CN110184194A - 一株生防菌Simplicillium lamellicola JC-1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业微生物学技术领域，公开了一株生防菌Simplicillium lamellicola JC‑1及其应用，保藏编号为CCTCC NO：M2019246。Simplicillium lamellicola菌株或其发酵物滤液可有效抑制油菜上重要病原菌（核盘菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌、油菜黑胫病菌）菌丝生长。与目前使用化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点，具有广阔的应用前景。

Description

一株生防菌Simplicillium lamellicola JC-1及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一株生防菌SimplicilliumlamellicolaJC-1 及其应用。
背景技术
Simplicillium属在分类地位上属子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，粪壳菌纲(Sordariormycetes)，肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)，虫草科虫草科(Cordycipitaceae)。在21世纪初，Zare等将头孢霉属(Cephalosporium)、枝顶孢属(Acremonium)、轮枝孢属(Verticillium)中的部分菌种重新划分后建立的一个新属，即Simplicillium。有关Simplicillium属的相关报道国内外并不多，在中国更少。Simplicillium 属在国内还没有哪个权威机构给予一个确定的中文名称，段爱莉等在一篇报道中把 Simplicillium称作拟青霉属。目前，Simplicillium属真菌主要包括S.lamellicola、S. aogashimaense、S.lanosoniveum、S.chinense、S.obclavatum、S.cylindrosporum、S.subtropicum、 S.minatense和S.sympodiophorum等9个种，有关Simplicillium生物活性及代谢产物的相关研究国内外均鲜有报道。
Dang等报道了一株S.lamellicola BCP，在其发酵液中分离得到几种抗植物病原细菌的新型甘露糖脂质化合物，并可控制植物病害中的根瘤土壤杆菌和番茄上灰霉病菌。Keiko Takata等从真菌Simplicilliumsp.FKI-5985发酵液中分离得到两种活性物质，被命名为 AogacillinsA和Aogacillins B，这两种化合物能够克服阿贝卡星抗性，并能有效抑制对甲氧西林有耐药性的金黄色葡萄球菌MRSA。赵迪等从柞蚕蛹中分离出一株真菌Snef5，经过形态观察和分子鉴定，将该菌命名为Simplicillium chinenseSnef5。该菌株发酵液对植物线虫具有极强的抑制活性。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株Simplicillium lamellicola，所述的S.lamellicola的保藏编号为CCTCC NO：M2019246，分类命名：Simplicillium lamellicolaJC-1。
本发明的另一个目的在于提供了Simplicillium lamellicola的应用，所述菌株可用于制备生防菌剂或制备成植物种子包衣剂。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
本发明的Simplicillium lamellicola分离自湖北省赤壁市油菜角果上，申请人将其命名为 JC-1。该菌株已于2019年4月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019246，分类命名：Simplicillium lamellicola JC-1，地址：中国武汉武汉大学。菌落特性：
菌株JC-1在PDA培养基培养7天菌落直径为15～20mm，15天后，菌落直径为30～35mm。菌落圆形或扁圆形，白色，有同心环纹，质地为厚绒毛状，结构较致密，扩展分布，菌落背面呈微黄色(图1)。
