CN112940948B - 一种长枝木霉菌及其应用 - Google Patents

一种长枝木霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长枝木霉菌及其应用，属于植物病害生物防治领域。该长枝木霉于2021年3月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为CGMCCNO.21474。该长枝木霉T23菌株是在分离谷子纹枯病菌过程中获得，该菌株寄生在谷子纹枯病菌菌落上，具有生长快、产孢多等特点，适合规模化生产。长枝木霉T23气生菌丝不发达，菌落一开始为白色，随着菌丝的生长，后期菌落变为绿色，长枝木霉与谷子立枯丝核菌对峙培养，其可以抑制谷子纹枯病菌菌落生长，后期可以完全覆盖谷子纹枯病菌菌落，并且以缠绕方式寄生谷子纹枯病菌。该菌株在谷子绿色防控病害方向具有很好的应用前景。

Description

一种长枝木霉菌及其应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治领域，尤其涉及一种长枝木霉菌及其应用。
背景技术
谷子起源于我国，其种植面积和产量占世界的80％以上。小米营养丰富，在世界小杂粮热潮中日益受到人们的青睐。谷子抗旱耐瘠，是我国北方广大干旱地区的优质抗旱作物，再加上谷草是牛羊的优质饲草，在耕地紧缺的情况下是发展畜牧养殖业的首选粮草兼用性作物。由此可见，谷子在目前种植业结构调整中显示出了越来越强的优势，发展前景无限广阔。谷子不同部位有多种病害，叶部主要病害为谷瘟病、谷锈病、粟弯孢霉叶斑病和粟胡麻斑病等。谷瘟病是由稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)引起的的一种谷子暴发流行性真菌病害，全生育期均可发病，特别是后期的穗瘟对产量影响较大，严重发生可导致绝产，近年来谷瘟病已经成为影响我国谷子生产的重要病害之一。谷锈病是谷子上另一种气传流行性病害，主要在谷子生长后期发病，发病严重时谷子倒伏，对产量影响很大。粟弯孢霉叶斑病和粟胡麻斑病分别是由粟弯孢霉病菌和粟胡麻斑病菌侵染谷子后形成的病害，这两种病害在谷子叶片上形成较大的病斑，并且在某些感病品种危害后造成叶片提前死亡，严重影响后期灌浆。根茎部主要有谷子纹枯病，该病害是由立枯丝核菌引起的，是一种土传病害。谷田种植密度较大，并且后期雨水较大时发病严重，容易造成谷子倒伏和早衰。穗部主要有谷瘟病、黑穗病、白发病和穗腐病等，其中穗腐病是由禾谷镰刀菌引起的病害，由于该真菌产生对人体有危害的毒素。发病后对谷子造成污染，影响其品种及安全。谷子许多病害如谷瘟病、锈病存在多种生理小种，容易发生生理小种变异，导致谷子抗病性丧失，并且生产中育成品种具有抗性品种缺乏。而化学农药对谷子的喷施，容易造成环境污染和农药残留，不利于谷子的绿色生产。长期以来，防治谷子病害主要依靠大量频繁地喷施农药，不但费时费力，而且污染环境、造成农药残留和产生抗药性，不符合人们对绿色食品需求的趋势。因此基于当前农药减量使用，发展绿色农业的需求，采用科学、高效和无公害方法防治谷子病害的危害非常必要。
木霉菌Trichoderma属半知菌、从梗孢科，是一种分布广泛的土壤习居菌，也是一种高效的拮抗促生菌。木霉是一类生长在土壤中而不引起任何症状的微生物，在长期进化过程中，木霉和植物彼此适应、相互作用。自从1932年Weindling发现其具有拮抗病原微生物，目前已有多个木霉菌株分离出并应用到病害防治。康彦平等从黑龙江大田分离一株拟康宁木霉，研究发现该菌株对花生核盘菌具有极强的抑制作用，可以抑制菌核的生成，并且还可以使形成的菌核死亡，拟康宁木霉非挥发代谢产物也能抑制花生核盘菌生长。Karimi从田间分离20株木霉菌株，大多数菌株可以显著抑制草莓炭疽病菌生长，并且可以产生细胞裂解酶及嗜铁素，发现草莓炭疽病病级指数降低与木霉菌接种量成正相关。因此分离和筛选对谷子病害具有拮抗作用的木霉菌，符合绿色生产的需要，有较好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长枝木霉菌及其应用。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供一种长枝木霉菌，该菌株是从谷子纹枯病菌菌落上分离纯化，菌株经分子鉴定为长枝木霉，菌株株系命名为T23。该长枝木霉菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21474，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供的长枝木霉T23菌株28℃在PDA培养基上生长很快，96小时可以长满培养皿，菌落初为白色，随着分生孢子的产生，菌落逐渐变为绿色，气生菌丝较少，分生孢子通常呈同心纹状排列，分生孢子绿色，椭圆形。
