CN111304100A - 一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用 - Google Patents

一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111304100A
CN111304100A CN202010195146.1A CN202010195146A CN111304100A CN 111304100 A CN111304100 A CN 111304100A CN 202010195146 A CN202010195146 A CN 202010195146A CN 111304100 A CN111304100 A CN 111304100A
Authority
CN
China
Prior art keywords
human umbilical
umbilical vein
vein endothelial
endothelial cell
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010195146.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111304100B (zh
Inventor
李启瑞
田婷婷
张旭
刘利利
龙庆德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou Medical University
Original Assignee
Guizhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou Medical University filed Critical Guizhou Medical University
Priority to CN202010195146.1A priority Critical patent/CN111304100B/zh
Publication of CN111304100A publication Critical patent/CN111304100A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111304100B publication Critical patent/CN111304100B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/066—Clavicipitaceae
    • A61K36/068—Cordyceps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供公开了涉及一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用。其特征在于该菌株编号为CH180672，分类为simplicillium lamellicola，保藏号CGMCC No.19145。本发明用高糖建立人脐静脉内皮细胞损伤模型；体外实验结果表明：该菌株与模型组相比，可以提高细胞存活率，降低细胞内ROS、MDA水平，升高超氧化物歧化酶SOD的水平；蛋白免疫印迹法可知，此真菌使Nrf‑2、HO‑1、NQO1的蛋白表达水平上调；可以改善由高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。

Description

一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用
技术领域
本发明涉及虫生真菌菌株发现及用于药理作用研究领域，具体涉及一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用。
背景技术
血管内皮细胞为一层连续覆盖血管腔表面的单层扁平上皮细胞，它对于发挥和维护心血管正常生理功能具有重要意义。由于血管内皮细胞和血液直接接触，多种病理因素（如吸烟、高血糖等）首先作用于内皮细胞，导致内皮功能障碍和代谢紊乱，表现出氧化应激增强、炎症介质及生长因子分泌增加等。氧化应激是指体内活性氧和活性氮的产生与抗氧化系统的清除能力失衡，导致ROS和RNS在体内大量蓄积，对体内的细胞和组织产生负面影响。表现为细胞产生病理形态，LDH,SOD,MDA等的分泌以及氧化应激相关蛋白的表达出现异常。进而引起或加重内皮功能障碍。核因子-红细胞2相关因子2Nrf2/抗氧化反应元件（ARE）信号是调控氧化应激反应的关键信号系统，高血糖可以诱导体内ROS产生，因此认为Nrf2与糖尿病及其并发症的发生、发展之间有着紧密关联，并有望成为极具前景的糖尿病干预新靶标。
经查文献可知，虫生真菌可以抗肿瘤、降血压、增强机体免疫力，为此我们在贵州采集虫生真菌进行菌种筛选，筛选具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株。
因此我们选择人脐静脉内皮细胞，用高糖建立内皮细胞损伤模型，发现编号为CH180672的虫生真菌，保藏号CGMCC No.19145对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用。
