌株CGMCC No.12222，也可以包括对本发明的野生菌株CGMCC No.12222进行遗传改良后得到的工程菌。所述组合物可以为固态形式，也可以为液态形式。所述组合物还可以包含与本发明的假单胞菌具有增效作用的其他物质，所述其他物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述组合物进一步可以包括与本发明的假单胞菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等。
一种如本发明的组合物的应用。
一种如本发明所述的组合物在防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一种中的应用。
一种如本发明所述的组合物在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
一种包含如本发明的假单胞菌的农药制剂。其中的假单胞菌可以包括本发明的野生菌株CGMCC No.12222，也可以包括对本发明的野生菌株CGMCC No.12222进行遗传改良后得到的工程菌。所述农药制剂可以为固态形式，也可以为液态形式。所述农药制剂还可以包含与本发明的假单胞菌具有增效作用的其他物质，该物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述农药制剂进一步可以包括与本发明的假单胞菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等。
一种如本发明的农药制剂的应用。
一种如本发明所述的农药制剂在防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一种中的应用。
一种如本发明所述的农药制剂在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。
在本发明中，术语“保护”的意思是通过预防和/或治疗靶标生物产生的病虫害等，从而使靶标生物免于或减轻遭受所述病虫害的为害。例如通过使用所述假单胞菌预防和/或治疗水稻的稻瘟病。
附图说明
图1为假单胞菌BS011对峙培养法抑制水稻稻瘟病的效果图。其中，A为空白对照，B为BS011的抑菌实验。
图2为假单胞菌BS011对峙培养法抑制水稻恶苗病的效果图。其中，A为空白对照，B为BS011的抑菌实验。
图3为假单胞菌BS011的16S rDNA构建的系统发育树。
具体实施方式
以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。
本发明筛选的一株假单胞菌被定名为BS011，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12222，保藏日期为2016年3月17日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。
病原菌：5种供试病原真菌水稻稻瘟病(Magnaporthe oryzae)、水稻恶苗病(Fusarium moniliforme)、水稻纹枯病(Rhizoctonia solani Kühn)、水稻立枯病(Fusarium graminearum Schw.)和水稻稻曲病(Ustilaginoidea oryzae)由本实验室保藏。
KB固体培养基配方：蛋白胨20g，K2HPO4 15g，甘油10g，MgSO4 15g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.2。常规灭菌后使用。
PDA固体培养基配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水1000毫升，自然pH。常规灭菌后使用。
相对抑菌率(％)＝(对照菌落半径－处理菌落半径)/对照菌落半
实施例1
1、土壤样品的采集
从云南丽江涛源山区随机采取土样。去除表面土壤，采集5-20cm深处的土样约300g，分装标记后带回实验室。
2、菌株的分离
采用土壤稀释法分离，称取10g土壤倒入装有玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，此为10-1的稀释液，振荡10min后，吸取1ml至新的装有90ml无菌水的三角瓶中，振荡混匀，此为10-2的稀释液，按此方法继续稀释成10-4，10-5，10-6的稀释液。吸取10-4、10-5和10-6稀释液100μl加入到KB固体培养基平板上，每个梯度3次重复，涂布均匀，倒置于28℃培养箱中培养24h，然后将典型菌落在KB培养基平板上划线纯化2-3次后得到单菌落。将纯化后的单一菌株接种KB培养基斜面上，4℃保存，供生测试验使用。最后获得的其中一株菌定名为BS011。
3、菌株BS011的抑菌谱
1)采用平板对峙法，将水稻稻瘟病菌在PDA固体培养基上活化后，用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的假单胞菌菌株(划线长度3cm)，接三个平板作为重复，同时以不接假单胞菌而只接稻瘟病菌的平板为对照。28℃进行对峙培养，分别在第5天和第7天后观察并记录，抑菌情况见图1。