本发明经试验发现长枝木霉T23对多种谷子病原菌有拮抗作用，通过对峙培养，发现长枝木霉T23对谷子纹枯病菌、谷瘟病菌、粟弯孢霉病菌、粟胡麻斑病菌和谷子穗腐病菌的抑制率在52.31％到72.12％之间。
上述长枝木霉菌发酵液的制备方法包括如下步骤：将长枝木霉菌株在固体PDA培养基上培养4-6天，温度为25-30℃，收集分生孢子制备孢子悬浮液，并将其按一定比例接种到PDB液体培养基中，25-30℃130-180rpm/min震荡培养4-6天后收集发酵液。
进一步地，所述悬浮液的孢子浓度为1×106个/mL。
更进一步地，所述孢子悬浮液与PDB液体培养基的接种比例为1:100。
本发明还提供一种对权利要求1所述的长枝木霉菌进行遗传改良后得到的工程菌。
其中，由于该工程菌是以本发明的长枝木霉菌为靶标，而且采取的手段一般是向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，该工程菌仍然为木霉菌或者说仍为长枝木霉菌。另外，所述工程菌可以为提高了对病害谷子纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、谷瘟病菌(Pyricularia oryzae)、粟弯孢霉病菌(Curvularia lunata)、粟胡麻斑病菌(Bipolarissetariae)和谷子穗腐病菌(Fusarium graminearum)抑菌活性的工程菌，还可以为兼具其他病虫害活性的工程菌株。
本发明还提供一种组合物，该组合物包含上述长枝木霉菌和/或上述工程菌。
本发明还提供一种农药制剂，该农药制剂包含上述长枝木霉菌和/或上述工程菌。
本发明还提供上述长枝木霉菌、上述工程菌或上述组合物在制备农药制剂中的应用。
本发明还提供上述长枝木霉菌、上述工程菌或上述组合物在防治植物病害中的应用。
进一步地，所述植物病害包括谷子纹枯病、谷瘟病、粟弯孢霉叶斑病、粟胡麻斑病和谷子穗腐病。
本发明还提供了长枝木霉菌、上述工程菌或上述组合物在抑菌中的应用，所述长枝木霉菌对谷子纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、谷瘟病菌(Pyricularia oryzae)、粟弯孢霉病菌(Curvularia lunata)、粟胡麻斑病菌(Bipolaris setariae)和谷子穗腐病菌(Fusarium graminearum)中的一种或多种具有抑制作用。
本发明提供的长枝木霉T23与立枯丝核菌对峙培养，经显微观察木霉可通过缠绕方式重寄生谷子纹枯病菌菌丝。
本发明的长枝木霉在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中振荡培养5天，发酵液过滤后分别与等体积谷瘟病菌、粟胡麻斑病菌和粟弯孢霉病菌混合，保湿培养24小时，发现滤液可以抑制谷瘟病菌附着胞产生，粟胡麻斑病菌和粟弯孢霉病菌萌发。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的长枝木霉菌可抑制谷子纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、谷瘟病菌(Pyricularia oryzae)、粟弯孢霉病菌(Curvularia lunata)、粟胡麻斑病菌(Bipolarissetariae)和谷子穗腐病菌(Fusarium graminearum)菌丝生长，其发酵液可以显著抑制谷瘟病菌附着胞形成及粟弯孢霉病菌和粟胡麻斑病菌孢子萌发，该菌株在谷子绿色防控病害方向具有很好的应用前景。
长枝木霉菌T23的生物保藏说明：
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏编号：CGMCC NO.21474；
