CN108004154B - 腥掷孢酵母菌17wy1、其微生物制剂及其在小麦白粉病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种掷孢酵母菌17wy1、其微生物制剂及其在在防治小麦白粉病中的应用，旨在解决化学防治危害的技术问题。该菌保藏编号为CGMCC No：14148，其微生物制剂含掷孢酵母菌17wy1或/和其代谢产物；所述微生物制剂的制备方法，包括（1）种子培养物制备；（2）发酵液制备；（3）制剂。其微生物制剂含掷孢酵母菌17wy1或/和其代谢产物在抑制小麦白粉菌分生孢子的萌发及其生长繁殖中的应用时，对于小麦白粉菌分生孢子的萌发和生长具有拮抗作用，对离体和活体小麦叶片上的白粉菌均有很好的防治效果。本发明所用的原料成本低廉，对环境安全，避免了农用安全隐患，本发明中的掷孢酵母菌可作为小麦白粉病生防菌剂进行开发利用。

Description

腥掷孢酵母菌17wy1、其微生物制剂及其在小麦白粉病防治中 的应用

技术领域

本发明涉及微生物生物防治技术领域，具体涉及一种腥掷孢酵母菌17wy1、其微生物制剂及其在小麦白粉病防治中的应用。

背景技术

由布氏白粉菌（Blumeriagraminis(DC.) E.O.Speerf.sp.tritici）侵染引起的小麦白粉病在全球范围内普遍发生，对小麦的产量和品质影响十分严重，是小麦生产上的主要病害之一。

化学防治是小麦白粉病防治的重要措施，具有防治效果好、收效快、使用方便、受季节性限制较小、适于大面积使用等优点，然而近年来随着药剂防治的扩大使用或滥用，一些弊端如对环境和农产品造成污染、病菌产生抗药性逐渐显现。

不少研究人员开展了小麦白粉病生防菌的筛选和鉴定等基础性研究工作：范瑛阁等采集土样分离菌株，共得到12株防效较好的菌种；焦少娟等从陕西杨凌地区不同类型土壤中分离放线菌，获得了一株对白粉菌具有强烈拮抗作用的菌株；伊艳杰等从小麦茎叶组织中分离内生真菌，共得到4株对小麦白粉菌具有防效的菌株。虽然发现的具有杀菌活性的细菌或霉菌或其代谢产物很多，但由于其对人畜、鱼类或天敌的毒性高、稳定性差、对环境影响大等因素而未能制剂化生产。

因此，急需寻找一种更安全、高效、无污染的生防制剂来替代化学农药和无法制剂化的微生物来防治植物病害，生物源天然新品种生防制剂的研发迫在眉睫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种孢酵母菌17wy1及其微生物制剂，并将其应用在小麦白粉病防治中，以替代化学农药防治。

目前，由于具有杀菌活性的细菌或霉菌或其代谢产物对人畜、鱼类或天敌的毒性高、稳定性差、对环境影响大，使筛选新品种的杀菌生防制剂迫在眉睫。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术思路：

利用有益酵母菌作为生防菌，具有许多优点：1.拮抗效果好，酵母菌能有效地利用贫乏营养快速增殖，干燥情况下可在小麦叶片定殖并存活相当长时间，能耐受低温等不良环境，拮抗效果好；2.能和化学杀菌剂共同使用，酵母菌对化学杀菌剂有较大的抗性，可以和化学杀菌剂混用，减少杀菌剂的用量，提高生防效果；3.不产生抗菌素，酵母菌不产生抗菌素，能够避免病原菌对抗菌素产生抗性而降低生物防治抑菌效果，另一方面也能够避免某些抗菌素对人体的不利影响。

本发明采用的具体技术方案如下：

筛选一种小麦白粉病生防酵母菌，其名称为：腥掷孢酵母菌17wy1（Tilletiopsispallescens），其保藏编号为CGMCC No：14148；其菌落为乳白色或奶油色，呈凸起状，光滑无皱褶，表面湿润且具有光泽，边缘整齐；其倒置培养时，菌落能弹射孢子于培养皿盖上形成对应的白色印迹。

