CN112522127B - 一株枯草芽孢杆菌、菌剂、菌液提取物及制备方法和应用 - Google Patents
一株枯草芽孢杆菌、菌剂、菌液提取物及制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZD01，保藏编号为：CGMCC No.19555。本发明的枯草芽孢杆菌ZD01能有效抑制马铃薯早疫病菌的菌丝生长，并导致菌丝生长畸形，适宜条件下能抑制马铃薯早疫病孢子的萌发以发挥抑菌作用。枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对马铃薯黑痣病菌、梨黑斑病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、苹果斑点落叶病菌和马铃薯疮痂病菌也具有良好的抑菌效果；枯草芽孢杆菌ZD01菌液的脂肽粗提物对于小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌的的抑菌效果较好。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害防治技术领域，尤其涉及一株枯草芽孢杆菌、菌剂、菌液提取物及制备方法和应用。
背景技术
马铃薯在我国居民膳食结构中占据重要位置，是继玉米、水稻、小麦之后的主要粮食作物。随着马铃薯种植效益的逐步提高、种植面积不断扩大，加之倒茬困难，使得连作障碍等问题日益严重，马铃薯病害也随之加重，其中以被认为是仅次于马铃薯晚疫病第二大真菌病害的马铃薯早疫病问题尤为突出。
目前国内外对马铃薯早疫病的防治主要通过化学防治，但长期或过量使用导致病原菌抗药性增强、农药残留和生态环境污染等问题日益严重，因此亟须寻找环境友好型生物防治的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌、菌剂及制备方法和应用，本发明的枯草芽孢杆菌能够有效抑制马铃薯早疫病菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ZD01，保藏编号为：CGMCCNo.19555。
本发明提供了一种包括上述方案所述枯草芽孢杆菌的菌剂。
优选的，所述菌剂中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1×108～1×1010cfu/mL。
本发明提供了一种上述方案所述枯草芽孢杆菌的菌液脂肽粗提物。
优选的，所述菌液脂肽粗提物包括表面活性素和丰原素。
本发明提供了上述方案所述菌液脂肽粗提物的制备方法，包括以下步骤:
1)对枯草芽孢杆菌ZD01的菌液进行离心，收集上清液，调节所述上清液的pH值至2.0后，4℃静置9～16h，离心，收集沉淀；
2)用甲醇溶解所述沉淀，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得到脂肽粗提物。
本发明提供了上述方案所述的枯草芽孢杆菌或者所述菌剂或者所述菌液脂肽粗提物在广谱抑制植物致病菌中的应用。
优选的，所述植物致病菌包括马铃薯早疫病菌、马铃薯黑痣病菌、梨黑斑病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、苹果斑点落叶病菌和马铃薯疮痂病菌中的一种或几种。
优选的，所述枯草芽孢杆菌、菌剂或脂肽粗提物通过抑制植物致病菌菌丝生长和/或抑制植物致病菌孢子的萌发来防治马铃薯早疫病菌。
