CN114410484A - 一种黑附球菌、微生物菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种黑附球菌、微生物菌剂及其制备方法与应用。所述黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.40003。所述菌株对禾谷镰刀菌、灰霉菌、炭疽病菌、灰霉菌、核盘菌等多种病原菌具有优异的抑制作用，具有良好的应用前景。

Description

一种黑附球菌、微生物菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本申请涉及一种黑附球菌、微生物菌剂及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。

背景技术

在植物内生真菌中，附球菌属、青霉属和木霉属的真菌能够增强寄主对生物和非生物胁迫的耐受性。其中，有研究表明，附球菌属能够通过产生抗生素拮抗多种植物病原体的生长。其中，黑附球菌是比较有研究价值的，由于其产生的次生代谢产物含有抗真菌物质，能够对多种植物病害表现出生物防治活性。从中分离出的抗氧化剂和抗生素对多种真菌如炭疽菌、灰霉菌等具有拮抗活性。

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是小麦生产中最常见、危害最严重的真菌病害之一，以引起毁灭性的穗部感染和粮食产量降低而闻名。它是一种典型的土壤真菌病原体，在连续谷类种植期间不断加重。此外，禾谷镰刀菌还会产生真菌毒素，如B型毛孢烯、脱氧雪腐镰杆菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)，对农业生产和人类健康构成威胁。杀菌剂的过量使用造成了严重的环境污染和菌株耐药性问题，禾谷镰刀菌引起的病害问题亟需一种绿色环保的解决方法。在农业生产中，植物内生菌黑附球菌对禾谷镰刀菌的防控应用还未见公开。因此黑附球菌菌株资源发掘及其菌剂开发是一种创新应用。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1，所述黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1已于2021年12月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏，保藏编号为CGMCC No.40003。所述黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1对禾谷镰刀菌、灰霉菌、炭疽病菌、灰霉菌、核盘菌等多种病原菌具有优异的抑制作用，具有良好的应用前景。

一种黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1，所述黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.40003。

根据本申请的另一个方面，提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括黑附球菌的孢子；和

惰性固体材料和/或溶剂；

所述黑附球菌选自上述所述的黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1。

可选地，所述微生物菌剂的形态选自固体、液体中的任一种。

可选地，所述微生物菌剂包括黑附球菌的孢子和惰性固体材料。

所述微生物菌剂的形态为固体，剂型选自可湿性粉剂、颗粒剂中的任一种。

可选地，所述惰性固体材料包括硅藻土、高岭土中的至少一种。

可选地，所述微生物菌剂包括黑附球菌的孢子和溶剂；

所述微生物菌剂的形态为液体；

所述微生物菌剂的孢子浓度为10⁶～10⁸孢子/ml。

可选地，所述溶剂为水。

根据本申请的另一个方面，提供上述所述微生物菌剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

在培养基上培养黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1，得到黑附球菌(Epicoccumnigrum)38L1的孢子，将所述孢子和惰性固体材料和/或溶剂混合，得到所述微生物菌剂。

可选地，所述培养基选自马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

可选地，所述培养的条件包括：

培养温度为20～28℃，培养时间为5～15天。

可选地，培养温度为20、23、25、28℃中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

可选地，培养时间为5、7、8、10、12、14、15天中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。

根据本申请的另一个方面，提供上述所述的黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1、上述所述的微生物菌剂、根据上述所述的制备方法得到的微生物菌剂在防治植物病害中的应用；

所述植物病害的病原菌选自禾谷镰刀菌、灰霉菌、炭疽病菌、灰霉菌、核盘菌中的至少一种。

可选地，所述植物病害包括由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。

作为一种实施方案，本申请提供了一株植物内生真菌黑附球菌、微生物菌剂及其应用。该发明公开的黑附球菌菌株38L1分离自北京市种植的玉米叶片，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间2021年12月07日，保藏登记号为CGMCCNo.40003。经菌株活化、产孢培养、干燥制备可制得菌剂。通过施用该菌剂能够有效防控禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。该菌剂生物活性高、环境相容性好、无毒无污染，使用方便。

