CN105936886B - 一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105936886B
CN105936886B CN201610560361.0A CN201610560361A CN105936886B CN 105936886 B CN105936886 B CN 105936886B CN 201610560361 A CN201610560361 A CN 201610560361A CN 105936886 B CN105936886 B CN 105936886B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pear
bacterial strain
rot
soft rot
bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610560361.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105936886A (zh
Inventor
武利勤
尚宏忠
顾海科
王青
刘桂君
周思静
王平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING RADIATION CENTER
Original Assignee
BEIJING RADIATION CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING RADIATION CENTER filed Critical BEIJING RADIATION CENTER
Priority to CN201610560361.0A priority Critical patent/CN105936886B/zh
Publication of CN105936886A publication Critical patent/CN105936886A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105936886B publication Critical patent/CN105936886B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
    • A23B7/153—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of liquids or solids
    • A23B7/154—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B7/155—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用。本发明从表面灭菌的霍山石斛根中分离获得一株内生甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)，该菌株对多种植物病原菌具有广谱抗性，对由轮纹病和软腐病引起的梨果实腐烂具有良好的防治效果。作为生防菌的植物内生菌具有广谱抗菌性和高效的安全性等优势，对梨果实安全；大规模生产原料成本低，操作方便，防治效果稳定，能有效解决梨果实病害农药防治所带来的农药残留和环境污染问题。在梨采后病害的生物防治方面具有巨大的应用潜力，为研制和开发微生物农药提供了优良的基础菌株。

Description

一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用。
背景技术
梨是我国栽培历史久、面积大、产量高的果树之一。据统计梨是我国第3大水果，目前全国总面积达100多万公顷，年产量800多万吨，分别占全世界梨栽培面积和产量的62％和52％。梨果实在生长发育及贮藏期间，时刻会受到病害的威胁，其中轮纹病(Botryosphaeria dothidea)是最严重的果实真菌病害之一，是造成梨果实烂果的主要原因。由于轮纹病菌是在幼果期潜伏侵染，在果实成熟及贮运期间发病，控制和防范都有很大困难。梨软腐病主要由匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)和梨形毛霉(Mucor piriformis)引起，主要危害梨果实，一般零星发生，但是果实伤口多、贮藏期温度高时发生较重。高温时，5-6天内可使病果全部软腐。
新鲜水果采后腐烂是一个全球性的问题。我国每年因为梨轮纹病危害造成梨果减产约25％，严重时烂果率高达80％以上，造成巨大经济损失。目前生产上常采用化学药剂防治梨采后病害，这样不仅严重污染生态环境，而且增加农产品中有毒化学物质的残留量，对人类健康带来潜在危害，同时也易诱致病原菌抗药性的产生。
生物防治利用物种间的拮抗作用来减少病害的发生，对人畜安全、环境兼容性好、病虫害不易产生抗药性，因而具有化学杀菌剂不具有的优势，正逐步成为代替化学杀菌剂的最佳方式。获得高效拮抗菌是生物防治的基础。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是最早被报道用来防治柑橘病害的细菌(Gutter and Littauer，1953)。随着研究的深入，人们已筛选并报道多种对果蔬采后病害具有防治效果的拮抗菌，主要是酵母菌、芽胞杆菌、假单胞菌和木霉菌。几株微生物拮抗菌已经被授权专利并商业应用，如Biosave(Pseudomonassyringae，USA)、“Shemer”(Metschnikowia Fructicola，Israel)、Serenade(Bacillussubtilis，USA)和Candifruit(Candida sake，Spain)。微生物拮抗菌可以产生具有高拮抗活性的广谱抗菌物质，具有极强的抗逆能力，同时具有无毒、无残留、无致病性、对人畜安全、环境相容性好，满足了消费者对农产品质量和安全性的要求。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicusR1B。
本发明提供的甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus R1B的保藏编号为CGMCC No.11858。
上述菌株R1B的分类命名为甲基营养型芽胞杆菌Bacillus methylotrophicus，该菌株于2015年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11858。
本发明的另一个目的是提供上述甲基营养型芽胞杆菌R1B或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。
本发明提供了上述甲基营养型芽胞杆菌R1B或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在防治轮纹病和/或软腐病中的应用。
本发明还提供了上述甲基营养型芽胞杆菌R1B或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备防治轮纹病和/或软腐病的产品中的应用。
上述应用中，所述轮纹病和/或软腐病为梨轮纹病和/或梨软腐病。
本发明还提供了上述甲基营养型芽胞杆菌R1B或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在抗菌和/或抑菌中的应用。
本发明还提供了上述甲基营养型芽胞杆菌R1B或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在制备抗菌和/或抑菌的产品中的应用。
上述应用中，所述抗菌和/或抑菌是通过抑制菌丝生长体现的。
上述应用中，所述菌为轮纹病菌Botryosphaeria dothidea和/或软腐病菌Rhizopus stolonifer和/或石斛黑斑病菌Alternaria tenuissima和/或棉花黄萎病菌Verticillium dahliae和/或白菜黑斑病菌Alternaria brassicae和/或灰霉病菌Botrytis cinerea和/或辣椒立枯病菌Rizoctonia solani和/或香蕉枯萎病菌Fusariumoxysporum和/或稻瘟病菌Piricularia Oryzae和/或禾谷镰孢菌Fusarium graminearum。
本发明还有一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为上述甲基营养型芽胞杆菌R1B或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；
所述产品具有如下1)或2)所述的功能：
1)防治轮纹病和/或软腐病；
2)抗菌和/或抑菌。
上述产品中，所述抗菌和/或抑菌是通过抑制菌丝生长体现的；
所述菌为轮纹病菌Botryosphaeria dothidea和/或软腐病菌Rhizopusstolonifer和/或石斛黑斑病菌Alternaria tenuissima和/或棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae和/或白菜黑斑病菌Alternaria brassicae和/或灰霉病菌Botrytis cinerea和/或辣椒立枯病菌Rizoctonia solani和/或香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum和/或稻瘟病菌Piricularia Oryzae和/或禾谷镰孢菌Fusarium graminearum。
本发明的最后一个目的是提供一种防治或辅助防治梨果实轮纹病和/或软腐病的方法。
本发明提供的防治或辅助防治梨果实轮纹病和/或软腐病的方法包括如下步骤：用上述甲基营养型芽胞杆菌R1B或上述产品中的菌悬液处理梨果实。
上述方法中，所述菌悬液中甲基营养型芽胞杆菌浓度为5×107CFU/ml。
本发明从表面灭菌的霍山石斛根中分离获得一株甲基营养型芽胞杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，该菌株对多种植物病原菌具有广谱抗性，对由轮纹病和软腐病引起的梨果实腐烂具有良好的防治效果。作为生防菌的植物内生菌具有广谱抗菌性和高效的安全性等优势，用其菌体(或其产生的活性物质)作为天然保鲜剂，大规模生产原料成本低，操作方便，防治效果稳定，能有效解决梨果实病害农药防治所带来的农药残留和环境污染问题。在梨采后病害的生物防治方面具有巨大的应用潜力，为研制和开发微生物农药提供了优良的基础菌株。
附图说明
图1为菌株R1B的形态照片。其中，图1A为菌株R1B培养7天的菌落照片；图1B为R1B的菌落放大照片。
图2为基于菌株R1B的16S rDNA构建的系统发育树。
图3为菌株R1B与轮纹病菌和软腐病菌对峙培养的照片。其中，图3A为菌株R1B与轮纹病菌对峙培养7天的照片；图3B为菌株R1B与软腐病菌对峙培养10天的照片。
图4为菌株R1B作用下轮纹病菌菌丝形态和软腐病菌菌丝形态。其中，图4A为R1B处理组的轮纹病菌菌丝形态；图4B为对照组的轮纹病菌菌丝形态；图4C为R1B处理组的软腐病菌菌丝形态；图4D为对照组的软腐病菌菌丝形态。
图5为菌株R1B对梨果实轮纹病的防治作用。
图6为菌株R1B对梨果实软腐病的防治作用。
保藏说明
菌种名称：甲基营养型芽胞杆菌
拉丁名：Bacillus methylotrophicus
菌株编号：R1B
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年12月10日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.11858
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的梨品种为“水晶梨”。
下述实施例中的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)配方：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15克，用蒸馏水定容至1升，自然pH。
下述实施例中的马铃薯葡萄糖培养基(PDB)配方：马铃薯200克、葡萄糖20克，用蒸馏水定容至1升，自然pH。
下述实施例中的牛肉膏培养基配方：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5g，用蒸馏水定容至1升，pH 7.2～7.4。
下述实施例中的R1B菌悬液的制备方法：将R1B接种于牛肉膏培养基中，培养48hr(30℃、150r/min)后，将菌液于4℃、10000r/min离心10min，去上清，然后用无菌水调整到需要的浓度。
实施例1、甲基营养型芽胞杆菌株R1B的分离及鉴定
一、菌株R1B的分离和纯化
1、将采自安徽六安的霍山石斛用自来水冲洗干净后，用蒸馏水冲洗，晾干后把根、茎和叶片剪成小段进行表面消毒。消毒方法如下：70％酒精处理40-60s，无菌水冲洗，然后用2.5％次氯酸钠溶液处理2-5min，无菌水冲洗3-4次。
2、在无菌条件下，取100μL最后一次冲洗所产生的无菌水涂布在牛肉膏培养基上，30℃培养24-72h，观察有无菌落产生，依此验证此消毒方法是否杀死了供试材料表面的微生物。
3、在无菌状态下，将霍山石斛根、茎、叶片切成0.2cm2的片段，置于盛有牛肉膏培养基的平皿中，28℃条件下培养。组织块出现菌落后，挑取菌落转接入新牛肉膏培养基中划线纯化培养，反复几次即得到细菌纯化菌株，将其接种于牛肉膏培养基斜面试管中，保存于4℃冰箱中。
从霍山石斛根、茎、叶片中共分离获得32株细菌，以梨轮纹病菌为指示菌进行拮抗细菌的初筛和复筛，其中来自根中的1株细菌表现出强烈的拮抗活性，将该菌株命名为R1B。
二、菌株R1B的鉴定
1、菌株R1B的形态鉴定
菌株R1B的形态特征：革兰氏阳性菌，在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落扁平圆形，乳白色不透明，边缘锯齿状，表面粗糙颗粒状(图1A、B)。
2、菌株R1B的生理生化的鉴定
菌株R1B的生理生化特性如表1所示，菌株R1B属于好氧菌，甲基红实验阴性，接触酶反应、明胶水解、淀粉水解、VP实验、硝酸盐还原实验均为阳性，可以很好地利用葡萄糖和蔗糖，对甘露醇的利用较弱，在28～37℃条件下生长最好。根据《常见细菌系统鉴定手册》，将菌株R1B初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。
表1、菌株R1B的生理生化特性
＊+－：生长不好＊＊+：生长
3、菌株R1B的分子鉴定
提取菌株R1B的总DNA作为模板，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增，得到含有菌株R1B 16S rDNA保守区的片段。引物序列如下：
27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。
PCR扩增得到的菌株R1B的16s rDNA的序列如序列1所示。基于16S rDNA序列的系统发育树如图2所示。
4、菌株的保藏
根据形态特征、生理生化和分子鉴定结果和分析，菌株R1B的分类命名为甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus)，该菌株于2015年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11858。
实施例2、菌株R1B在抑菌或抗菌中的应用
一、菌株R1B对梨轮纹病菌和软腐病菌的拮抗活性
在PDA培养基上分别活化病原菌株梨轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)和软腐病菌(Rhizopus stolonifer)，用6mm的打孔器打取菌饼，分别得到梨轮纹病菌饼和软腐病菌饼。采用对峙培养法，分别将梨轮纹病菌饼和软腐病菌饼接种在直径为9cm的PDA平板一侧，相对的一侧划线接种菌株R1B，两接种点相距3-4cm，并以单独接种在PDA平板上的病原菌株梨轮纹病菌和软腐病菌做对照。均设3个重复，在25℃条件下培养，当对照长满全皿时，测量处理菌落直径和抑菌带宽度，抑菌活性采用抑制率＝[(对照菌落半径－处理菌半径)/对照菌落半径]×100％。
结果如图3所示，菌株R1B对轮纹病菌表现出强烈的抑菌作用，抑菌率达到72.7％(图3A)。软腐病菌生长迅速，一天即可满皿，菌株R1B周围有明显的抑菌带(0.5-1cm)，十天后依然清晰(图3B)。说明菌株R1B对两种梨病原菌梨轮纹病菌和软腐病菌均有明显的抑制作用。
二、菌株R1B的抗菌谱
以石斛黑斑病菌(Alternaria tenuissima)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒立枯病菌(Rizoctonia solani)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌(Piricularia Oryzae)和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)作为供试植物病原菌，研究菌株R1B的抑菌谱。具体步骤如下：
在PDA培养基上分别活化石斛黑斑病菌(Alternaria tenuissima)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)、辣椒立枯病菌(Rizoctonia solani)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌(Piricularia Oryzae)和禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)，并用6mm的打孔器打取菌饼，分别得到上述各病菌菌饼。采用对峙培养法，分别将上述各病菌菌饼接种在直径9cm的PDA平板一侧，相对的一侧划线接种菌株R1B，两接种点相距3-4cm，以病原菌单独接种在PDA平板上做对照。均设3个重复，在25℃条件下培养，当对照长满全皿时，测量各病原菌落直径和抑菌带宽度，抑菌活性采用抑制率＝[(对照菌落半径－处理菌半径)/对照菌落半径]×100％。
结果如表2所示，菌株R1B对8种供试植物病原真菌石斛黑斑病菌(Alternariatenuissima)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒立枯病菌(Rizoctonia solani)、香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌(Piricularia Oryzae)和禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)均表现出强烈的抑制效果，抑菌率均在50％以上。说明菌株R1B具有广谱的抑菌能力，可用于多种病害的生物防治。
表2、R1B对不同植物病原菌的抑制结果
三、菌株R1B对梨轮纹病菌和软腐病菌菌丝生长的影响
在PDA培养基上分别活化病原菌株梨轮纹病菌和软腐病菌，用6mm的打孔器打取菌饼，分别得到梨轮纹病菌饼和软腐病菌饼。将梨轮纹病菌饼和软腐病菌饼研碎后，分别接种在1/10PDB培养基中，25℃，150rpm/min培养2天后，加入浓度为1×107CFU/ml的R1B菌悬液，并以单独接种在接种在1/10PDB培养基中的梨轮纹病菌和软腐病菌做对照。均设3个重复，在25℃条件下培养后镜检菌丝生长状况。
结果如图4所示，在菌株R1B作用下，轮纹病菌菌丝形态发生严重畸变，菌丝粗细不均，有的生长菌丝的顶端畸形，形成膨胀泡后破裂，细胞内物质向外泄漏(图4A)；而对照菌丝粗细均匀且表面光滑、生长旺盛(图4B)。说明菌株R1B严重破坏了菌丝形态，具有抑制轮纹病菌菌丝生长的作用。
在菌株R1B作用下，软腐病菌几乎不能生长，菌丝出现断裂和自溶(图4C)，而对照病菌菌丝生长旺盛(图4D)。说明菌株R1B可完全抑制软腐病菌菌丝的生长。
实施例3、菌株R1B在防治梨果实轮纹病中的应用
一、菌株R1B对梨果实轮纹病的防治作用
1、梨预处理
选取外观整齐、无病虫害、无外伤的果实，先用自来水冲洗干净，然后用75％酒精喷洒消毒，2min后用无菌滤纸擦干表面备用。
2、R1B菌悬液处理
用无菌打孔器(直径6mm)在果实表面对称打两个深度尽可能一致的伤口，在伤口内分别接种50μL 5×107CFU/ml的R1B菌悬液(R1B处理组，R1B)和等量无菌水(对照组，ck)，每处理8个果实，重复3次，室温放置一天。
3、接种病原菌
分别在步骤2中的R1B处理组和对照组的伤口处接种直径6mm的轮纹病菌块，接种处理后放入PE密闭箱中在25℃，RH>90％条件下培养，定时观察并记录结果，并计算平均发病率(％)和平均病斑直径(cm)。
菌株R1B对梨果实轮纹病的防治作用结果如图5和表3所示，R1B处理组与对照组相比，梨果实轮纹病的发病情况明显减弱。在接入轮纹病菌3天后，对照组开始发病，R1B处理可以完全抑制梨果实轮纹病的发生；接入轮纹病菌5天后，对照组100％发病，而R1B处理依然可以100％抑制梨果实轮纹病的发生；接入病菌7天后，R1B处理组开始出现病斑；9天后，对照组腐烂面积大于50％，直径在6cm左右，而R1B处理组的梨果实病斑直径平均在2.1cm，比对照降低了65.1％，R1B处理有效的减缓了梨轮纹病的发生和发展，具有良好的防治效果。
表3、R1B对梨果实轮纹病的防治作用
二、不同浓度R1B菌悬液对梨果实轮纹病的防治作用
1、梨预处理
选取外观整齐、无病虫害、无外伤的果实，先用自来水冲洗干净，然后用75％酒精喷洒消毒，2min后用无菌滤纸擦干表面备用。
2、不同浓度的R1B菌悬液处理
用无菌打孔器(直径6mm)在果实表面对称打两个深度尽可能一致的伤口，在其中一个伤口内分别接种1×108CFU/ml、1×107CFU/ml、1×106CFU/ml和1×105CFU/ml R1B菌液50μL，并在另一个伤口内加入等量无菌水为对照。每处理8个果实，重复3次，室温放置一天。
3、接种病原菌
分别在步骤2中的各个R1B处理组和对照组的伤口处接种直径6mm的轮纹病菌块，接种处理后放入PE密闭箱中在25℃，RH>90％条件下培养，定时观察并记录结果，并计算平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)。
不同浓度R1B菌悬液对梨果实轮纹病的防治作用如表4所示。从表中可以看出：不同浓度的R1B菌悬液处理梨果实9天，随着R1B菌悬液浓度的降低，对梨轮纹病的防治作用逐渐减弱，1×108CFU/ml R1B处理组效果最好，延迟和减缓梨轮纹病的发生，具有良好的防治作用。
表4、不同浓度R1B对梨果实轮纹病的防治作用
处理 病斑始现 病斑直径cm 抑制率％
1×10<sup>8</sup>CFU/ml 第7天 1.72±0.44 72.2
1×10<sup>7</sup>CFU/ml 第6天 2.78±0.67 55
1×10<sup>6</sup>CFU/ml 第4天 3.92±0.69 36.7
1×10<sup>5</sup>CFU/ml 第3天 5.42±0.30 12.5
CK 第3天 6.19±0.56
实施例4、菌株R1B在防治梨果实软腐病中的应用
1、梨预处理
选取外观整齐、无病虫害、无外伤的果实，先用自来水冲洗干净，然后用75％酒精喷洒消毒，2min后用无菌滤纸擦干表面备用。
2、R1B菌悬液处理
用无菌打孔器(直径6mm)在果实表面对称打两个深度尽可能一致的伤口，在伤口内分别接种50μL 5×107CFU/ml的R1B菌悬液(R1B处理组，R1B)和等量无菌水(对照组，ck)，每处理8个果实，重复3次，室温放置一天。
3、接种病原菌
分别在步骤2中的R1B处理组和对照组的伤口处接种1×105spores/ml的匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)悬液50μL接种处理后放入PE密闭箱中在25℃，RH>90％条件下培养，定时观察并记录结果，并计算平均发病率(％)和平均病斑直径(mm)。
菌株R1B对梨果实软腐病的防治作用如图6和表5所示。从表中可以看出：匍枝根霉接种后，对照组发病迅速，在接入软腐病菌2天后，对照组病斑直径已达6-9cm，R1B处理组可以完全抑制梨果实软腐病的发生；4天后，对照组梨果实全部腐烂，渗出大量的液体，且布满黑色菌丝和孢子；而R1B处理组依然100％抑制梨果实软腐病的发生；直至12天后R1B处理组才开始发病。说明菌株R1B对梨果实软腐病的发生有很好的防治作用。
表5、R1B对梨果实软腐病的防治作用

Claims (7)

1.甲基营养型芽胞杆菌R1B CGMCC No.11858或其菌悬液或含有其的菌剂在防治软腐病中的应用。
2.甲基营养型芽胞杆菌R1B CGMCC No.11858或其菌悬液或含有其的菌剂在制备防治软腐病的产品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述软腐病为梨软腐病。
4.一种产品，其活性成分为权利要求1中所述的甲基营养型芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）R1B CGMCC No.11858或其菌悬液或含有其的菌剂；
所述产品具有防治软腐病的功能。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述软腐病为梨软腐病。
6.一种防治或辅助防治梨果实轮纹病和/或软腐病的方法，包括如下步骤：用权利要求1或2中所述的甲基营养型芽胞杆菌R1B CGMCC No.11858或权利要求4所述的产品中的菌悬液处理梨果实。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述菌悬液中甲基营养型芽胞杆菌浓度为5×107 CFU/mL 。
CN201610560361.0A 2016-07-15 2016-07-15 一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用 Expired - Fee Related CN105936886B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610560361.0A CN105936886B (zh) 2016-07-15 2016-07-15 一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610560361.0A CN105936886B (zh) 2016-07-15 2016-07-15 一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105936886A CN105936886A (zh) 2016-09-14
CN105936886B true CN105936886B (zh) 2019-05-28

Family

ID=56873279

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610560361.0A Expired - Fee Related CN105936886B (zh) 2016-07-15 2016-07-15 一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105936886B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106614758A (zh) * 2016-12-27 2017-05-10 徐州工程学院 一种棉花病害生物防治方法
CN107058183B (zh) * 2017-05-17 2021-03-12 山东省葡萄研究院 一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用
CN108085284B (zh) * 2018-01-24 2021-03-30 大连理工大学 甲基营养型芽孢杆菌及包含该微生物的菌剂制备方法与应用
CN108684710B (zh) * 2018-05-12 2021-06-25 湖南科技学院 一种预防银杏茎腐病的促生制剂及制备方法
CN108770841B (zh) * 2018-07-12 2020-11-24 湖北工程学院 一种鲜切花保鲜剂及其应用
CN109055257B (zh) * 2018-07-27 2023-04-18 山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所 一种产挥发性抗菌物质的拮抗细菌及其应用
CN109486703B (zh) * 2018-10-18 2021-05-04 淮海工学院 甲基营养型芽孢杆菌bmf 04与发酵方法及用途
CN109182217B (zh) * 2018-10-18 2020-05-29 浙江大学 一种生防用甲基营养型芽孢杆菌菌株及其用途
CN112616854B (zh) * 2020-10-24 2022-03-25 济南市园林绿化工程质量与安全中心 一种防治黄栌枯萎病的生物制剂及其制备与施用方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232499A (zh) * 2013-06-18 2014-12-24 中国科学院沈阳应用生态研究所 产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物及其农药制剂应用
WO2016016508A1 (es) * 2014-07-31 2016-02-04 Universidad De Granada Uso de bacillus methylotrophicus como estimulante del crecimiento vegetal y medio de control biológico, y cepas aisladas de dicha especie
CN105557756A (zh) * 2016-02-05 2016-05-11 中国农业科学院植物保护研究所 利用甲基营养型芽孢杆菌nkg-1实施的植物抑菌方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104232499A (zh) * 2013-06-18 2014-12-24 中国科学院沈阳应用生态研究所 产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物及其农药制剂应用
WO2016016508A1 (es) * 2014-07-31 2016-02-04 Universidad De Granada Uso de bacillus methylotrophicus como estimulante del crecimiento vegetal y medio de control biológico, y cepas aisladas de dicha especie
CN105557756A (zh) * 2016-02-05 2016-05-11 中国农业科学院植物保护研究所 利用甲基营养型芽孢杆菌nkg-1实施的植物抑菌方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bacillus oryzicola sp. nov., an Endophytic Bacterium Isolated from the Roots of Rice with Antimicrobial, Plant Growth Promoting, and Systemic Resistance Inducing Activities in Rice;Eu Jin Chung et al.;《Plant Pathol. J.》;20151231;第31卷(第2期);第152-164页 *
人参可利用内生菌株的筛选和鉴定;赵智灵等;《中草药》;20150731;第46卷(第14期);第2146页第1段、第2147页第1段、表5 *
白菜黑斑病菌拮抗细菌LBC-2的筛选鉴定、发酵条件优化及田间防效;王全等;《中国生物防治学报》;20150228;第31卷(第1期);第96-105页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105936886A (zh) 2016-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105505834B (zh) 一株防治梨轮纹病和软腐病的暹罗芽孢杆菌及其应用
CN105936886B (zh) 一株防治梨轮纹病和软腐病的甲基营养型芽孢杆菌及其应用
CN102433282B (zh) 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用
CN105219681B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM及制备方法和应用
CN104342394B (zh) 一株暹罗芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用
CN105820981B (zh) 一株高地芽孢杆菌菌剂的制备及应用
CN106190920B (zh) 枯草芽孢杆菌yn145及其应用
CN104673705B (zh) 一株防治小麦赤霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN109136152A (zh) 一株用于抑制植物病原真菌的产芽孢解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN105734000A (zh) 一株有促生防病能力的多粘类芽孢杆菌nsy50
CN101531971B (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在防治设施蔬菜连作障碍中的应用
CN103497916B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用
CN102827790B (zh) 一种枯草芽孢杆菌菌株a97、菌剂及制备方法和应用
CN108148794A (zh) 一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3及制备方法和应用
CN108077411A (zh) 解淀粉芽孢杆菌y-3生物保鲜剂的制备方法及其使用方法
CN113388529A (zh) 一株茶树内生菌Penicillium ehrlichii及其应用
CN107384808A (zh) 棘孢木霉td3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用
CN109055238A (zh) 一株对植物病原菌有抑制作用的黄柄曲霉菌菌株tr32及其应用
CN106282049B (zh) 特基拉芽孢杆菌jn369及其应用
CN105349455B (zh) 一株马来西亚链霉菌及其应用
CN106434445A (zh) 一种枯草芽孢杆菌bs01、其菌剂及其在抑制水果采后病原菌中的应用
CN111424004B (zh) 一株亚麻假单胞菌及其应用
CN105132296B (zh) 一种钩状木霉菌菌株及其应用
CN110157638A (zh) 一种克里布所类芽孢杆菌yy-1及其应用
CN103614306B (zh) 一株酵母菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190528

Termination date: 20210715