发明内容
本发明的发明目的在于:寻找出对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用的虫生真菌；同时证明虫生真菌在控制机体血糖方面有巨大的研究潜力。
本发明公开的真菌CH180672菌株，保藏号CGMCC No.19145具有较好的改善高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤。使用菌种DNA数据及部分形态学数据与其他菌种进行区分。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株，其特征在于该菌株编号为CH180672，分类为simplicillium lamellicola.已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Cultuer Collection Centre）”，保藏号CGMCC No.19145。保藏日期2019年12月5日。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
该菌株CGMCC No.19145的生理、生化、形态学特征描述如下：此菌株在PDA平板上呈棉絮状，菌落呈纯白色，菌丝生长较慢。
ITS DNA 序列：
CGCGCTGCTGTCCCAGTGCGAGGTTAAGTTACTACGCAGAGGTCGCCGCAACGGGCCGCCACTAAATTTCGGAGCCGGCGCGAGCTAGGCTCGATCGCCGCGCCCCAACACCGGCTTCTCGTCCGTAAAGACGTGAAGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTTTGCCTTTCGGCCACTCAGAAGAATACTGCTTTCGCAAAATCAAGAGTTTGTAGTCCCCGGCGGGCGCGTTGACCTGGGGCACCCGTGAGGGCGACACCAGCGCGTTCCGCCGAAGCAACGTAAGTGGTAAGGTTCACAAAGGGTTTGGGAGTTGTATAACTCGTTAA
本发明进一步公开了具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株在制备改善高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤药物方面的应用。实验结果显示:编号为CH180672，保藏号CGMCC No.19145虫生真菌对HG诱导的HUVECs氧化应激具有保护作用。
本发明更进一步公开了具有治疗作用的组合物，其特征在于：所述组合物中的有效成分为具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌，菌株保藏号CGMCC No.19145或其活性衍生物。
本发明公开的具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组成的药物组合物。该药物组合物可以制成固体口服制剂、液体口服制剂、注射剂等剂型。
本发明的具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌还可以通过非肠道形式给药。优选的非肠道给药形式为注射剂给药。所述固体及液体口服制剂包括：片剂、肠溶片、胶囊、糖浆剂、口服溶液剂、注射剂等等。
本发明的具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌相关药物组合物制备如下：使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。
本发明更加详细的描述如下：
1.情况介绍
我们选择人脐静脉内皮细胞，用高糖建立内皮细胞损伤模型，筛选到编号为CH180672的虫生真菌对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用。
2.材料与方法
2.1材料
材料与试剂
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）PDA的配制：取本品40.1g，加蒸馏水1000ml,加热煮沸溶解，经121℃，20min灭菌，冷却55℃倾注平板。
查氏培养基的配制：称取硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，加蒸馏水1000ml，加热煮沸溶解，装入250ml锥形瓶，每瓶120ml，经121℃，20min灭菌。
内皮细胞培养基（ECM）配制: 含5 %胎牛血清的100 mL完全培养基：取94mL无血清ECM培养基，加5mL血清（FBS），再加入双抗（P/S）和细胞生长因子（ECGS）各0.5mL，分装后4°C保存备用。
的配制：电子分析天平精确称取NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.2g置于2L的烧杯中，加入1000ml的三蒸水后，用玻璃棒充分搅拌直至全部溶解，配成终浓度为0.01mol/L的PBS。经高压蒸汽灭菌后，于4°C冰箱中保存备用。