可选地，所述黑附球菌菌株38L1对禾谷镰刀菌、灰霉菌、炭疽菌和核盘菌等病原真菌具有抑制生长的作用。

可选地，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.40003的黑附球菌的孢子浓度为10⁶～10⁸孢子/ml。

可选地，所述的微生物菌剂为粉剂或液体液。

作为一种实施方案，提供上述微生物菌剂的应用：对镰刀菌的生长、繁殖具有抑制作用。

可选地，将菌剂施用于小麦后，由禾谷镰刀菌侵染引发的小麦赤霉病症状减轻，该菌剂具有防治小麦赤霉病的作用。

作为一种实施方案，提供一种新的防治小麦赤霉病的黑附球菌菌株及菌剂。

另一方面，本公开提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述的菌体为保藏编号为CGMCC No.40003的黑附球菌。

可选地，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.40003的黑附球菌的孢子浓度为10⁶～10⁸孢子/ml。

可选地，所述微生物菌剂为粉剂或液体剂。

再一方面，本公开提供了上述黑附球菌CGMCC No.40003或微生物菌剂在抑制禾谷镰刀菌等真菌生长中的应用。

在一方面，本公开提供了上述黑附球菌CGMCC No.40003或微生物菌剂在防治小麦赤霉病中的应用。

可选地，所述小麦赤霉病为禾谷镰刀菌侵染引发的小麦病害。

通过上述技术方案，本公开提供了一种黑附球菌，该黑附球菌的保藏编号为CGMCCNo.40003，该菌株可抑制禾谷镰刀菌等真菌生长，菌剂可用来防治禾谷镰刀菌引发的小麦赤霉病。

生物材料保藏信息

本申请公开的黑附球菌保藏编号为CGMCC No.40003，保藏日期为2021年12月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。分类命名为黑附球菌(Epicoccum nigrum)。

本申请通过挖掘内生菌资源，筛选具有对多种植物病原真菌有抑制作用的菌株，明确施用方法，开发菌剂，达到对小麦等真菌病害绿色防治的目的，减少化学农药的使用量，保护农田生态环境。

本申请能产生的有益效果包括：

(1)本申请所提供的菌株黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1对禾谷镰刀菌、灰霉菌、炭疽病菌、灰霉菌、核盘菌等多种病原菌具有优异的抑制作用，具有良好的应用前景。

(2)本申请所提供的菌剂，可以有效预防或减轻由禾谷镰刀菌侵染引发的小麦赤霉病。

保藏说明

菌株名称：黑附球菌

拉丁名：Epicoccum nigrum

菌株编号：38L1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年12月07日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.40003

附图说明

图1是从玉米分离的内生菌菌株38L1的表型和遗传发育关系。图1A为38L1在PDA培养基培养五天后的正面(Topview)和反面(Bottomview)生长表型；图1B为38L1的遗传发育树。

图2是黑附球菌38L1对禾谷镰刀菌等病原真菌的抑制作用。图2A为对禾谷镰刀菌菌株PH-1的抑制作用；图2B为对灰霉菌菌株P-1的抑制作用；图2C为对炭疽病菌菌株Y-3的抑制作用；图2D为对灰霉菌菌株F-2的抑制作用；图2E为对核盘菌菌株D-4的抑制作用。

图3是黑附球菌38L1菌剂防治禾谷镰刀菌引发的小麦赤霉病。其中图3A为将该菌剂与禾谷镰刀菌孢子共接种，图3B和图3C分别为前6小时和12小时分别施用38L1的菌剂-38L1(C)后，在麦穗上接种禾谷镰刀菌孢子(S)，保持25℃、80％湿度10天后，拍照统计麦穗的发病率。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

其中，

PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：土豆200g切成小块放入锅中，加水1000ml,在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤,滤渣弃取。加入葡萄糖20g，琼脂15～20g，滤液补充水分到1000ml。而后放入高温高压灭菌锅中灭菌，灭菌程序为121℃，15min。

PDB培养液：土豆200g切成小块放入锅中,加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。加入葡萄糖20g，滤液补充水分到1000ml。而后放入高温高压灭菌锅中灭菌，灭菌程序为121℃，15min。