上述腥掷孢酵母菌17wy1和其代谢产物可以经由以下方法制备成生物制剂：

（1）种子培养物制备：腥掷孢酵母菌菌株17wy1 CGMCC No：14148接种于PDA培养基中培养72h，即得；

（2）发酵液制备：将上步所得种子培养物接种于YPD培养基中，180rpm，25℃培养120h，制得发酵液；

（3）制剂：所得发酵液直接分装成菌剂，或添加辅助成分后制成菌剂。

优选的，所述PDA培养基含马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH。

优选的，所述YPD培养基含酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。

所述腥掷孢酵母菌17wy1或/和所述微生物制剂应用在防治小麦白粉病中，能够起生物防治作用，主要原因在腥掷孢酵母菌17wy1或其代谢产物能够抑制小麦布氏白粉菌（Blumeriagraminis(DC.) E.O.Speerf.sp.tritici）分生孢子的萌发及其生长繁殖。

本发明所述腥掷孢酵母菌菌株17wy1，已于2017年8月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该腥掷孢酵母菌菌株17wy1的保藏编号为CGMCC No：14148。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1. 本发明筛选的小麦白粉菌拮抗酵母菌17wy1，是一种腥掷孢酵母菌，是从生长异常的小麦白粉菌株上分离获得的；其发酵液对于小麦白粉菌分生孢子的萌发和生长具有拮抗作用，对小麦白粉菌孢子萌发抑制率可达到85.144%；且对离体和活体小麦叶片上的白粉菌均有很好的防治效果，且不会引起小麦发病。

2. 本发明的腥掷孢酵母菌发酵在有效降低田间小麦白粉病的发病程度的前提下，所用的原料成本低廉，便于生产。

3. 本发明的腥掷孢酵母菌是一种安全的生物资源，对环境安全，避免了农用使用的安全隐患，可作为小麦白粉病生防菌剂进行开发利用，为小麦白粉病生防菌剂的开发提供有益资源，是具有重要开发意义的生防菌。

附图说明

图1为腥掷孢酵母菌的菌落形态图；

图2为腥掷孢酵母菌的细胞形态图；

图3为小麦白粉菌孢子萌发的对比图；

图4为田间小麦白粉病防治实验对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验和检测方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：培养基配方

PDA培养基：马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH，121℃高温高压灭菌30min。

YPD培养基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，自然pH，121℃高温高压灭菌30min。

实施例2：腥掷孢酵母菌（Tilletiopsispallescens）的分离纯化与鉴定

（1）取生长异常的小麦叶片，如带有白粉菌且其分生孢子分散、叶片有黄褐色分泌物堆积、叶片生长缓慢将死；

（2）用灭过菌的手术刀将其小心刮下接种于PDA固体培养基上，25℃恒温条件下培养3～5天；

（3）挑取其中有映射菌落的部分，反接于PDA培养基上进行纯化，重复2次；

（4）高倍显微镜下观察细胞形态特征；

（5）收集菌丝于PE离心管中，用OMEGA试剂盒提取DNA，PCR扩增测其ITS序列。

结果显示：

掷孢酵母是以出芽形式进行无性繁殖的，并可弹射孢子的单细胞，特点是形成红色或粉红色的菌落及肾形或豆形的掷孢子，掷孢子由卵圆形的营养细胞生出小突起形成，然后由一种突发机制弹射出去。

将所培养菌倒置培养时，菌落能弹射孢子于培养皿盖上形成对应的白色印迹，如图1中1所指部分所示，能观察到在培养皿盖上形成白色印迹的镜像；其菌落特征是菌落乳白色或奶油色，呈凸起状，光滑无皱褶，表面湿润且具有光泽，边缘整齐，如图1中2所指部分所示。

如图2所示：在显微镜下观察细胞呈椭圆形，大小不等，同时还有明显的出芽生殖特征。

PCR扩增结束后，该菌株ITS rDNA凝胶电泳条带清晰，显示已成功扩增到掷孢酵母的ITS rDNA序列，基因测序显示条带大小为649bp，其碱基序列如序列表SEQ ID NO:1所示，将该菌株ITS rDNA序列提交NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与掷孢酵母属的相似性均达到98%。

结合该菌株形态学特征和分子生物学鉴定结果确定该菌株为掷孢酵母，将其命名为17wy1进行菌种保藏，保藏编号为CGMCC No：14148。

实施例3：腥掷孢酵母菌对小麦白粉菌分生孢子的萌发及生长繁殖的抑制

（1）挑取PDA固体培养基上长好的腥掷孢酵母菌17wy1，接种于配制好的YPD液体培养基中，置于180rpm，25℃的摇床中培养5～7天，离心收集滤出菌体后的滤液；

（2）配制1%的水琼脂微波炉化开备用，滤液稀释至10^-1、10^-2倍，将掷孢酵母滤液分为原液、10^-1、10^-2和CK（清水）4个处理，并分别将其和未凝固的水琼脂以1：1的比例混匀后涂于干净的玻片上；

（3）取新鲜的白粉菌分生孢子均匀抖落在冷凝好的水琼脂上。18℃培养箱中黑暗培养24h；

（4）显微镜下镜检，按公式：孢子萌发抑制率=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100%，计算小麦白粉菌的孢子萌发抑制率。

结果如图3所示：腥掷孢酵母菌17wy1发酵原液对小麦白粉菌分生孢子萌发的有效孢子萌发抑制率为85.144%。

实施例3. 腥掷孢酵母菌17wy1菌液对田间小麦白粉病的防治作用

（1）接种腥掷孢酵母菌17wy1接种于配制好的YPD液体培养基中，置于180rpm，25℃的摇床中培养7天；

（2）取发酵原液稀释10倍作为试验组，以清水做阴性对照；

（3）将试验组和对照组喷施与田间孕穗期至抽穗期的发病严重的小麦叶片上，试验组接菌液之前先喷清水保湿再接菌液；

（4）10天后按分级指标调查小麦白粉菌的防治效果。

结果如图4所示：

图中左图中小麦叶片及叶鞘有棉絮状菌丝体，病斑连成大片，发病4级的小麦叶片在喷施腥掷孢酵母菌17wy1发酵原液后发病级别降为1级，如图中右图所示，仅在叶鞘边缘有少量稀薄的菌丝体层，病害明显减轻。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 得到

河南省农业科学院植物保护研究所

<120> 掷孢酵母菌17wy1、其微生物制剂及其在小麦白粉病防治中的应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 649

<212> DNA

<213> Tilletiopsis pallescens

<400> 1

agctgggaat ctacctgatt ttgaggccag agcattaaaa attccgcttc acaccattgc 60

tggcttccga ccaaggttgg aagcagaccg gattcctaca cctggctgat cagccgtaag 120

ggcgaacata cctcgacgaa tgaaattatc acgtcgagtt gaaccagctc ggaatagggg 180

ccagctaatc tctttaaggg gagccaagca cttgaagaag cgcattggca agacgcccaa 240

atccagaccc aagccaatcg cttaacaaaa aacgatgggg gctgaaggat tcctgacact 300

caaacaggca tgctcctcgg aataccaagg agcgcaagat gccttcaaag actcgatgat 360

tcactgaatt ctgcaattca cattaactat cgcgtttcgc tgcgttcttc atcgatggga 420

gaaccaagag atccgttgtc caaagttgta tttttgtttc tgtcaaaaga caagtttaca 480

actacatcca ttaactccgg gtttgtaata attaaagggt gccagaacgt ctctttttca 540

aaaaacgctc ccacgattcc caaggggggg gaaattatgt gaagggtcgg gcccccaaaa 600

atgggaaagc cctatttttc aataatgatc ctaccgcagg gtcccctac 649

Claims (7)

1.一种腥掷孢酵母菌（Tilletiopsispallescens）17wy1 ，其保藏编号为CGMCC No：14148。

2.一种微生物制剂，含有权利要求1所述腥掷孢酵母菌17wy1和其代谢产物。

3.权利要求2所述微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）种子培养物制备：将权利要求1所述的腥掷孢酵母菌菌株17wy1接种PDA培养基中培养72h，即得；

（2）发酵液制备：将上步所得种子培养物接种于YPD培养基中，180rpm，25℃培养120h，制得发酵液；

（3）制剂：所得发酵液直接分装成菌剂，或添加辅助成分后制成菌剂。

4.根据权利要求3所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述PDA培养基含马铃薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH。

5.根据权利要求3所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述YPD培养基含酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。

6.权利要求1所述腥掷孢酵母菌17wy1或权利要求2所述微生物制剂在防治小麦白粉病中的应用。

7.权利要求1所述腥掷孢酵母菌17wy1或权利要求2所述微生物制剂在抑制小麦布氏白粉菌（Blumeria graminis）分生孢子的萌发及其生长繁殖中的应用。

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