第五天测量受BS011拮抗生长的稻瘟病菌的生长半径分别为0.72cm，0.65cm和0.7cm，对照稻瘟病菌的生长半径为2.7cm，2.7cm和2.75cm，三次重复取平均值后根据上述相对抑菌率(％)公式计算得到BS011对稻瘟病菌的相对抑菌率为74.8％。
2)采用平板对峙法，将水稻恶苗病菌在固体PDA培养基上活化后，同样用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的菌株BS011(划线长度3cm)，接三个平板作为重复，同时以不接假单胞菌而只接指示菌的平板为对照。28℃进行对峙培养，5天后观察并记录，抑菌情况见图2。
测量受BS011拮抗生长的稻瘟病菌的生长半径分别为1.65cm，1.64cm和1.65cm，对照稻瘟病菌的生长半径为3.0cm，2.95cm和3.0cm，三次重复取平均值后根据上述相对抑菌率(％)公式计算得到BS014对稻瘟病菌的相对抑菌率为45.2％。
3)采用平板对峙法，将水稻纹枯病菌在固体PDA培养基上活化后，同样用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的菌株BS011(划线长度3cm)，接三个平板作为重复，同时以不接假单胞菌而只接指示菌的平板为对照。28℃进行对峙培养，5天后观察并记录。结果表明本发明细菌菌株BS011对水稻纹枯病菌具有一定抑菌效果。
4)采用平板对峙法，将水稻立枯病菌在固体PDA培养基上活化后，同样用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的菌株BS011(划线长度3cm)，接三个平板作为重复，同时以不接假单胞菌而只接指示菌的平板为对照。28℃进行对峙培养，5天后观察并记录。结果表明本发明细菌菌株BS011对水稻立枯病菌具有一定抑菌效果。
5)采用平板对峙法，将水稻稻曲病菌在固体PDA培养基上活化后，同样用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。取其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到新的PDA培养基中央，在离指示菌等距离(2.5cm)处划线接入纯化后的菌株BS011(划线长度3cm)，接三个平板作为重复，同时以不接假单胞菌而只接指示菌的平板为对照。28℃进行对峙培养，5天后观察并记录。结果表明本发明细菌菌株BS011对水稻稻曲病菌具有一定抑菌效果。
4.菌株BS011的16S rDNA测序及序列分析
参照分子克隆中提取革兰氏阴性细菌的所述方法提取BS011基因组DNA。用细菌16S rDNA通用引物：27F：5’－agagtttgatcctggctcag-3’(如SEQ ID No.1所示)和1492R：5’-cggttaccttgttacgactt-3’(如SEQ ID No.2所示)扩增BS011的16S rDNA序列。50μl的反应体系包括：10×PCR缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)4μl，27F(20μm)1μl，1492R(20μm)1μl，TaqDNA聚合酶(5IU)0.25μl，DNA模板(50ng/μl)1μl，ddH2O补充至50μl。PCR扩增条件：94度3min预变性，94度45sec，58度45sec，72度90sec，共30个循环，72度10min终延伸。得到的1.4kb左右多片段，经试剂盒纯化进行TA克隆，转化大肠杆菌得到的克隆子，经过菌液PCR验证正确后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，所得序列为1408bp(如SEQ ID No.3所示)。所测序列提交EzBioCloud网站进行同源性比较，采用MEGA6.0构建系统发育树(图3)。根据图3的系统发育树可知，本发明的BS011的系统分类为摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。

Claims (7)

1.一种摩氏假单胞菌(Pseudomonas mosselii)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12222。
2.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的摩氏假单胞菌。
3.一种农药制剂，所述农药制剂包含如权利要求1所述的摩氏假单胞菌。
4.如权利要求1所述的摩氏假单胞菌、如权利要求2所述的组合物以及如权利要求3所述的农药制剂中的一种在用于防治水稻稻瘟病、水稻恶苗病、水稻纹枯病、水稻立枯病和水稻稻曲病中的至少一种的应用。
5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述摩氏假单胞菌用于保护植物。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述植物为农作物。
7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述农作物为水稻。
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