本申请分子鉴定所用的引物序列如表1所示。

表1 本申请分子鉴定所用的引物序列

实施例1：

菌株的分离方法如下：

在中国北京玉米产区采集到的玉米植株叶片。首先进行表面消毒，将样品在70％的酒精中浸泡1分钟，然后转移到2％的次氯酸钠中浸泡2分钟，最后在70％的酒精中浸泡30秒。该处理之后，用无菌蒸馏水清洗三次，放于无菌滤纸上进一步干燥。将样品剪成小片段(约5mm)，放于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)的培养基表面，培养基中添加氨苄青霉素(50μg/ml)，以抑制细菌在PDA培养基中的生长。取表面消毒的最后一步所洗脱的水100μl同样加于PDA培养基表面，以评估表面灭菌的效率。将所有培养基置于25℃黑暗的培养箱中培养。待菌丝长出后，取菌落尖端的菌丝，转移到不含抗生素的新PDA平板上进行初步纯化培养。对菌落进行3次传代，获得纯培养，命名为菌株38L1。将培养菌株保存在4℃的PDA斜面上，并同时放置于25％甘油中进行-80℃低温保存，以供进一步使用。

实施例2：

菌株38L1的形态鉴定和分子生物学鉴定，具体如下：

①38L1形态鉴定

将保存的38L1在PDA培养基中活化培养，培养条件为25℃黑暗培养5天。之后在活化培养菌落边缘用打孔器打取5mm直径菌饼，置于新鲜配置的PDA培养基，同样的培养条件培养5天。观察拍照菌落的正面和反面(如图1A所示)。

②DNA提取及PCR扩增

菌株在PDA培养基培养7天后，用DNeasy Plant Mini kit(青岛科生物科技有限公司)提取基因组DNA。用NanoDrop光谱仪测定所提取DNA浓度。PCR特异扩增内转录间隔子(ITS)、大亚基(LSU)和β-微管蛋白(TUB)基因。特异性PCR反应总体积为25μl，包含1μl DNA模板，每个引物1μl,2×Taq Mix(全式金，北京，中国)12.5μl和9.5μl ddH₂O。反应条件如下:94℃变性5分钟，之后35周期为94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸1分钟，最后一个72℃延伸10分钟。使用含0.01％(v/v)GoldView核酸染色的1％琼脂糖凝胶(w/v)对PCR产物分离纯化，在120V，400A下电泳30分钟。扩增条带在紫外灯下使用凝胶成像系统(BioRad,Chemi Doc,MP)进行观察。单一条带送往北京青岛生物技术有限公司纯化测序，内转录间隔子(ITS)的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；大亚基(LSU)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；β-微管蛋白(TUB)基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

②内生真菌38L1株的系统发育评价

根据测序结果和NCBI比对结果，选择附球菌相关的菌株构建系统发育树，将ITS、LSU、TUB的序列依次串联，采用基于Tamura 3-参数模型的最大似然方法进行多位点连接比对，1000次重复的bootstrap分析来估计进化距离，系统发育关系表明，如图1B所示，菌株38L1与黑附球菌的几个菌株归为一枝，表明38L1归属为黑附球菌菌株。

实施例3：

通过平板对峙测定菌株38L1对禾谷镰刀菌等真菌的抑制作用，具体如下：

从活化培养5天的病原真菌菌落边缘打取直径5毫米的菌饼接种在PDA平板的中心。将进行同样活化处理的38L1菌落边缘打取直径5毫米的菌饼接种于靠近平板边缘的两侧，接种38L1菌饼与植物病原真菌菌饼处于一条直线上。所有培养皿放置于25℃培养箱中黑暗培养7天。实验进行3次，每个处理进行3个重复。通过观察统计病原真菌生长的情况，判断内生菌对其的抑制作用。如图2所示，在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，内生真菌38L1菌剂对包括禾谷镰刀菌在内的5种病原菌都有强烈的抑制作用，其中图2A为对禾谷镰刀菌菌株PH-1的抑制作用，抑制率为65％；图2B为对灰霉菌菌株P-1的抑制作用，抑制率为45％；图2C为对炭疽病菌菌株Y-3的抑制作用，抑制率为87％；图2D为对灰霉菌菌株F-2的抑制作用，抑制率为53％；图2E为对核盘菌菌株D-4的抑制作用，抑制率为78％。综上所述，38L1对病原真菌的抑制率最高可达87％。