胰蛋白酶溶液：精确称取EDTA粉末0.02 g于80 mL新配制的 PBS中，待其过夜后再精确称取胰蛋白酶粉0.25 g，玻璃棒轻轻搅拌混匀（避免产生气泡），PBS定容至100 mL，于超净台中用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，以10 mL/支分装至15 mL离心管中，封口，标记后置-20°C保存备用。
细胞蛋白裂解液：临用时RIPA裂解液、磷酸酶抑制剂与PMSF以99:1:1的比例混匀（注意动作轻柔，严禁产生气泡），置于冰上备用。
×SDS-PAGE电泳缓冲液：准确称取Tris 7.55 g，甘氨酸47 g，SDS 2.5 g，加ddH2O400mL充分溶解后定容至500mL，于4°C保存备用。
×SDS-PAGE电泳缓冲液：取5×SDS-PAGE电泳液200 mL加入800mL ddH2O中，充分混匀即可。
转膜缓冲液10×的配制：准确称取SDS 1.85 g，Tris碱29 g，甘氨酸14.6 g，加双蒸水充分融化，定容至500 mL，4°C保存备用。转膜时用dd H2O稀释成1×转膜液。
转膜缓冲液1×的配制：准确量取120mL的10×转膜液，840mL的dd H2O，240mL的甲醇，充分混匀即可。5%脱脂牛奶的配制：准确称取0.5g脱脂奶粉粉末，加入10mL PBS，置于摇床上混匀。10% 过硫酸胺(ammonium persulfate，APS)：按照SDS-PAGE凝胶快速配试剂盒中0.5 g APS，加入4mL双蒸水充分溶解后定容至5 mL，分装至标记好的1.5 mLEP管中，封口，-20°C冰箱保存备用。TBST（1×）：取TBST（10×）100 mL加入900 mL双蒸水中，再加入1mL 20%Tween-20，配制为TBST（1×），放入4°C保存备用。ECL发光液：临用现配，在避光环境中，按照1:1的比例，分别吸取Immobilon western化学发光试剂（Millpore）A液和B液各0.7 mL，将其混合均匀即可。
2.2方法
2.2.1 细胞培养
细胞的复苏：原代的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购置于中国北京裕恒丰生物技术代理公司，根据制造商的说明书，从超低温冰箱中取出人脐静脉内皮细胞立即于37°C水浴中使之迅速解冻，然后以1：2的比例将细胞悬液转入2个25cm2的培养瓶中，在每一个瓶子中补加内皮细胞培养基（ECM）至6ml，摇匀以后使细胞平铺于培养瓶底部，然后置于含有5%CO2、温度为37°C的培养箱中培养。
2.2.2 实验分组
实验共分为6组：即正常组（Control），甘露醇组（35mM），模型组（HG，35mM），CH低剂量组（16μg/L），CH高剂量组（32 μg/L），罗格列酮组（20μM）。待细胞长至85 % 密度左右，CH加入预保护1.5h后，再加入造模药，根据不同实验要求进行后续工作
2.2.3 ROS的检测
取对数生长期的细胞制成细胞悬液，以1×106的密度接种于96/24孔培养板中，待细胞生长至融合状态后，按照1.2.3中第一部分实验分组给药处理;按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10μm/L。除去细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA，加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于24孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于300μl。37℃细胞培养箱内避光孵育40min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA，再用PBS清洗3次，96孔板用酶标仪检测数值，24孔板用荧光显微镜拍照。
2.2.4 SOD检测
取对数生长期的细胞制成细胞悬液，以1×106的密度接种于培养瓶中，待细胞生长至融合状态后，按照1.2.3中第一部分实验分组给药处理；倒掉细胞培养液，用4℃或预冷的PBS洗涤一遍，按照每万细胞加入100-200微升的比例加入本试剂盒提供的SOD样品制备液，适当吹打以充分裂解细胞。收集被裂解的细胞在4℃，12000g离心3-5min,取上清作为待测样品，按说明书进行操作。
2.2.5 MDA检测
取对数生长期的细胞制成细胞悬液，以1×106的密度接种于培养瓶中，待细胞生长至融合状态后，按照1.2.3中第一部分实验分组给药处理；24h后按说明书操作。
2.2.6 蛋白免疫印迹法
2.2.6.1蛋白提取：不同给药处理后的细胞用冷的PBS润洗3次后，每个25cm2培养瓶中加入细胞裂解缓冲液（RIPA: PMSF=99: 1）45μL，放置于摇床上振摇20分钟，用细胞刮子将细胞从培养瓶底部刮下来，吸入2.0 mLEP管中，EP管置于温度为4℃、转速为12000rpm的条件下离心20min，吸取上清液于新的EP管中，随即放到-80oC冰箱中保存待用或者定量后再保存。
2.2.6.2蛋白定量：按二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒进行实验，操作步骤如下：
