CN105907650B - 一种名和氏球腔菌菌株及其应用 - Google Patents

一种名和氏球腔菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

一种名和氏球腔菌菌株及其应用。本发明提供一种新型的名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJLQ129保藏名称为：Mycosphaerella nawae ZJLQ129，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2015年9月9日，保藏号：CCTCC NO：M2015517。本发明还提供该菌株的用途，该菌株能产生一种具有免疫抑制作用的次生代谢产物球腔菌素(‑)mycousunine。

Description

一种名和氏球腔菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说是公开一种内生真菌名和氏球腔菌菌株ZJLQ129，及其应用，以及名和氏球腔菌菌株ZJLQ129产生代谢产物二苯并呋喃类化合物球腔菌素(-)mycousunine，该化合物具有免疫抑制作用。
背景技术
植物内生真菌(Plantendophyticfungi)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在症状，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。植物微生物系统中的内生真菌，广泛存在于植物组织内，不受外界环境的影响。植物内生真菌是植物微生物系统中的天然组成成分，在进化过程中与植物寄主建立了和谐的共生关系，，其次生代谢产物十分丰富。植物内生真菌几乎存在于所有目前已研究过的植物中，分布广，种类多。研究表明，感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比未感染植株更具生存竞争力。在内真生菌-植物宿主-食草动物生态系统中，植物内生真菌扮演着前所未知的重要生态学作用。发挥这些作用的物质基础是内生真菌产生的丰富多样的次生代谢产物，它们具有多种生物活性，在农业和(或)医药业中具有重要的应用潜力。近年来，随着美国科学家A.Stierle在太平洋短叶杉上发现了抗肿瘤药物紫杉醇的产生菌，药用植物和濒危植物内生真菌及其活性物质的研究成为了药物开发的重要方向。我国植物资源十分丰富，对其内生真菌的研究将有利于微生物药物的开发和珍稀植物资源的保护。
植物内生真菌作为与植物共生的真菌，其在与植物共生的过程中，发展拥有与普通致病菌不同的天然代谢产物。分离植物中存在的新的内生真菌，探索该菌的次生代谢产物活性，并将其次生代谢产物纯化制作成天然药物，是一个新的开发方向。比如，来源于化学或者天然植物或微生物中的免疫抑制剂，常用的主要有五类：(1)糖皮质激素类，如可的松和强的松；(2)微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；(3)抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；(4)多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；(5)烷化剂类，如环磷酰胺等。其中，微生物酵解作为主要合成方法，已有多种产品，如环孢菌素CsA类、他克莫司Tacrolimus(FK506)、雷帕霉素Rapamycin(RPM)及其衍生物SDZ RAD、Mizoribine(MZ)等。以环孢菌素为例，七十年代后期瑞士的Borel发现了一种从霉菌酵解产物里提取的一种只含11个氨基酸的环形多肽，取名为环孢素(CsA)，可以有效地特异性抑制淋巴细胞反应和增生。对T细胞，尤其是TH细胞有较好的选择性抑制作用，而对其他的免疫细胞的抑制作用则相对较弱，因此在抗器官移植排斥中取得了很好的疗效；也用于自身免疫病的治疗，因此是一种具有很高临床使用价值的免疫抑制剂。经10年的临床试验应用研究证实其抗排斥反应作用较其他药物强而且副作用小的多。故于八十年代末被批准正式注册投入市场应用。CsA近20年的临床应用显示了神奇的效果，使得除小肠移植外，肝、肾、心及心/肺、胰移植的病人/移植物一年存活率达70-85％，而在此之前仅30-50％。CsA相关性神经毒性症状的发生率大约为10-28％，是影响患者预后的一种较为重要的因素。轻度以头痛、肢体震颤、感觉障碍等多见，中度以视力障碍为主。CsA相关神经毒性的重症表现发生率极低。