保藏日期：2021年03月25日；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
分类学命名：长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)。
附图说明
图1为实施例1中长枝木霉菌T23在PDA培养基上的菌落形态图。
图2为实施例1中长枝木霉菌T23的分生孢子形态图。
图3为实施例1中长枝木霉菌T23 tef1基因与其它木霉菌株tef1基因聚类分析图。
图4为实施例2中长枝木霉菌T23与谷瘟病菌的对峙培养结果图。
图5为实施例2中长枝木霉菌T23与粟胡麻斑病菌的对峙培养结果图。
图6为实施例2中长枝木霉菌T23与粟弯孢霉病菌的对峙培养结果图。
图7为实施例2中长枝木霉菌T23与谷子穗腐病菌的对峙培养结果图。
图8为实施例2中长枝木霉菌T23与谷子纹枯病菌的对峙培养结果图。
图9为实施例2中长枝木霉菌T23形成缠绕结构寄生谷子纹枯病菌的形态图。
图10为实施例3中长枝木霉菌T23发酵液对谷瘟病菌孢子萌发和附着胞形成的影响结果图。
图11为实施例3中长枝木霉菌T23发酵液对粟弯孢霉病菌孢子萌发的影响结果图。
图12为实施例3中长枝木霉菌T23发酵液对粟胡麻斑病菌孢子萌发的影响结果图。
具体实施方式
实施例1长枝木霉菌株T23分离与鉴定
1.培养基的配制
(1)PDA培养基配制：
200克土豆切片，放入800毫升蒸馏水煮沸，煮沸后约20分钟经纱布过滤，取滤液加入20克葡萄糖，搅拌均匀加水定容到1升，加入琼脂粉15克，加热融化后分装到三角瓶，封口后在高压锅中121℃灭菌20分钟。
(2)PDB培养基配制：
200克土豆切片，放入800毫升蒸馏水煮沸，煮沸后约20分钟经纱布过滤，取滤液加入20克葡萄糖，搅拌均匀加水定容到1升，分装到三角瓶，封口后在高压锅中121℃灭菌20分钟。
(3)LB固体培养基：一升培养基中胰蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母提取物5克，琼脂粉15克。
(4)LB液体培养基：一升培养基中胰蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母提取物5克。
2.长枝木霉菌株T23的分离与鉴定过程如下：
(1)把来自辽宁朝阳谷子纹枯病菌标本wk23用75％酒精表面消毒30秒，放置在PDA培养基平板上培养，平板中发现有其它真菌在纹枯病菌菌落上生长，且生长很快，很快将纹枯病菌菌落覆盖，并且菌落呈绿色。用接种针挑取绿色菌丝转移到新的PDA培养基平板，纯化3次后发现该菌生长迅速，初始菌落为白色，很快菌落变为绿色，气生菌丝不发达，菌落形态如图1所示，把该木霉菌命名为T23菌株。T23菌株的分生孢子为绿色，聚集在一起，形成分生孢子堆，在扫描电镜下可以看到孢子聚集在一起，孢子呈椭圆形(参见图2)，初步推断该分离物为木霉菌。
(2)把木霉菌T23在PDA平板上活化，挑取菌盘接种到液体PDB培养基中，静止培养10天后，收集上层菌丝体，用滤纸压干后，液氮研磨成粉末，用CTAB法提取真菌基因组DNA，提取的DNA经1％琼脂糖电泳检测合格后可进行PCR扩增。
木霉菌的翻译延伸因子(translation elongation factor 1-alpha)由于具有种之间的差异，可用于木霉菌的鉴定，所用的木霉菌翻译延伸因子特异性引物为EF728：5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’(SEQ ID NO.1)和Tef1：5’-GCCATCC TTGGGA GATACCAGC-3’(SEQID NO.2)。
PCR反应体系为25μl，其中PCR mix 12.5μl，木霉T23基因组DNA 1μl，引物各1μl，灭菌蒸馏水9.5μl。PCR反应体系95℃变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，可以看到一个600bp左右的特异片段，将目的片段切胶回收后连接在大连宝生物公司PMD19-T载体上，进行克隆转化和测序，长枝木霉菌T23的tef1基因序列如SEQ ID NO.3所示，用Mega5.0软件把测序结果与其它种木霉菌tef1基因进行比对分析，结果如图3所示，从图3中可知T23菌株与长枝木霉聚类在一起，表明T23菌株为长枝木霉菌。