（1）在10mL的EP管中稀释BSA标准品：用与待测蛋白样品相一致的稀释液按下表逐步稀释BSA标准品：
Figure 918434DEST_PATH_IMAGE001
（2）配置BCA工作液：BCA工作液总体积=（BSA标准品样本个数+未知样本个数）×每个样本BCA工作液所需体积×复孔数。根据计算出的BCA工作液需要总体积，将试剂A和试剂B按照50：1的体积比，配制BCA工作液，充分混匀。
（3）定量测定：①按上表，将稀释好的A-G BSA标准品与待测蛋白样品各25μL分别加到已经做好标记的96孔板微孔中，每个浓度均做三个复孔。②每孔加入200μL BCA工作液，充分混匀，盖上96孔板盖，37°C孵育箱中孵育30min。③冷却至室温。④用酶标仪（ELx800,GE,USA）在570nm下测量OD值。⑤绘制标准曲线，并计算样品中的蛋白浓度。
2.2.6.3 免疫印迹分析
用浓度为6%-12%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对同量的（30-50μg）蛋白进行分离。电泳完成后将蛋白转移至PVDF膜（BIO-RAD 美国）。含有2%BSA的T-BST溶液封闭1h，然后分别用Nrf-2（1:1000）、HO-1（1：1000）、NQO1（1：1000）、GAPDH（1:7000）等多克隆兔抗体在4℃下孵育过夜，第二天将膜清洗3次，每次10min，之后用辣根过氧化物酶羊抗兔免疫球蛋白IgG（1:5000）对膜继续孵育2h，2h以后用TBST洗三次，膜使用ECL化学发光试剂盒进行显色，然后将膜置于Syngene凝胶成像系统进行曝光，随后用Syngeng软件对数字图像进行量化
3结果
3.1MTT检测活性菌株
如图1结果中当细胞给予高糖（HG）后，与正常组比较，模型组细胞活力显著下降（P<0.01），当给予CH提取物低高剂量后，与模型组（HG）相比，细胞活力显著上升（P<0.01），此结果说明CH提取物能提高由高糖诱导的人气静脉内皮细胞活力
3.2 CH180672对HG诱导的内皮细胞内ROS的影响
由图2 所示，与正常组相比，HG组的ROS含量显著上升，当给予CH提取物后，与HG组相比，ROS含量显著下降；又如图2荧光图所示，在模型组中，DCFH-DA探针检测到细胞产生大量荧光，当给予CH提取物后，荧光明显减弱，表明CH提取物可以减少高糖引起人脐静脉内皮细胞内ROS的增加。
3.3 CH180672对HG诱导的内皮细胞内MDA的影响
MDA含量可直接反应机体脂质过氧化的程度，间接反映细胞损伤程度；如图4所示，HG引起细胞脂质过氧化增加，当给药后MDA含量显著减少，说明CH提取物可以减少HG诱导的内皮细胞损伤。
3.4 CH180672对HG诱导的内皮细胞内SOD的影响
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)在需氧原核生物和真核生物中广泛存在,是活性氧清除系统中第一个发挥作用的抗氧化酶。结果显示，在模型组中，细胞内SOD含量显著下降，当给予CH提取物后其含量显著上升；
3.5 CH180672对HG诱导的人脐静脉内皮细胞中Nrf-2、HO-1、NQO1表达的影响。
核转录因子Nrf2作为氧化应激的感受器，是细胞氧化应激反应中的关键因子，在参与细胞抗氧化应激和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥重要的作用。Nrf2可激活血红素加氧化酶（HO-1）和醌氧化还原酶 (NQO1)大量表达，增加机体抵抗力，维持机体正常运转。HO-1和NQOl可以降低组织对氧化应激的敏感性，减少细胞损伤。由蛋白免疫印迹法显示，与正常l组相比，HG组的Nrf-2、HO-1、NQO1的蛋白表达下调，当给予CH提取物后，与HG组相比，Nrf-2、HO-1、NQO1的蛋白表达显著上调。
4讨论
虫生真菌具有广泛的生物活性，主要表现为对外界侵袭因素的防御作用和具有调节机体整体功能的功效。涉及抗微生物和抗肿瘤作用，调节机体的代谢与内分泌系统，对重要脏器和系统具有保护性作用，同时对机体功能具有激活作用，如抗疲劳雄性激素样作用；经野外采集与活性检测，编号为CH180672虫生真菌可改善高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。因此在此基础上，我们发现该菌株对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用。高糖引起人脐静脉内皮发生氧化应激，本实验通过检测ROS、MDA、SOD水平来评估虫生真菌提取物对HG诱导的人脐静脉内皮细胞的保护作用；MDA和SOD的水平可以反应细胞脂质过氧化的损伤程度和清除氧自由基的能力，前者是脂质过氧化反应的最终产物，间接反映机体氧化损伤的程度，后者是机体内清除系统中发挥抗氧化作用的关键酶,保护细胞免受氧化损伤。核转录因子Nrf2作为氧化应激的感受器，是细胞氧化应激反应中的关键因子，在参与细胞抗氧化应激和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥重要的作用。Nrf2可激活血红素加氧化酶（HO-1）和醌氧化还原酶 (NQ01)大量表达，增加机体抵抗力，维持机体正常运转。HO-1和NQOl可以降低组织对氧化应激的敏感性，减少细胞损伤和凋亡。一般情况下，Nrf2和细胞骨架相关蛋白Keapl等结合成二聚体存在于细胞胞浆中，使细胞的酶和抗氧化物处于基础稳定状态。当外界氧化应激刺激时，细胞胞浆中的Nrf2磷酸化转入细胞核，进而启动下游HO-1和NQO1的表达;WB实验证实了上述看法，如图5所示。上述实验均可以证明编号为CH180672虫生真菌对HG诱导的HUVECs氧化应激具有保护作用。