植物内生真菌作为与植物共生的真菌，其在与植物共生的过程中，发展拥有与普通致病菌不同的天然代谢产物。分离植物中存在的新的内生真菌，探索该菌的次生代谢产物活性，是一个新的开发方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型的名和氏球腔菌Mycosphaerellanawae ZJLQ129及其用途，该菌株能产生一种具有免疫抑制作用的次生代谢产物球腔菌素(-)mycousunine。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种名和氏球腔菌：保藏名称为：Mycosphaerella nawae ZJLQ129，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2015年9月9日，保藏号：CCTCC NO：M2015517。
本发明还同时提供了上述名和氏球腔菌菌株的用途，其特征是：产生次生代谢产物球腔菌素(-)mycousunine。优选的，该球腔菌素(-)mycousunine化合物具有免疫抑制活性。更为优选的，在10μM浓度球腔菌素(-)mycousunine下，免疫抑制率达51.28％。
本发明的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae ZJLQ129CCTCCNO：M2015517)具有如下特性：PDA培养基上生长缓慢，20-25d菌落直径为2-3cm，60-66d菌落直径为3-4cm，生长速率减小。PDA培养基上于25℃，12小时黑暗交替培养，菌落呈不规则形，无气生菌丝，菌丝初期为灰色，后期变为灰黑色，背面和正面均有皱折，菌落边缘不整齐，无色素分泌；子囊座为黑色，不产生孢子，菌丝有隔膜。
本发明的菌株是从植物菝葜中分离得到的，名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae ZJLQ129CCTCC NO：M2015517)，它属于真菌界(Fungi)，双核亚界(Dikarya)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，子囊菌纲(Ascomycetes)，盘菌目(Pezizales)，盘菌科(Pezizaceae)，球腔菌属(Mycosphaerella)。
本发明中说指的免疫抑制：是指对于免疫应答的抑制作用，或者说是对机体的免疫反应具有抑制作用。免疫抑制剂能抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能，能降低抗体免疫反应。在实验过程中，免疫抑制作用可通过测定刀豆蛋白A诱导的T细胞增殖的抑制率体现。
附图说明
图1为化合物(1)球腔菌素(-)mycousunine结构式。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1、名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJLQ129的分离培养与鉴定：
在实验室中按下列条件和步骤分离培养，即可获得本发明所述的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129：
1)从我国浙江龙泉自然保护区采集，将采集的拔葜叶子用浓度0.5％(w/v)的次氯酸钠进行表面消毒10min，然后无菌水漂洗后置于无菌滤纸上吸干水。菝葜，也称金刚藤，百合科菝葜属，多年生藤本落叶攀附植物。生于山坡林下，分布于中国长江以南各地，攀援灌木，叶薄革质或坚纸质，干后通常红、褐色或近古铜色，圆形、卵形或其他形状，长3-10厘米，宽1.5-6(-10)厘米，下面通常淡绿色，较少苍白色；叶柄长5-15毫米，约占全长的1/2-2/3具宽0.5-1毫米(一侧)的鞘，几乎都有卷须，少有例外，脱落点位于靠近卷须处，根状茎粗厚，坚硬，为不规则的块状，粗2-3厘米。茎长1-3米，少数可达5米，疏生刺。
2)用无菌刀片把表面消毒过的菝葜叶子切成1cm左右大小的组织片，将组织片移接在含100μg/ml氨苄青霉素和链霉素的2％(w/v)水琼脂平板上，光照培养箱中培养，培养条件：25℃，16小时光照，8小时黑暗；
3)待菌丝长出后，将单菌丝顶端移接到PDA固体培养基上培养，25℃培养。连续纯化3次，获得纯培养。其中上述培养基或培养液的成分如下：PDA培养基：即马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar)去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20min，以纱布滤去固体残渣，滤液加水补足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解，再加入15g溶化的琼脂粉，分装，121℃灭菌20min备用。