本发明的有益效果：本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZD01，保藏编号为：CGMCC No.19555。本发明的枯草芽孢杆菌ZD01能有效抑制马铃薯早疫病菌的菌丝生长，并导致菌丝生长畸形，适宜条件下能抑制马铃薯早疫病孢子的萌发以发挥抑菌作用。枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对马铃薯黑痣病菌、梨黑斑病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、苹果斑点落叶病菌和马铃薯疮痂病菌也具有良好的抑菌效果；枯草芽孢杆菌ZD01菌液的脂肽粗提物对于小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌的的抑菌效果较好。枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌的抑菌率分别55.32％、59.32％，现有技术的木霉菌T-115D(高丽辉.木霉菌T-115D 的发酵液对茄链格孢菌的抑制作用及防病效果研究[D].黑龙江八一农垦大学，2010.)的发酵液对小麦赤霉病菌、小麦赤霉病菌抑菌率仅为51.0％、 45.9％，枯草芽孢杆菌ZD01抑菌效果明显优于木霉菌T-115D。
生物保藏说明
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZD01，于2020年04月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.19555。
附图说明
图1为不同浓度发酵液对早疫病菌拮抗结果图示；
图2为不同浓度菌株ZD01脂肽粗提物对早疫病菌拮抗试验结果图示；
图3为枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对不同植物病原菌的抑菌活性测定结果；
图4为枯草芽孢杆菌ZD01的脂肽粗提物对不同植物病原菌抑菌效果图；
图5为枯草芽孢杆菌ZD01的发酵液和脂肽粗提物对马铃薯早疫病菌菌丝形态影响的扫描电镜图示；
图6为枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对马铃薯早疫病菌孢孢子萌发的影响情况；
图7为对照组马铃薯早疫病菌孢孢子萌发情况；
图8为不同处理叶片中马铃薯早疫病菌的拷贝数；
图9为马铃薯叶片接种早疫病菌后与菌株ZD01拮抗的病斑面积；
图10为不同处理叶片的实物图；
图11为高效液相色谱法对脂肽纯品surfactins的测定结果；
图12为高效液相色谱法对脂肽纯品fengycins的测定结果；
图13为高效液相色谱法(HPLC)对枯草芽孢杆菌ZD01的脂肽粗提物的纯化鉴定结果；
图14为表面活性素及丰原素纯品对马铃薯早疫病菌抑菌活性测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ZD01，保藏编号为：CGMCCNo.19555。
本发明提供了一种包括上述方案所述枯草芽孢杆菌的菌剂；所述菌剂中枯草芽孢杆菌的有效活菌数优选为1×108～1×1010cfu/mL。
本发明中，所述菌剂优选的采用以下制备方法得到：将枯草芽孢杆菌 ZD01单菌落接种于20mLLB培养基进行培养，得到菌剂；所述培养的温度优选为37℃，时间优选为24h；所述培养的方式优选为震荡培养，所述震荡的转速优选为200rmp。
本发明提供了一种上述方案所述枯草芽孢杆菌的菌液的脂肽粗提物；所述菌液脂肽粗提物优选的包括表面活性素和丰原素。
本发明提供了上述方案所述菌液脂肽粗提物的制备方法，包括以下步骤:
1)对枯草芽孢杆菌ZD01的菌液进行离心，收集上清液，调节所述上清液的pH值至2.0后，4℃静置9～16h，离心，收集沉淀；
2)用甲醇溶解所述沉淀，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得到脂肽粗提物。
本发明首先对枯草芽孢杆菌ZD01的菌液进行离心，收集上清液，调节所述上清液的pH值至2.0后，4℃静置9～16h，离心，收集沉淀；所述菌液优选的采用以下制备方法得到：将枯草芽孢杆菌ZD01单菌落接种于20mL LB培养基进行培养，得到菌液；所述培养的温度优选为37℃，时间优选为 24h；所述培养的方式优选为震荡培养，所述震荡的转速优选为200rmp。
本发明中，所述离心的温度优选为4℃，转速优选为8000rmp，时间优选为15～25min，更优选为20min；所述静置的时间优选为12h。