实施例2长枝木霉菌株T23抑制谷子纹枯病菌生长及重寄生纹枯菌丝
将长枝木霉T23和各供试菌株在PDA平板培养基上活化，待菌落将要长满培养皿时，用打孔器打取直径为5mm的菌盘，把长枝木霉T23菌盘和各供试谷子病原真菌接种在培养皿两端，中间距离6厘米，各供试谷子病原菌单独接种在PDA平板作为对照，从接种第二天开始记录生长速度，直到对照菌落长满培养皿，实验重复3次，结果参见图4-图8，可以看出长枝木霉T23菌株对各供试菌株有不同程度的抑制，其中图4为长枝木霉T23与谷瘟病菌的对峙培养，A：对照，B：长枝木霉对谷瘟病菌的抑制结果图；图5为长枝木霉T23与粟胡麻斑病菌的对峙培养，A：对照，B：长枝木霉对粟胡麻斑病菌的抑制结果图；图6为长枝木霉T23与粟弯孢霉病菌的对峙培养，A：对照，B：长枝木霉对粟弯孢霉病菌的抑制结果图；图7为长枝木霉T23与谷子穗腐病菌的对峙培养，A：对照，B：长枝木霉对谷子穗腐病菌的抑制结果图；图8为长枝木霉T23与谷子纹枯病菌的对峙培养，A：对照，B：长枝木霉对谷子纹枯病菌的抑制结果图。
抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径
由上式计算得出长枝木霉T23对谷瘟病菌、粟胡麻斑病菌、粟弯孢霉病菌、谷子穗腐病菌和谷子纹枯病菌的抑制率，结果如表1所示，从表1可以看出，长枝木霉菌株T23的抑菌活性对谷瘟病菌抑制率最高，达到72.12％，而对谷子纹枯病菌抑制率最低，达到52.31％。
表1长枝木霉菌株T23的抑菌活性
病原菌 抑菌率/％
穗腐病菌Fusarium graminearum 54.64
谷子纹枯病菌Rhizoctonia solani 52.31
粟弯孢霉病菌Curvularia lunata 62.35
谷瘟病菌Pyricularia oryzae 72.12
粟胡麻斑病菌Bipolaris setariae 68.34
长枝木霉菌株T23与谷子纹枯病菌对峙培养后，初期木霉菌和谷子纹枯病菌在培养皿中间形成分界线，后期木霉菌可以继续在谷子纹枯菌落上生长，挑取共生菌丝，显微观察可以看到木霉菌T23菌株缠绕谷子纹枯病菌菌丝，形成寄生关系，参见图9。
实施例3长枝木霉菌T23发酵液抑制谷子纹枯病菌菌丝生长
长枝木霉菌T23、粟胡麻斑病菌和粟弯孢霉病菌在固体PDA培养基上28℃培养5天，用灭菌蒸馏水冲洗培养皿表面分生孢子，制备浓度为1×106个/mL孢子悬浮液。谷瘟病菌在高粱粒培养基上生长，洗脱高粱粒制备浓度为1×106个/mL孢子悬浮液。将长枝木霉孢悬液以1:100的比例接种到PDB液体培养基中，28℃150rpm/min培养5天后收集滤液，经双层纱布去除菌丝，利用滤纸去除杂质，滤液经0.22微米细菌过滤后，分别与等体积谷瘟病菌、粟胡麻斑病菌和粟弯孢霉病菌孢悬液混合，以PDB溶液分别与等体积谷瘟病菌、粟胡麻斑病菌和粟弯孢霉病菌孢悬液混合作为对照，把10μl孢子混合液分别放置在洋葱皮表皮细胞或疏水介质玻璃膜上保湿培养24小时，通过显微观察，结果参见图10，发现在洋葱表皮细胞上可以看到对照谷瘟病菌孢子正常萌发，并形成黑色附着胞，而发酵液处理后虽然谷瘟病菌孢子可以萌发，但是仅形成较长的芽管，并不形成黑色附着胞，其中A：对照，B：发酵液处理谷瘟病菌孢子。附着胞形成膨压是谷瘟病菌侵染谷子叶片的关键，因此发酵液通过抑制谷瘟病菌附着胞的产生而使谷瘟病菌致病力减弱。
镜检结果参见图11-12，可以发现粟弯孢霉病菌和粟胡麻斑病菌对照在疏水介质玻璃膜上可以正常萌发，而发酵液处理抑制了孢子的萌发，从而影响其侵染谷子，其中图11为长枝木霉T23发酵液对粟弯孢霉菌孢子萌发的影响结果，A：对照，B：发酵液处理粟弯孢霉菌孢子的结果图；图12为长枝木霉T23发酵液对粟胡麻斑病菌孢子萌发的影响结果图，A：对照，B：发酵液处理粟胡麻斑病菌孢子的结果图。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河北省农林科学院谷子研究所
<120> 一种长枝木霉菌及其应用
<130> 2021.04.16
<141> 2021-04-20
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