本发明的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae ZJLQ129CCTCCNO：M2015517)具有如下特性：PDA培养基上生长缓慢，20-25d菌落直径为2-3cm，60-66d菌落直径为3-4cm，生长速率减小。PDA培养基上于25℃，12小时黑暗交替培养，菌落呈不规则形，无气生菌丝，菌丝初期为灰色，后期变为灰黑色，背面和正面均有皱折，菌落边缘不整齐，无色素分泌；子囊座为黑色，不产生孢子，菌丝有隔膜。名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae ZJLQ129CCTCC NO：M2015517)，它属于真菌界(Fungi)，双核亚界(Dikarya)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，子囊菌纲(Ascomycetes)，盘菌目(Pezizales)，盘菌科(Pezizaceae)，球腔菌属(Mycosphaerella)。
4)菌种鉴定：将ZJLQ129进行beta-tubulin基因测序，并利用BLAST程序进行比对，利用PAUP程序进行系统发育分析。
将菌株菌丝在液氮中研成粉末，取100mg粉末装于1.5mL离心管中，采用DNeasyPlant Mini Kits(QIAGEN)按厂商的程序提取基因组DNA。采用通用引物BT1(5'-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3')和BT22(5'-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3')扩增beta-tubulin基因，PCR体系：DNA模板(100ng/μL)5.0μL，10×PCR缓冲液(含25mmol/L MgCl2)5.0μL，dNTPs(5mmol/L)1.0μL，引物(50μg/mL)各0.5μL，Taq DNA聚合酶(2U/μL)1μL，加水补足50μL，混匀后在BIORAD公司S1000型号的PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，53℃50s，72℃90s，35个循环；72℃10min。
PCR扩增产物用Axygen柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化。纯化的ITS rDNA PCR扩增产物分别用扩增引物对ITS1和ITS4测序，纯化的beta-tubulin扩增产物测序。测序由上海生工生物工程服务有限公司完成。测得的序列在GenBank上进行BLAST搜索。基于BLAST结果，用软件Clustal X 1.81将菌株ZJLQ129的序列与GenBank上球腔菌属的相关序列进行比对，然后进行系统发育分析。以上结果表明菌株ZJLQ129可以定名为名和氏球腔菌Mycosphaerella nawae。
实施例2、球腔菌素(-)mycousunine的制备和结构鉴定
1)名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJLQ129发酵培养，依次进行以下步骤：
将ZJLQ129菌饼(直径为0.5厘米)共10个接入500ml PDB中于25℃，200转/小时摇床上培养10天，培养液在无菌条件下粉碎，加入500ml PDB中培养，每瓶接入菌丝液25ml，共接40瓶即20L，于室温下静置培养2周后过滤分别获得发酵液与菌丝体。其中发酵液用乙酸乙酯萃3次后萃取液浓缩得浸膏1.72g(A部分)，菌丝体用丙酮浸泡过夜后浓缩至至小体积，获得浸膏1.76(B部分)。合并二部分得浸膏3.5g(C部分)。
其中上述培养基或培养液的成分如下：
PDA培养基：即马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar)去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20min，以纱布滤去固体残渣，滤液加水补足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解，再加入15g溶化的琼脂粉，分装，121℃灭菌20min备用。
PDB培养液：即马铃薯葡萄糖(potato dextrose broth)：去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸20min，以纱布滤去固体残渣，滤液加水补足至1000mL，加入20g葡萄糖溶解，分装，121℃灭菌20min备用。
2)化合物的制备：
取上述浸膏C 3.5g加15g硅胶拌样，旋转蒸发仪蒸干。另外，用200-300硅胶950克干法装柱，将拌样后的样品上样后进行柱层析分离，依次用石油醚：乙酸乙酯4:1(v/v)，石油醚：乙酸乙酯3:2(v/v)，石油醚:乙酸乙酯3:7(v/v),乙酸乙酯，乙酸乙酯：甲醇4:1(v/v)分别进行梯度洗脱分离，每500ml接收1个流分，共接收31个流分，将接收的样品进行硅胶薄层层析，以茴香醛显色剂显色后，将Rf值为0.46且茴香醛喷雾显色为蓝色的流分合并，获得Fr8这一部分。茴香醛显色剂的配方如下：茴香醛(对甲氧基苯甲醛)1：广谱。配制方法：135乙醇+5mL浓硫酸+1.5mL of冰醋酸+3.7mL茴香醛，剧烈搅拌，使混合均匀。茴香醛(对甲氧基苯甲醛)2：萜烯，桉树脑(cineoles)，withanolides，出油柑碱(acronycine)。配制方法：茴香醛:HClO4:丙酮:水(1:10:20:80)。Fr8部分(Rf值＝0.46)共1.70g采用凝胶柱层析分离纯化，以氯仿：甲醇1:1(v/v)为洗脱机洗脱反复分离，硅胶薄层层析检测，以茴香醛显色剂显色后，合并组分相同的流分，最终获得纯品300mg，记为化合物(1)。化合物(1)是从名和氏球腔菌株ZJLQ129中分离获得的代谢产物。
3)化合物(1)球腔菌素(-)mycousunine的鉴定过程如下：
化合物(1)，见图1，黄色针晶，mp 86-89℃(MeOH)；HRESIMS m/z:376.1158M+(calcd for C19H20O8 376.1158)1H NMR(400MHz,CDCl3),3.17(1H,d,J＝18Hz,H-4a),3.31(1H,d,J＝18Hz,H-4b),1.63(3H,s,H-10),2.56(3H,s,H-12),2.59(3H,s,H-14),2.04(3H,s,H-15),3.54(3H,s,H-16).13C NMR(100MHz,CDCl3)197.7(s,1-C),110.7(s,2-C),194.6(s,3-C),37.9(t,4-C),51.3(q,4a-C),156.6(s,5a-C),101.8(s,6-C),163.4(s,7-C),107.2(s,8-C),159.1(s,9-C),105.3(s,9a-C),59.8(s,9b-C),17.3(q,10-C),202.4(s,11-C),27.4(q,12-C),201.0(s,13-C),31.2(q,14-C),7.2(q,15-C),51.3(q,C-16)。化合物(1)的分子量与核磁共振氢谱与碳谱数据与松萝酸很相似，说明该化合物为二苯并呋喃类化合物。化合物1比松萝酸多了一个甲氧基(δC 51.4，δH3.56,s 3H)，一个ABq亚甲基(δC 37.9，δH 3.17d,J＝18.0,δH 3.31d,J＝18.0)，但少了一个苯环叔碳及对应氢质子信号(δC98.2，δH 5.98,s 1H)，说明化合物1的4a位被甲氧基取代，而4号位为亚甲基，化合物(1)的1H NMR及13C NMR与文献中(-)-mycousnine的数据一致，因此将化合物(1)鉴定为(-)mycousnine，中文名球腔菌素。
实施例3：化合物(1)球腔菌素(-)mycousnine的免疫抑制活性测定：
经测定，该化合物(1)球腔菌素(-)mycousnine在10μM剂量下对刀豆蛋白A诱导的T细胞增殖的抑制率是51.28％，表现为较明显的免疫抑制活性。
1、主要仪器：MCO-15AC型细胞培养箱，日本三洋公司；SpX-250B-Z生化培养箱，上海博讯实业有限公司；1700型电子天平，德国Sartorius公司；SW-CJ-1F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LD5-2A型离心机，北京医用离心机厂；1-13型离心机，德国SIGMA公司；MH-1型微量振荡器，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；synergy-2SLFPA全波长多功能酶标仪，美国BioTek公司；XDS-1B型生物倒置显微镜，重庆光学仪器厂。
2、实验动物来源：雌性SPF级C57BL/6小鼠，6周龄，18-22g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物购得后饲养一周，适应环境后再进行实验。实验动物的处理程序按照浙江省医学科学院实验动物福利伦理委员会的规定执行。