得到沉淀后，本发明用甲醇溶解所述沉淀，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，得到脂肽粗提物。
本发明提供了上述方案所述的枯草芽孢杆菌或者所述菌剂或者所述菌液脂肽粗提物在广谱抑制植物致病菌中的应用；所述植物致病菌优选的包括马铃薯早疫病菌、马铃薯黑痣病菌、梨黑斑病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、苹果斑点落叶病菌和马铃薯疮痂病菌中的一种或几种；所述枯草芽孢杆菌、菌剂或脂肽粗提物优选的通过抑制植物致病菌菌丝生长和/或抑制植物致病菌孢子的萌发来防治马铃薯早疫病菌。
本发明中，所述菌剂对马铃薯黑痣病菌、梨黑斑病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、苹果斑点落叶病菌和马铃薯疮痂病菌具有良好的抑菌效果；所述菌液脂肽粗提物对于小麦赤霉病菌和番茄灰霉病菌的的抑菌效果较好。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1不同浓度枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对马铃薯早疫病菌的影响
1.材料
1.1供试菌种
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZD01、马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)均由河北农业大学马铃薯病害研究实验室保存并提供。
1.2供试培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g·L-1、酵母粉5g·L-1、氯化钠10g·L-1pH 7.0-7.2。
LBA培养基：胰蛋白胨10g·L-1、酵母粉5g·L-1、氯化钠10g·L-1、琼脂20g·L-1。
PDA培养基：马铃薯200g·L-1、葡萄糖20g·L-1、琼脂20g·L-1。
燕麦培养基：燕麦30g·L-1、琼脂15g·L-1。
番茄培养基：125g·L-1、琼脂15g·L-1、pH 7.0。
2.方法
2.1发酵液的制备
取-80℃冰箱保存的ZD01菌种，于LBA培养基划线，37℃静置培养24h，挑取单菌落接种于含有20mL LB液体培养基三角瓶中，37℃、200rmp振荡培养24h，即得发酵种子液。
2.2不同浓度的发酵液抑菌活性测定
采用平板对峙法，将ZD01发酵液进行梯度稀释，稀释倍数分别为1×100、 1×10-2、1×10-4、1×10-6。分别接种马铃薯早疫病菌和5μL发酵液于距中心 1.25cm处。以点接等量的无菌水为对照，5皿/处理，重复2次。于25℃培养7d左右，测量抑菌带宽，计算抑菌率。
3.枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对早疫病菌的抑菌活性测定结果参见表1和图1(发酵液浓度对早疫病拮抗结果图示)，其中a:稀释倍数1×10-6；b.稀释倍数1×10-4；c.稀释倍数1×10-2；d.稀释倍数1×100；e：对照。将菌液发酵后所得种子液稀释后采用平板对执法进行抑菌活性测定，以筛选出的PDA培养基作为基础培养基。随着浓度升高，发酵液对马铃薯早疫病菌的抑制作用增加。当发酵液稀释倍数为1×10-2、1×10-4和1×10-6时，抑菌带宽度均在8mm以上；当发酵液为原浓度时，抑菌带最大，为 10.3mm。
表1不同浓度发酵液对早疫病菌的抑制作用
实施例2不同浓度枯草芽孢杆菌ZD01脂肽粗提物对马铃薯早疫病菌的影响
1.脂肽的提取
1)发酵种子液的制备：取-80℃冰箱保存的ZD01菌种，于LBA培养基划线，37℃静置培养24h，挑取单菌落接种于含有100mL LB液体培养基三角瓶中37℃、200rmp振荡培养72h，得到发酵种子液。