因本，实验采用高糖建立人脐静脉内皮细胞损伤模型，用高糖模拟糖尿病这一大环境下进行的研究得出编号为CH180672虫生真菌对HG诱导的HUVECs氧化应激具有保护作用，因此由实验数据可以得知其菌株在防治糖尿病这一方面具有巨大的研究潜力。
附图说明
图1为CH180672对HG诱导的人脐静脉内皮细胞活力的影响；注：##P<0.05 vsControl; *P>0.01 vs HG; **P<0.01 vs HG; N.SP>0.05 vs Control；
图 2为CH180672对HG诱导的人脐静脉内皮细胞内ROS的影响；注：##P<0.05 vsControl; *P>0.01 vs HG; **P<0.01 vs HG; N.SP>0.05 vsControl；
图 3为CH180672对HG诱导的人脐静脉内皮细胞内MDA的影响；注：#P<0.01vs Control;*P>0.01 vs HG; N.SP>0.05 vs Control；
图4为CH180672对人脐静脉内皮细胞内SOD的影响；##P<0.05 vs Control; **P<0.01vs HG; N.SP>0.05 vs Control；
图5为 CH180672对人脐静脉内皮细胞内蛋白表达的影响；注：##P<0.05 vs Control;**P<0.01 vs HG; N.SP>0.05 vs Control；(P<0.05有差异，P<0.01有显著性差异，P>0.05无差异)；
图6为该菌株CGMCC No.19145的生理生化特性图。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售；本发明所用到的菌株来源：分离自野外采集的标本。
实施例1
(1)虫生真菌采集与菌种分离。在贵州省采集虫生真菌并使用单孢分离法分离虫生真菌纯菌株。
(2)虫生真菌提取物的获得：将获得的虫草菌株接种到查氏培养基中，查氏培养基的配制：称取硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，加蒸馏水1000ml，加热煮沸溶解，装入250ml锥形瓶，每瓶120ml，经121℃，20min灭菌。将其在恒温摇床上培养5天，再静置15天，20天后将发酵的菌丝用超声破碎仪破碎，然后发酵液与乙酸乙酯用量为1：1进行萃取，回收乙酸乙酯部位，得提取物843.5g。
（3）虫生真菌粗提物保护人脐静脉内皮细胞损伤活性检测：取3-6代生长良好的细胞，用细胞传代的方法将细胞制成细胞悬液，然后再以每孔1×104个/ml的细胞密度接种于96孔板中，每孔加入100μl，在板四周每孔加100μl无菌PBS，细胞生长到基本融合后，弃掉旧培养液，每孔再加入无血清ECM 进行同步化，板四周每孔加入无菌PBS100μl，待细胞饥饿7-8h后，弃掉无血清培养基。空白对照组加100μl无血清ECM，模型组和其他组分别加无血清ECM和不同浓度的CH提取物（16μg/L，32μg/L）90μl预保护1.5h后再加入HG（35mM）10μl共同孵育24h，24h后各孔加入浓度为5mg/mL的MTT 20μl，将板置于37℃培养箱中继续培养4h，4h以后将板拿出甩掉上清液，每孔加150μL DMSO溶解沉淀物，在摇床上振摇10min以后将板于酶标仪（ELx800，GE，USA）490nm条件下测光密度（OD）值。结果显示，虫生真菌CH可提高细胞活性。
实施例2
以具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株，保藏号CGMCC No.19145作为活性成分，加入药学可接收的辅料按常规方法可制成各种规格的液体注射剂。
（1）注射剂的制备：
虫生真菌提取物（CH180672， CGMCC No.19145）200 mg，甘露醇700 mg，PEG3000 10mg，蒸馏水100 ml，使pH值为7.0-7.5过滤滤液浓度为3mg/ml，按每安瓶2毫升分装，冷冻干燥后即得注射剂。
（2）片剂的制备：
虫生真菌提取物（CH180672，CGMCC No.19145）10 mg ，微晶纤维素 35 mg，淀粉 45mg，聚乙烯吡咯烷酮 4 mg，羧甲基淀粉钠盐4.5 mg，硬脂酸镁 0.5 mg，滑石粉1 mg；将阿魏酸水合物活性成分，淀粉和纤维素过筛，并充分混合，将聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉混合，过筛，制得湿颗粒于50℃干燥，将羧甲基淀粉钠盐，硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片。
（3）胶囊的制备
虫生真菌提取物（CH180672，CGMCC No.19145）10 mg，活性成分辅料分别过100目筛，称取处方量的主药和辅料充分混合，加入羟丙甲纤维素溶液适量制软材，过24目筛，制得湿颗粒于50-60℃烘箱中干燥约2-3小时，将硬脂酸镁和滑石粉与颗粒混合均匀，整粒，测定中间体含量，用2号胶囊灌装。