3、试剂:RPMI 1640细胞培养液购于Thermo Fisher公司，临用前加入100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％小牛血清配制成完全培养液；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)、噻唑蓝(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-3，5-dipenyltetrazolium bromid，MTT)、台酚蓝、二甲基亚砜溶液(DMSO)购自Sigma公司；40μm孔间细胞滤网购自Biologix公司；青霉素和链霉素溶液、Hank’s液购自江苏碧云天生物技术研究所。
4、供试品化合物(1)球腔菌素(-)mycousnine配制：化合物(1)球腔菌素(-)mycousnine纯度>99％。化合物(1)先以DMSO溶解为50mM浓度，-20℃冷冻保存。临用前再采用RPMI1640细胞培养液稀释至相应浓度。稀释液中DMSO的含量≦0.2％，对细胞的生物活性没有影响。
5、单个脾细胞悬液制备：小鼠无菌取脾，研磨后，加适量Hank’s液混悬，以40μm孔间细胞滤网滤过，1500rpm离心5分钟，弃上清，加Hank’s液重复洗涤2次。收集脾细胞，加RPMI1640完全培养液混悬制成单个脾细胞悬液。以0.4％台酚蓝拒染法记数，活细胞数不少于95％。
6、Con A诱导的T细胞增殖实验测定：于96孔平底培养板中，每孔加100μL脾细胞悬液(5×10 6cell/ml)，并加入50μl Con A溶液(2μg/ml)，最后加入不同浓度(0nM、16nM、80nM、400nM、2μM和10μM)供试药物球腔菌素(-)mycousnine的稀释液50μl，每个浓度重复4孔，另设正常细胞对照孔。37℃，5％CO2培养44小时后，各孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μl，继续培养4h。离心(1800rpm，5min)，弃去各孔上清，分别加酸性DMSO溶液(4％1N HCl)150μl，避光振荡15min，测定OD 490nm，以Con A作用孔(药物浓度0)的增殖率计为100％，计算药物作用后的相对细胞增殖率。MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。MTT法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞增殖数量，OD值越大，细胞活性越强，增值率越高。如表一所示，左边的剂量，数值为Blank的为空白背景组，0、16、80、400、2000和10000分别代表不同浓度0nM、16nM、80nM、400nM、2μM和10μM的球腔菌素(-)mycousnine加入，其中0nM球腔菌素(-)mycousnine作为对照组，在16nM浓度下，抑制率为17.95％；在80nM浓度下，抑制率为12.82％；在400nM浓度下，抑制率为17.95％；在2μM浓度下，抑制率为17.95％；在10μM浓度下，抑制率达51.28％，表现出较好的免疫抑制活性。抑制率(Inhibitory％)计算依据：(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白OD值)×100％
表一：Con A诱导的T细胞增殖实验测定
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种名和氏球腔菌菌株，其特征是：保藏名称为：Mycosphaerella nawae ZJLQ129，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2015年9月9日，保藏号：CCTCC NO：M2015517。
2.根据权利要求1所述的名和氏球腔菌菌株，其特征是：所述名和氏球腔菌菌株属于真菌界，双核亚界，子囊菌门，盘菌亚门，子囊菌纲，盘菌目，盘菌科，球腔菌属。
3.根据权利要求2所述的名和氏球腔菌菌株，其特征是：所述名和氏球腔菌菌株在PDA培养基上生长缓慢，20-25d菌落直径为2-3cm，60-66d菌落直径为3-4cm；PDA培养基上于25℃，12小时黑暗交替培养，菌落呈不规则形，无气生菌丝，菌丝初期为灰色，后期变为灰黑色，背面和正面均有皱折，菌落边缘不整齐，无色素分泌；子囊座为黑色，不产生孢子，菌丝有隔膜。
4.权利要求1-3中任一名和氏球腔菌菌株的用途，其特征是：所述名和氏球腔菌菌株产生次生代谢产物球腔菌素。
5.根据权利要求4所述的名和氏球腔菌菌株的用途，其特征是：所述的球腔菌素具有免疫抑制活性。
6.根据权利要求5所述的名和氏球腔菌菌株的用途，其特征是：所述的球腔菌素在10μM浓度下免疫抑制率为51.28％。
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