2)脂肽类化合物的提取:脂肽类粗提物的提取采用酸沉淀，将ZD01菌株发酵过程中得到的发酵液于4℃8000rmp离心20min，收集上清液，在上清液中缓慢加入6mol/L的HCl调pH至2.0，4℃过夜；然后4℃，8000rmp 离心20min，收集沉淀，将沉淀物置于通风处中干燥后加入30ml甲醇沉淀物充分溶解。用0.22μm的细菌过滤器过滤甲醇提取液得到脂肽粗提物。
2.不同浓度脂肽粗提物对早疫病菌抑菌活性测定
采用平板对峙法，将脂肽类化合物配制为10mg/mL、5mg/mL、1mg/mL、 0.5mg/mL、0.1mg/mL五个浓度。接种马铃薯早疫病菌饼于培养基中央，距中心2.5cm处用5mm打孔器打孔，两侧分别加入不同浓度50μL无菌甲醇提取滤液和50μL无菌甲醇，25℃培养7d，测量抑菌带宽。
3.不同浓度菌株ZD01的脂肽粗提物对马铃薯早疫病菌的影响结果分析结果参见表2和图2(不同浓度菌株ZD01的脂肽粗提物对早疫拮抗试验结果图示)，其中a:脂肽浓度0.1mg/mL；b:脂肽浓度0.5mg/mL；c:脂肽浓度 1mg/mL；d:脂肽浓度5mg/mL；e:脂肽浓度10mg/mL；f:对照。随着脂肽浓度增大，脂肽对早疫病菌的抑制作用增加。浓度为10mg/mL时抑菌效果最佳，抑菌率达到65.09％；浓度为5mg/mL时，抑菌率达到64.62％。
表2不同浓度脂肽粗提物对早疫拮抗试验抑菌半径数据统计
实施例3枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对不同植物病原菌的抑菌活性测定
供试病原菌：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄灰霉病菌(B otrytiscinerea)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、马铃薯干腐病菌 (Fusarium solani)、马铃薯黑痣病菌(Rhizoctonia solani)、梨黑斑病菌 (Alternaria kikuchiana)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorkiniana)、苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternaria f.sp mali)马铃薯疮痂病菌(Streptomyce s scabies)、马铃薯黑胫病菌(Pectobacteriumatrosepticum)以上植物病原菌均由马铃薯病害研究实验室保存并提供。
1.测定方法
1)真菌抑菌活性测定
发酵原液抑菌活性测定：采用平皿对峙法测定抑菌功能。将经活化的马铃薯早疫病菌制成直径5mm的菌饼置于PDA平皿中心，在距菌饼2.5cm处用十字交叉法接种马铃薯早疫病菌，对照为点接无菌水，每个处理5次重复，28℃下恒温培养(马铃薯早疫病病菌处理置于25℃下恒温培养)，待对照组长满培养皿(5～7d)后，测量处理组菌落抑菌带宽和对照菌落直径，并计算抑菌率。
抑菌率(％)＝对照组菌落增长直径(cm)-处理组菌落增长直径(cm)/ 对照组菌落增长直径(cm)×100
2)放线菌抑菌谱测定：发酵原液：将浓度稀释倍数至1×10-2的菌液取 100μL涂布于燕麦培养基中，培养基中央灭菌直径为5mm滤纸片上相应滴加5μLZD01菌悬液，于28℃培养箱中培养。对照组于平板中央滤纸片上滴加等量无菌水，5皿/处理，2次重复。
抑菌率(％)＝对照组菌落增长直径(cm)-处理组菌落增长直径(cm)/ 对照组菌落增长直径(cm)×100
3)细菌抑菌谱测定：发酵液：将浓度稀释倍数为1×10-3菌液100μL平板涂布于LB固体培养基中，于培养基中央直径5mm滤纸片上滴加5μL菌株ZD01发酵液，于37℃培养箱中培养。对照为点接等量无菌水。
抑菌率(％)＝对照组菌落增长直径(cm)-处理组菌落增长直径(cm)/ 对照组菌落增长直径(cm)×100。
2.测定结果
结果参见表3和图3(枯草芽孢杆菌ZD01发酵原液对不同植物病原菌的抑菌活性测定)，其中a:小麦赤霉病菌；b:梨黑斑病菌；c:小麦根腐病菌； d:番茄灰霉病菌；e:棉花枯萎病菌；f:马铃薯干腐病菌；g:苹果斑点落叶病菌； h:马铃薯黑痣病菌；i:马铃薯疮痂病菌；j:马铃薯黑胫病菌。
通过抑菌活性测定如表3所示，在十种病原菌中梨黑斑病菌和马铃薯黑痣病菌的抑菌效果较好，分别达到63.64％、62.06％，对小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、苹果斑点落叶病菌和马铃薯疮痂病菌的抑菌率为 55.19％、54.53％、52.79％和51.16％，由此可知，菌株ZD01发酵液具有广效的抑菌谱。
表3 ZD01菌株发酵液对于供试病原菌的抑菌作用
实施例4枯草芽孢杆菌ZD01脂肽粗提物对不同植物病原菌的抑菌活性测定
1.测定方法
1)真菌抑菌活性测定
脂肽抑菌活性的测定：采用琼脂扩散法，将马铃薯早疫病菌在PDA平板活化，待长满平板后，用打孔器制作5mm的菌饼，并转接入PDA平板中央；以菌饼为中心，向水平方向距离中心2.5cm处两侧用5mm打孔器打孔，分别加入50μL无菌甲醇提取滤液与无菌甲醇，25℃培养5～7d，测量抑菌带宽。
2)脂肽粗提物：将100μL疮痂菌悬液菌液(浓度与发酵原液抑菌谱使用浓度一致)均匀涂布于燕麦培养基上，距培养基中心2.5cm两侧打孔，在孔内分别滴加50μL无菌甲醇提取滤液和无菌甲醇。
3)脂肽抑菌谱测定：将浓度稀释为1×10-3菌液100μL平板涂布于LB 固体培养基中，距培养基中心2.5cm两侧打孔，在孔内分别滴加50μL无菌甲醇提取滤液和无菌甲醇。
2.测定结果
测定结果参见表4和图4(枯草芽孢杆菌ZD01的脂肽粗提物对病原菌抑菌效果图)，其中a:小麦赤霉病菌；b:梨黑斑病菌；c:小麦根腐病菌；d: 番茄灰霉病菌；e:棉花枯萎病菌；f:马铃薯干腐病菌；g:苹果斑点落叶病菌； h:马铃薯黑痣病菌；i:马铃薯疮痂病菌；j:马铃薯黑胫病菌。
由表4的数据可知供试菌株的脂肽粗提物对十种病原菌的抑菌效果中，对小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌的抑菌率最高，分别为53.95％、53.87％；对马铃薯黑痣病菌、尖孢镰刀菌抑制效果较好，抑菌率分别为45.51％和 43.83％，
表4 ZD01菌株的脂肽粗提物对十种病原菌的抑菌数据
实施例5枯草芽孢杆菌ZD01发酵液和脂肽粗提物对马铃薯早疫病菌菌丝的影响
挑取平板对峙法和琼脂扩散法中接近拮抗菌的病原真菌菌落边缘菌丝和对照中正常菌丝于扫描电镜下观察菌丝形态特征变化，描述并拍照。结果参见图5(枯草芽孢杆菌ZD01的脂肽粗提物对马铃薯早疫病菌菌丝形态影响的扫描电镜图示)。马铃薯早疫病菌与枯草芽孢杆菌ZD01发酵液和脂肽粗提物共培养后，菌落生长受到抑制，发酵液和脂肽物质对早疫病菌菌丝有明显致畸作用，菌丝产生泡囊、变形、扭曲等现象。
实施例6枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对马铃薯早疫病菌孢子萌发的影响
1.马铃薯早疫病菌孢孢子悬浮液的制备
在活化后的供试菌株菌落边缘打5mm菌盘，接种到番茄培养基平板内， 25℃全黑暗培养7d后，在培养皿内倒入少量无菌水，然后用无菌水冲洗，刮除培养基表面的气生菌丝(菌丝损伤)，放入超净台中紫外线(紫外灯管功率，培养皿与灯管距离为)照射，在紫外光下照射10min，20℃、25℃交替培养，测定产孢量。每个处理5次重复。
取无菌水加入待测培养皿中，用解剖刀在菌落上反复多次刮取，以保证能将菌株产生的分生孢子刮下，得到孢悬液，从而制成孢子悬浮液并充分混匀。
2.枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对马铃薯早疫病菌孢孢子萌发的影响
将ZD01发酵原液100μL与等量孢悬液混合，均匀涂布在1.0％水琼脂培养基中，于25℃培养箱中全黑暗培养。等量无菌水与孢悬液混合作为对照组，每个处理5次重复。分别于2、4、6h观察孢子萌发情况，若芽管与孢子等长或一个孢子正常产生多个芽管，则认为分生孢子萌发。当对照组萌发率达到90％时开始统计数据。
3.结果
结果参见表5、图6和图7，其中图6为枯草芽孢杆菌ZD01发酵液处理对马铃薯早疫病菌孢孢子萌发的影响情况，图7为对照组马铃薯早疫病菌孢孢子萌发情况。