序列表
<110> 贵州医科大学
<120> 一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 490
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cgcgctgctg tcccagtgcg aggttaagtt actacgcaga ggtcgccgca acgggccgcc 60
actaaatttc ggagccggcg cgagctaggc tcgatcgccg cgccccaaca ccggcttctc 120
gtccgtaaag acgtgaagtc gagggttgaa atgacgctcg aacaggcatg cccgccagaa 180
tgctggcggg cgcaatgtgc gttcaaagat tcgatgattc actgaattct gcaattcaca 240
ttacttatcg cattttgctg cgttcttcat cgatgccaga accaagagat ccgttgttga 300
aagttttgat tcatttgttt ttttgccttt cggccactca gaagaatact gctttcgcaa 360
aatcaagagt ttgtagtccc cggcgggcgc gttgacctgg ggcacccgtg agggcgacac 420
cagcgcgttc cgccgaagca acgtaagtgg taaggttcac aaagggtttg ggagttgtat 480
aactcgttaa 490

Claims (4)

1.一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株，其特征在于该菌株编号为CH180672，分类为simplicillium lamellicola，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.19145。
2.一种具有治疗作用的组合物，其特征在于：所述组合物中的有效成分为具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株，保藏号CGMCC No.19145或其活性衍生物。
3.权利要求1所述的具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株在制备改善高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤药物方面的应用。
4.权利要求3所述的应用，其中改善高糖引起的人脐静脉内皮细胞损伤指的是：虫生真菌提取物可改善HG诱导的内皮细胞损伤。
CN202010195146.1A 2020-03-19 2020-03-19 一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用 Expired - Fee Related CN111304100B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010195146.1A CN111304100B (zh) 2020-03-19 2020-03-19 一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010195146.1A CN111304100B (zh) 2020-03-19 2020-03-19 一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111304100A true CN111304100A (zh) 2020-06-19
CN111304100B CN111304100B (zh) 2022-03-04

Family

ID=71145852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010195146.1A Expired - Fee Related CN111304100B (zh) 2020-03-19 2020-03-19 一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111304100B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012070891A2 (ko) * 2010-11-24 2012-05-31 주식회사 그린바이오텍 심플리실리움 라멜리콜라 ｂｃｐ 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법
CN110184194A (zh) * 2019-04-16 2019-08-30 华中农业大学 一株生防菌Simplicillium lamellicola JC-1及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012070891A2 (ko) * 2010-11-24 2012-05-31 주식회사 그린바이오텍 심플리실리움 라멜리콜라 ｂｃｐ 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법