Simplicillium lamellicola JC-1的应用，包括利用该菌株制备成植物病原菌的防治剂，或作为植物种子的包衣剂；所述的植物病原菌包括但不限于：灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
利用本发明提供的Simplicillium lamellicola JC-1可有效抑制油菜上重要病原菌(核盘菌、灰葡萄孢、黑胫病菌、立枯丝核菌)菌丝生长，且抑制效果都特别好。除此之外JC-1发酵物滤液还对油菜菌核病等有着很好的防病效果，且JC-1发酵物滤液对油菜无毒害作用。避免化学防治对环境和作物安全的潜在不良影响。
附图说明
图1为菌株JC-1菌落特点示意图(PDA，20℃，15d)。
图2为菌株JC-1形态特征示意图(PDA，20℃，7d)。
图3为菌株JC-1系统发育树(基于ITS-rDNA序列)。
图4为菌株JC-1与油菜黑胫病菌的对峙培养示意图。
图5为菌株JC-1与灰葡萄孢对峙培养示意图。
图6为菌株JC-1与油菜核盘菌的对峙培养示意图。
图7为菌株JC-1与立枯丝核菌的对峙培养示意图。
图8为菌株JC-1发酵液的生物量示意图。
图9为菌株JC-1发酵液的pH测定示意图。
图10为不同摇培时间发酵物滤液防治油菜菌核病示意图。
图11为不同摇培时间发酵物滤液防治油菜菌核病示意图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明实施例所涉及的技术方案，如未特别说明，均为本领域常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
Simplicillium lamellicolaJC-1的分离鉴定及生物学特性分析
一、菌株的分离及其生物学特性分析
申请人从湖北省赤壁市采集的腐生油菜角果，在腐生角果上的病健交界处剪切组织块，大小约为0.5cm×0.5cm；用75％乙醇、5％次氯酸钠分别处理1分钟，然后用无菌水连续清洗3次，每次3秒。然后将其转至含有25％乳酸的PDA培养基平板(含有80μL乳酸溶液(25％)中央，待植物组织在平板上凉干后，20℃恒温培养4天，最后将从病组织边缘长出来的真菌进行纯化，得到一株真菌，命名为JC-1。
二、菌株的形态学特征
(1)菌落特征
菌株JC-1培养7天菌落直径为15～20mm，15天后，菌落直径为30～35mm。菌落圆形或扁圆形，白色，有同心环纹，质地为厚绒毛状，结构较致密，扩展分布，菌落背面呈微黄色(图1)。
(2)显微观察结果
该菌株分生孢子梗着生于菌丝上，多为单生，分生孢子着生在梗之顶端；菌丝与分生孢子梗透明，孢子以粘连球状方式着生于分生孢子梗顶端，分生孢子梗细长，基部膨大，向上逐渐变细，孢子梗为单生、对生和轮生状(图2)。
三、菌株JC-1的分类属性鉴定
将培养7天的JC-1菌丝从铺有玻璃纸的PDA培养基上刮下，放至研钵，加入适量液氮后充分研磨，通过CTAB法提取JC-1菌株的总DNA，上述真菌的鉴定是基于内转录间隔区 l(ITS1)、5.8S rDNA、内转录间隔区2(ITS2)进行鉴定的。通过引物ITS1和ITS4对菌株的总DNA进行PCR扩增，所得到的序列在NCBI网站中进行BAST比对，鉴定结果为Simplicilliumlamellicola。测序结果利用DNAman软件进行格式化，选择两条引物(包含引物)之间的序列通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)程序与GenBank核酸数据库进行比对，获得鉴定信息。然后运用MEGA7.0软件的Maximum Likelihood计算方法进行系统进化树构建，重复计算1000次。通过进化树分析表明该菌株为Simplicillium lamellicola (图3)。
该菌株已于2019年4月10日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2019246，分类命名：Simplicillium lamellicola JC-1，地址：中国武汉，武汉大学。
在本发明中，Simplicillium lamellicola JC-1简写为JC-1菌株或SL。
实施例2：
Simplicillium lamellicola JC-1纯化及发酵培养
(1)菌株活化：将4℃冰箱保存的JC-1菌株斜面用无菌的接种针挑取一块，接种于PDA 培养基上，20℃恒温箱中培养7天。
(2)菌株培养：将步骤(1)中培养7天的JC-1菌株转接至新鲜的PDA培养基上，20℃恒温箱中培养7天。
(3)发酵：用无菌打孔器(直径6mm)将步骤(2)中的JC-1菌株菌落边缘打若干个菌饼，每100mL MCD培养液中接种5个菌丝块，150rpm、20℃分别振荡培养3天、6天、 9天和15天，分别收集不同天数发酵物滤液(4层纱布过滤即可)，用于以下实施例。
所述的MCD培养基为:40g葡萄糖，2g L-丙氨酸，1g KH2PO4·3H2O，0.5g MgSO4·7H2O， 0.5g KCl，10mg ZnSO4·7H2O，5mg CuSO4·5H2O，100μg硫胺素，10μg生物素d，水补足至1升。
实施例3：
Simplicillium lamellicolaJC-1对4种重要油菜病原菌的拮抗效果
本试验选取4种重要油菜病害的病原菌(油菜黑胫病菌、灰霉菌、核盘菌和立枯丝核菌) 和JC-1菌株进行对峙培养，来测定JC-1菌株的抑菌活性。
由于JC-1菌株生长速度缓慢，因此，提前在平板上接种JC-1菌株(已在PDA培养基上培养15天)，每个平板接种一块JC-1菌饼(直径6mm)，待JC-1菌落直径达2cm时，在距离JC-1菌丝块边缘5cm处接种灰霉菌、核盘菌和立枯丝核菌。这些菌接种体是从培养 2天的新鲜菌落边缘取得的，而油菜黑胫病菌是从培养7天的新鲜菌落边缘取的，所有菌丝琼脂块直径为6mm。
接种后的平板放置在20℃生化培养箱中黑暗培养，培养15天，分别在7天和15天测量4种重要油菜病害的病原菌的菌落大小和抑菌圈的宽度，以及4种重要油菜病害的病原菌对照的菌落大小。每个处理设置5次重复。根据公式计算抑菌率：
本试验通过JC-1菌株和油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa，简写为Lb)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea，简写为Bc)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum，简写为Ss)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani，简写为Rs)进行平板对峙培养，对四种病原真菌的抑制效果分别是44％(图4)、71％(图5)、71％(图6)、55％(图7)。尤其对灰葡萄孢和核盘菌抑制效果最好，能够达到71％。培养7天和培养15天的抑制效果没有明显的差异，抑菌的时效性很长，有着很大的生防潜力。
实施例4：
Simplicillium lamellicola JC-1发酵物滤液的制备及其抗真菌物质活性的测定
一、Simplicillium lamellicola JC-1发酵物滤液产生抗真菌物质的时间动态
分别在JC-1菌株摇培的第3天、6天、9天、12天和15天收集发酵物滤液(实施例2 所述方法)，测定pH值，所得菌丝烘干后称量菌丝干重，结果如表1所示(图8，图9)。
表1菌株JC-1发酵物滤液产生抗真菌物质的时间动态
在100mL发酵物滤液中加入2mL吐温，混匀后用棉签蘸取均匀的涂抹在新鲜的油菜叶片(采摘于华农试验田)上，用打孔器在培养2天的核盘菌菌落边缘打取菌饼(直径6mm)，然后接种在凃有发酵液的油菜叶片上。叶片事先成列摆在在白色瓷盘中，瓷盘中事先铺有若干层吸水纸，吸水纸用自来水浸湿。接种后，瓷盘用食品用透明保鲜膜覆盖，用以保持合适的湿度。放置在植物生长培养室中22℃培养3天。3天后测量围绕核盘菌菌丝块形成的叶片腐烂病斑的大小。摇培9天的JC-1发酵液对核盘菌的防病效果达到98.3％，摇培12天的防病效果达到100％(图10)，摇培9天之后获得的发酵物滤液的防病效果趋近于稳定。从 (表2)我们可以看出发酵物滤液处理和对照的病斑差异的显著性，在第6天就达到极显著的水平。从(图11)叶片的病斑大小，我们可以看到JC-1发酵物滤液有着很好的防病效果 (表2)，且对油菜叶片无损伤。
表2.JC-1菌株不同摇培时间的发酵物滤液生防效果测定

Claims (4)

1.一株分离的Simplicillium lamellicola，所述的Simplicillium lamellicola的保藏编号为CCTCC No.: M2019246，分类命名：Simplicillium lamellicolaJC-1。
2.权利要求1所述的Simplicillium lamellicola的发酵物滤液。
3.权利要求1所述的Simplicillium lamellicola或权利要求2所述的发酵物滤液在制备植物病原菌抑制剂中的应用，所述的植物病原菌包括：灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。
4.权利要求1所述的Simplicillium lamellicola或权利要求2所述的发酵物滤液在制备植物种子包衣剂中的应用。
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