表5菌株ZD01发酵液抑制下早疫孢子萌发率
图6和图7对比来看，当对照组早疫孢子萌发率达到91.3％时，处理组孢子萌发率仅为16.7％，孢子萌发抑制率为81.7％。结果表明，ZD01菌株发酵液可显著抑制马铃薯早疫病菌的孢子萌发。
实施例7马铃薯早疫病菌实时荧光定量PCR检测
1.马铃薯早疫病病原菌和马铃薯叶片中基因组DNA的提取
马铃薯早疫病菌菌丝DNA的提取参照Weir的方法。马铃薯叶片总DNA 采用Kumars等的CTAB法提取。
2.马铃薯早疫病病菌实施荧光定量PCR检测方法的建立
2.1质粒标准品的制备
利用RT-PCR方法，以真菌ITS序列扩增的通用引物：
ITS5(5′-GGAAG-SXI0-01TAAAAGTCGTAACAAGC-3′)
ITS4(5′-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3′)为引物，扩增茄链格孢的ITS 序列，产物大小为550～600bp。将纯化后的PCR产物和pEasy-TlSimple载体连接，转化感受态细胞DH5a，进行克隆培养、阳性重组子鉴定、测序，验证正确后获得重组质粒。
2.2荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线的绘制
退火温度以56.0℃为基础，具体范围设定为56.0、56.9，58.3、60.2、63.1、 65.1、66.4和67.0℃等8个温度梯度，进行退火温度优化。以最高的荧光值、最小的Ct值。
将5倍梯度稀释1×106copies/μL、2×105copies/μL、4×104copies/μL、8×103copies/μL、1.6×103copies/μL、3.2×102copies/μL、和6.4×101copies/μL的7 个浓度质粒标准品，进行实时荧光定量提取PCR扩增。利用 Iqtm5OpticalSystemSoftware分析软件，自动绘出以Ct值为y轴，以拷贝数的对数为x轴的标准曲线。
对马铃薯早疫病叶片的拷贝数和供试菌株ZD01处理进行数据分析(图 8)。结果表明，对照组叶片中早疫病菌的拷贝数为11.15×108；菌株ZD01 菌体喷施处理的叶片中早疫病菌含量最少，拷贝数为2.72×108；发酵液上清次之，拷贝数为4.14×108；发酵液处理的马铃薯早疫病叶片中早疫病菌的含量最多，拷贝数为5.21×108。三个处理中早疫病菌的含量比对照组明显降低。说明菌体对早疫病菌有较好的生物防治效果。抑制效果大小为菌体>发酵液上清>发酵液。
实施例8枯草芽孢杆菌ZD01发酵液对离体叶片防治马铃薯早疫病作用
1.马铃薯早疫病菌孢子悬浮液的制备
将选择的早疫病菌株在25℃下与番茄培养上培养7d，然后用无菌水冲洗，刮除菌丝，在紫外灯光下照射10min，20℃培养2d。再用无菌水冲洗分生孢子，将孢悬液浓度调为1×105个/mL用于离体叶片的接种试验。
2.枯草芽孢杆菌ZD01菌液的制备
1)4mL菌悬液接种到100LB液体培养基中37℃，200rmp，24h，测OD 值；
2)菌悬液：发酵液于4℃8000rmp离心20min，所得的沉淀加无菌水进行溶解；
3)发酵液上清：离心后上清液经0.22μm细菌过滤器过滤备用；发酵原液和无菌水。
3.离体叶片处理
1)采用NAA处理的离体叶片接种法对马铃薯栽培品种进行抗早疫病测定。具体方法如下：取叶位、叶龄、大小一致的供测定品种(荷兰十五)的健康叶片。
2)叶片消毒：在70％～75％的乙醇中10～60s；然后迅速转入1％次氯酸钠5～30min，消毒剂中加入少量的表面活性剂(tween20或80、家用洗涤剂)；消毒结束后将材料转入无菌水中漂洗2～8次。
3)叶片晾干后分别喷施菌悬液、发酵液、发酵液上清、无菌水叶面形成雾滴。
4)将叶片正面朝上，把叶片插入含有10.7μM的NAA和10μg/m L四环素的0.5％水琼脂的培养皿中，每皿8个叶片，三个重复，每个叶片接种25μL 孢子悬浮液于主叶脉中部附近；对照每皿8叶片接种25μL无菌水，在25℃保湿培养。