catcgagaag ttcgagaagg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gccatccttg ggagatacca gc 22
<210> 3
<211> 606
<212> DNA
<213> 长枝木霉T23的tef1基因序列()
<400> 3
catcgagaag ttcgagaagg taagcttgag atcccttcaa ttttcggacg atttcctgtg 60
cctctgccca acatcttttt tttcaccacc ccgctttctc ctacccctcc tttgggcgac 120
gcaaattttt tttgttgcgt ttcgggtttt agtggggatg cacctccagc aaaccactat 180
cctctgccgc cctctgctct cgtctccaac acctttggcg cttgcgtcat caaccttcca 240
acagtctgcg cagcaatgct aatcattttc ccctcaacag gaagccgccg aactcggcaa 300
gggttccttc aagtacgcgt gggttcttga caagctcaag gccgagcgtg agcgtggtat 360
caccatcgac attgccctct ggaagttcga gactcccaag tactatgtca ccgtcattgg 420
tatgtttgat cccgtgcact cattgcatca tcgccacaac aacatactaa tgccctctga 480
cagacgttcc cggccaccgt gatttcatca agaacatgat cactggtact tcccaggccg 540
actgcgccat tctcatcatt gccgccggta ctggtgagtt cgaggctggt atctcccaag 600
gatggc 606

Claims (9)

1.一种长枝木霉菌，其特征在于，所述长枝木霉菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21474，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种如权利要求1所述的长枝木霉菌的发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的长枝木霉菌在固体PDA培养基上培养4-6天，温度为25-30℃，收集分生孢子制备孢子悬浮液，并将其接种到PDB液体培养基中，25-30℃ 130-180rpm/min震荡培养4-6天后收集发酵液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述悬浮液的孢子浓度为1×106个/mL。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述孢子悬浮液与PDB液体培养基的接种比例为1:100。
5.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的长枝木霉菌。
6.一种农药制剂，其特征在于，所述农药制剂包含权利要求1所述的长枝木霉菌。
7.权利要求1所述的长枝木霉菌或权利要求5所述的组合物在制备农药制剂中的应用。
8.权利要求1所述的长枝木霉菌或权利要求5所述的组合物在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述植物病害为谷子纹枯病、谷瘟病、粟弯孢霉叶斑病、粟胡麻斑病和谷子穗腐病。
9.权利要求1所述的长枝木霉菌或权利要求5所述的组合物在抑制谷子病原真菌中的应用，其特征在于，所述真菌为谷子纹枯病菌（Rhizoctoniasolani）、谷瘟病菌（Pyricularia oryzae ）、粟弯孢霉病菌（Curvularia lunata）、粟胡麻斑病菌（Bipolaris setariae）和谷子穗腐病菌（Fusarium graminearum）中的一种或多种。
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