其中，禾谷镰刀菌菌株PH-1：该菌株已在文献(Wang S,Kondo H,Liu L,Guo L,QiuD.A novel virus in the family Hypoviridae from the plant pathogenic fungusFusarium graminearum.Virus Res.2013 Jun；174(1-2):69-77.doi:10.1016/j.virusres.2013.03.002.Epub 2013 Mar 14.PMID:23499998.)中公开，公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例4：

菌株38L1菌剂的制备，具体如下：

菌株38L1在PDA培养基25℃生长14天后，滴入含0.01％吐温20的灭菌水，在菌落表面用刮匙轻轻的刮拭。然后将含孢子的混合液体用灭菌滤布过滤，以去除培养基和菌块等杂质。分离得到的液体移入离心管中，以10,000×g的离心力离心5分钟，得到孢子沉淀。用灭菌水将孢子沉淀重悬，得到浓缩孢子液。之后用血球计数板计量孢子浓度，将孢子浓度调制使用浓度(10⁷孢子/ml)保存。

上述获得的孢子液可以直接作为微生物菌剂使用。

也可以将上述获得的孢子液通过包括离心、冷冻干燥等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。

也可以使用硅藻土、高岭土等惰性固体材料对上述所获得的孢子液进行吸附、结合，通过干燥，形成可湿性粉剂或颗粒剂。

实施例5：

菌株38L1菌剂(即实施例4中制备得到的孢子液)防治小麦赤霉病侵染的作用测定，其中的38L1菌剂的样品编号为(C),禾谷镰刀菌菌株PH-1(1×10⁷孢子/mL)样品编号为(S)，具体如下：

第一种处理：菌株38L1菌剂和禾谷镰刀菌菌株PH-1(1×10⁷孢子/mL)孢子按照1:1比例混合注射小穗(混合液注射量为20μl/小穗)。第二种处理：在麦穗上喷施菌株38L1菌剂(1×10⁷孢子/mL)，0.6L/m²，6小时后，注射接种禾谷镰刀菌菌株PH-1(1×10⁷孢子/mL)孢子液(注射量为10μl/小穗)。第三种处理：在麦穗上喷施菌株38L1菌剂(1×10⁷孢子/mL)，0.6L/m²，12小时后，注射接种禾谷镰刀菌菌株PH-1(1×10⁷孢子/mL)孢子液(注射量为10μl/小穗)。每组共接种15个麦穗，每个麦穗接种1个小穗，接种后的麦穗分别套上塑料袋，25℃、80％相对湿度，光照16h/黑暗8h。接种后10天，观察统计发病的小穗数，重复试验2次。上述处理中，分别采用培养液(PDB)作为菌株38L1菌剂的对照，相同的处理流程和时间进行对照。如图3所示，对照组的小穗发生大面积的枯黄，实验组的麦穗发生枯黄的小穗很少，说明对照组小麦镰刀菌侵染了整个麦穗，导致麦穗枯黄干瘪，38L1菌剂处理的实验组，麦穗整体继续保持正常的绿色，说明小麦镰刀菌的侵染被抑制在接种点，没有发生扩展，麦穗生长良好。因此，实验表明，菌株38L1菌剂防治禾谷镰刀菌引发的小麦赤霉病。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种黑附球菌、微生物菌剂及其制备方法与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 521

<212> DNA

<213> Epicoccum nigrum

<400> 1

attggagact ccgggtctgc tacctcttac ccatgtcttt tgagtacctt cgtttcctcg 60

gcgggtccgc ccgccgattg gacaacattc aaaccctttg cagttgcaat cagcgtctga 120

aaaaacataa tagttacaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa 180

cgcagcgaaa tgcgataagt agtgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga 240

acgcacattg cgccccttgg tattccatgg ggcatgcctg ttcgagcgtc atttgtacct 300

tcaagctctg cttggtgttg ggtgtttgtc tcgcctctgc gtgagactcg ccttaaacaa 360

ttggcagccg gcgtattgat ttcggagcgc agtacatctc gcgctttgca ctcataacga 420

cgacgtccaa aagtacattt ttacactctt gacctcggat cagggaggga tacccgctga 480

acttaagcat atcataaagc cggaggaaag tttaaagtaa a 521

<210> 2

<211> 899

<212> DNA

<213> Epicoccum nigrum

<400> 2

gcggaggacg atccacaggg attgccctag taacggcgag tgaagcggca acagctcaaa 60

tttgaaatct ggcgtctttg gcgtccgagt tgtaatttgc agagggcgct ttggcattgg 120

cagcggtcca agttccttgg aacaggacgt cacagagggt gagaatcccg tacgtggtcg 180

ctagccttta ccgtgtaaag ccccttcgac gagtcgagtt gtttgggaat gcagctctaa 240

atgggaggta aatttcttct aaagctaaat actggccaga gaccgatagc gcacaagtag 300

agtgatcgaa agatgaaaag cactttggaa agagagttaa aaagcacgtg aaattgttga 360

aagggaagcg cttgcagcca gacttgcctg tagttgctca tccgggtttt tacccggtgc 420

actcttctac gggcaggcca gcatcagttt gggcggttgg ataaaggtct ctgtcatgta 480

cctcctctcg gggagatctt ataggggaga cgacatgcaa ccagcctgga ctgaggtccg 540

cgcatctgct aggatgctgg cgtaatggct gtaagcggcc cgtcttgaaa cacggaccaa 600

ggagtctaac atctatgcga gtgtttgggt gtcaagcccg aacgcgtaat gaaagtgaac 660

ggaggtggga acctttcggg gtgcaccatc gaccgatcct gatgtcttcg gatggatttg 720

agtaagagca tagctgttgg gacccgaaag atggtgaact atgcttgaat agggtgaagc 780

cagaggaaac tctggtggag gctcgcagcg gttctgacgt gcaaatcgat cgtcaaattt 840

gggcataggg gcgaaagact aatcgaacta tctaatagct ggttcctggc caagtttcc 899

<210> 3

<211> 345

<212> DNA

<213> Epicoccum nigrum

<400> 3

gataatgcag tacctctgga cggcagctca caaaaaaaca gggtaaccaa atcggtgctg 60

ccttctggca gaccatctcc ggcgagcatg gcctcgacgg ctccggtgtc tacaacggca 120

cctcggacct ccagctcgag cgcatgaacg tctacttcaa cgaggtacta gaaacgacat 180

gctttcctaa cacgggctgc gagtgctgac ctttcacagg cctctggcaa caagttcgtt 240

ccccgtgccg tcctcgtcga tttggagccc ggtacaatgg acgccgtccg cgccggtccc 300

ttcggccagc tcttccgtcc cgacaacttt gtcttcgccc agtcc 345

Claims (10)

1.一种黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1，其特征在于，所述黑附球菌(Epicoccumnigrum)38L1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.40003。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括黑附球菌的孢子；和

惰性固体材料和/或溶剂；

所述黑附球菌选自权利要求1所述的黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的形态选自固体、液体中的任一种。

4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括黑附球菌的孢子和惰性固体材料；

所述微生物菌剂的形态为固体，剂型选自可湿性粉剂、颗粒剂中的任一种；

优选地，所述惰性固体材料包括硅藻土、高岭土中的至少一种。

5.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括黑附球菌的孢子和溶剂；

所述微生物菌剂的形态为液体；

所述微生物菌剂的孢子浓度为10⁶～10⁸孢子/ml；

优选地，所述溶剂为水。

6.权利要求2～5任一项所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

在培养基上培养黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1，得到黑附球菌(Epicoccumnigrum)38L1的孢子，将所述孢子和惰性固体材料和/或溶剂混合，得到所述微生物菌剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养基选自马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养的条件包括：

培养温度为20～28℃，培养时间为5～15天。

9.权利要求1所述的黑附球菌(Epicoccum nigrum)38L1、权利要求2～5任一项所述的微生物菌剂、根据权利要求6～7任一项所述的制备方法得到的微生物菌剂在防治植物病害中的应用；

所述植物病害的病原菌选自禾谷镰刀菌、灰霉菌、炭疽病菌、灰霉菌、核盘菌中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物病害包括由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。

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