结果参见图9、图10，其中图9为马铃薯叶片接种早疫病菌后与菌株 ZD01拮抗的病斑面积；图10为不同处理叶片的实物图，其中a：叶面喷无菌水后点接无菌水；b：叶面喷施菌株ZD01发酵液上清后点接无菌水；c：叶面喷施菌株ZD01菌悬液后点接无菌水；d：叶面喷施发酵液后点接无菌水；e：叶面喷施无菌水后点接孢悬液；f：叶面喷施菌株ZD01发酵液上清后点接孢悬液；g：叶面喷施菌株ZD01菌悬液后点接孢悬液；h：叶面喷施ZD01发酵液后点接孢悬液。
发酵液上清对早疫病菌的抑制作用较为显著，病斑面积最小，仅为 0.20cm2；发酵液上清次之，面积为0.27cm2；发酵液对早疫病菌的抑制作用最弱，病斑面积达到0.38cm2，但各处理组均显著小于空白组的病斑面积 2.5cm2。
实施例9高效液相色谱法(HPLC)纯化枯草芽孢杆菌ZD01的脂肽粗提物
HPLC分析采用C18(5μm，250mm×4.6mm；YYDAC218TP；Hesperia， CA)柱，流动相为乙腈、水、0.1％甲酸(体积比为80∶20∶0.5vol/vol for Surfactin(表面活性素)；体积比为40∶60∶0.5vol/vol forIturin(伊枯草素)体积比为50∶50∶0.5vol/vol for Fengycin(丰原素))；流速为 0.5mL·min-1，进样量为10μL，紫外检测波长为210nm，柱温为30℃。
脂肽纯品surfactins(表面活性素)和fengycins(丰原素)经HPLC分析检测后，发现脂肽分离时间分别为4.599min、4.943min、5.758min(参见图11，高效液相色谱法对脂肽纯品surfactins的测定)和4.601min、 4.953min、5.760min(图12，高效液相色谱法对脂肽纯品fengycins的测定)。从ZD01菌株发酵液中提取的脂肽粗提物经HPLC分析(图13，高效液相色谱法(HPLC)对枯草芽孢杆菌ZD01的脂肽粗提物的纯化)后，发现洗脱峰1和2的分离时间为4.59～4.92min与标准品的分离时间基本对应。
实施例10枯草芽孢杆菌ZD01的脂肽分离的表面活性素及丰原素对马铃薯早疫病菌抑菌活性测定
采用琼脂扩散法，将马铃薯早疫病菌在PDA平板活化，待长满平板后，用打孔器制作5mm的菌饼，并转接入以培养基为中心向水平方向距离中心 1.25cm处用5mm打孔器打孔，处理组浓度均为2.5mg/mL表面活性素、丰原素、丰原素+表面活性素(体积比为1:1)、分别向一侧加入50μL相应纯品，对照为CK、甲醇。5个处理3次重复。
结果参见图14(枯草芽孢杆菌ZD01的脂肽分离的表面活性素及丰原素对马铃薯早疫病菌抑菌活性测定)，其中，a：对照；b：甲醇；c：fengycins； d：surfactins；e：fengycins+surfactins。
结果显示：surfactins对早疫病菌的抑菌活性较弱，fengycins对早疫病菌的抑制效果显著，二者混配时也可产生抑制效果，但较弱于fengycins的单独处理。故得知供试菌株ZD01的脂肽粗提物中起主要抑制作用的为 fengycins。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.枯草芽孢杆菌的菌液脂肽提取物在广谱抑制植物致病菌中的应用；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZD01，保藏编号为：CGMCC No.19555；
所述植物致病菌为马铃薯早疫病菌、马铃薯黑痣病菌、梨黑斑病菌、小麦赤霉病菌、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌、苹果斑点落叶病菌和马铃薯疮痂病菌中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的菌液脂肽提取物通过抑制植物致病菌菌丝生长和/或抑制植物致病菌孢子的萌发来防治马铃薯早疫病菌。
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