CN110184194A (zh) * 2019-04-16 2019-08-30 华中农业大学 一株生防菌Simplicillium lamellicola JC-1及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TEAK SOO SHIN等: "Development of a Biofungicide Using a Mycoparasitic Fungus Simplicillium lamellicola BCP and Its Control Efficacy against Gray Mold Diseases of Tomato and Ginseng", 《THE PLANT PATHOLOGY JOURNAL》 *
董庆霖等: "真菌Simplicillium lanosoniveum抗生素的分离纯化和初步表征", 《食品工业科技》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111304100B (zh) 2022-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5462268B2 (ja) エポチロングリコシド類化合物とそれを活性成分とする配合物及びその応用
CN113402509B (zh) 一组美沙达唑类化合物及其制备方法和应用
CN111304100B (zh) 一株具有保护人脐静脉内皮细胞损伤的虫生真菌菌株及应用
Jordan et al. On the cytology and synthetic capacities of natural and artificially produced bacteroids of Rhizobium leguminosarum
CN111150740A (zh) 竹节参中的降脂活性成分和降脂组合物及其应用
CN106924236A (zh) 莪术醇在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
CN113073071B (zh) 一株假小链双歧杆菌及其在代谢综合征中的应用
CN107213160A (zh) Nadph在拮抗药物致线粒体毒性中的应用
CN106924252A (zh) 8-丙二酸二乙酯小檗碱在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
CN111690024B (zh) 马钱苷衍生物类环烯醚萜化合物及其提取方法和应用
CN115040502B (zh) 一种海洋曲霉菌来源化合物的应用
Naik et al. Presence of Candida albicans in normal and in Giardia lamblia infected human jejunum
CN103694248B (zh) 从藤黄中提取的抗肿瘤化合物及其制备方法与用途
US6248367B1 (en) Bovine excretion extracts having anticancer and anti-inflammatory activity and process for preparing the same
CN115105488B (zh) Dankasterone A在制备治疗肝纤维化药物中的应用
CN115990162B (zh) 4-羟基-2-吡啶酮生物碱在制备治疗胃癌药物中的应用
CN106806364A (zh) 二乙酰基大花旋覆花内酯在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
CN106852926A (zh) 罗汉果皂苷元在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
CN105907650B (zh) 一种名和氏球腔菌菌株及其应用
CN111690023B (zh) 马钱苷乙酰化衍生物类环烯醚萜化合物及其提取方法和应用
CN106806362A (zh) 去氢灯心草二酚在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
CN106924243A (zh) 梣酮在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
CN106902101A (zh) 干巴菌素在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用
CN105663120A (zh) 青蒿烯在制备抗肿瘤药物中的应用
CN116919974A (zh) Physagulin C在制备治疗肝纤维化药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220304

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee