WO2016016508A1 - Uso de bacillus methylotrophicus como estimulante del crecimiento vegetal y medio de control biológico, y cepas aisladas de dicha especie - Google Patents

Uso de bacillus methylotrophicus como estimulante del crecimiento vegetal y medio de control biológico, y cepas aisladas de dicha especie Download PDF

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plant
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María Victoria BÉJAR LUQUE
Inmaculada Llamas Company
Cristina RUÍZ GARCÍA
Emilia QUESADA ARROQUIA
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Universidad De Granada
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention has as its main application agriculture.
  • the bacteria of the present invention, as well as the products produced by them, have utility as plant growth stimulants and for the control of plant pathogens such as bacteria, insects, fungi and nematodes.
  • Phytopathogenic organisms are an important cause of plant diseases; they determine changes in their form, function or integrity and can lead to their death. Among them are nematodes, bacteria, insects, fungi and viruses.
  • phytopathogenic fungi include, among others, species of the genera Botrytis, Py ⁇ hium, Alternaria, Fusarium, Phytophthora, Rhizoctonia, Coiieotrichium, Eutypa, Rhizopus, PeniciHium, Sderotinia and Vertid ⁇ iium. They cause local damage, such as leaf spots, tissue hypertrophy or blight, or widespread damage, when they affect the root or vascular system, causing wilting and death of the plant. There are more than 8,000 species that attack plants, some are very specific, and others have a wide range of hosts. The economic impact that these organisms cause is very important. As an example, when Botrytis dnnerea affects the vineyards, thousands of tons of losses are produced in the wine industry.
  • Plant diseases caused by bacteria have a lower incidence than those caused by fungi or viruses (Vidhyasekaran 2002).
  • the phytopathogenic bacteria are: Erwinia amylovora, responsible for the disease called bacterial fire, which especially affects pear, apple, medlar, quince and ornamental rosacea; Erwinia carotovora (Pectobacterium carotovorum), producer of soft rot; Raistonia soianacearum, which causes rot and wilting in cultivated Solanaceae, but also in plants of more than fifty families; the different Páudomonas syringae pathovars, which produce spots, burns and ulcerations; Agrobacter ⁇ um tumefaciens, a bacterium that causes tumors in the neck, roots and less frequently in the stem and has a wide spectrum of hosts, covering more than 700 species; and Xanthomonas campestris, responsible for spots and burns on plants, among others.
  • Nematodes also have great importance in agriculture. They are microscopic worms between 0.2-1 mm with a stylet on top that they use to feed on the plant. The larvae enter any part of the plant in contact with the moist soil, but mainly through the tip of the root absorbent hairs, since their stylet is not very vigorous. Once they lodge in the tissues, they do not move or change their situation. The symptoms are manifested by the appearance of the typical nodules or greases in the roots. These damages cause the obstruction of vessels and prevent absorption by the roots, which translates into less plant development and symptoms of wilting, chlorosis and dwarfism. Among the phytopathogenic nematodes are the species of the genera Meloidogyne, Heterodera, Radopholus and Pratylenchus.
  • Insect pests are also a major problem in plants. In some cases they are vectors of bacterial and / or viral infections. In others, they can weaken the plant and even slow its growth and development, and its control or elimination is tremendously complex. This is the case of the beetles that drill the bark and enter under it to build their galleries and the females deposit the eggs. Or the olive spider, which sucks the sap of the plant by biting into buds, leaves, flowers, fruits and young shoots while injecting toxins into the plant, stopping growth and deforming the affected organs. Another example is the whitefly, which absorbs the sap until the leaves begin to show yellow spotted spots and finally dry. In addition the secretions produced by this insect favor the proliferation of fungi. Aphids, pruning ants, mealybugs, sawing wasps, geranium butterflies, flower beetles, etc. are other examples of the main insects that cause damage to plants.
  • Rhizobacteria are soil microorganisms that live near the roots and are also widely used in biocontrol. In most cases, bacteria that are found in the rhizosphere in their natural state do not usually harm other beneficial organisms and also in many cases benefit the ecosystem by stimulating plant growth and making agricultural production more sustainable. On the other hand, its effects on human health are minimal or zero. These microorganisms, also called growth promoting rhizobacteria or PGPR (pla ⁇ growth promoting rhizobacter ⁇ á), colonize plant roots, compete and control plant pathogens, and act as fertilizers.
  • growth promoting rhizobacteria or PGPR plaque growth promoting rhizobacter ⁇ á
  • PGPRs are characterized by their ability to stimulate plant growth, through direct or indirect mechanisms.
  • Direct stimulation includes nitrogen fixation (Sessitsch et a /., 2002); the production of hormones, such as auxins, gibereiins and cytokinins that increase the lengthening, division and size of roots (Perrine et al., 2004; Garc ⁇ a de Saiamone ef a /., 2001); the soiubilization of phosphates (Rodr ⁇ guez and Fraga, 1999); and siderophores secretion (Carson et al., 2000), among others.
  • Indirect stimulation of plant growth includes various biocontrol mechanisms of phytopathogenic organisms (bacteria, fungi and nematodes among others) among those found: competition for ecological niche or substrates; the production of hydrolytic enzymes (proteases, lipases, chitinases, collagenases and glucanases); antibiotic production (Hassan et al., 1997; Essalmani and Lahlou, 2003); the colonization of the roots becoming "biological envelopes" that delay invasion by nematodes (Rodr ⁇ guez-Kábana 1997; Loeppler 1997); the alteration of root exudates, making them less attractive to nematodes (Oostendorp, and Sikora, 1990); the production of siderophores and the production by some PGPR of volatile compounds such as acetoin and 2,3 butanediol that produce an increase in plant resistance to infections (also called systemic induced resistance or ISR) (Choudhary and Johri 2009)
  • PGPRs at certain concentrations in the soil (at least 10 6 microorganisms / mL are required) act, in addition to how plant growth stimulants (phyto-fortifiers of itof and rti I iza ntes), as agents of biological control, avoiding the development of bacteria, fungi and phytopathogenic nematodes.
  • PGPR bacteria Among the most commonly used PGPR bacteria are species of the genera Arthrobacter, Azospirillum, BacUlus, Pseudomonas, Rhizobium and Serratia, among others (Kloepper et al. 2004) Others such as Tsukamurelia paurometabola are also used, for example, in the bionematicide HeberNem®, effective in the control of Meloidogyne spp., Radopholus simiiis and Pratylenchus spp. Its mode of action is related to the release of hydrogen sulfide and chitinases (Mena, 2004 and 2005).
  • bacteria of the genus BacUlus Some of the bacteria most used in agriculture, in the control of pathogens or as PGPR, are the bacteria of the genus BacUlus.
  • Bacteria of this genus have many of the aforementioned characteristics, and on the other hand the formation of spores allows this genus its long-term viability in commercial preparations, unlike other rhizobacteria such as Pseudomonas, Rhizobium or Serratia.
  • Rhizobium strains to increase plant growth WO2003089640 A2.
  • Shan et al. (Crop Protection 44 (2013), 29-37) describe the use of Bacilius methylotrophicus strain BC79 in the biocontrol of rice disease, also known as rice blast, caused by the fungus Magnaporthe oryzae ("rice blast” in English).
  • Madhaiyan et al International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2010), 60, 2490-2495
  • Mahusro et al. (Indian Journal of Research (2013) Vol. 2, Issue 1 1, pages 243-244) describe the improvement of a new strain of Bacillus methylotrophicus for the increased production of antimicrobial metabolites.
  • the present invention relates to the use of microorganisms as plant growth stimulants and / or for the biological control of bacteria, insects, fungi and / or phytopathogenic nematodes. More specifically, the present invention relates to the use of microorganisms of the Bacillus methylotrophicus species, to different culture methods of said microorganisms and to the products that comprise them, as plant growth stimulants and / or for the biological control of phytopathogens such as bacteria, insects, fungi and / or nematodes.
  • the present invention relates to the use of microorganisms of the Bacillus methylotrophicus species, to different culture methods and to the products that comprise them for the biological control of phytopathogens such as bacteria, insects, nematodes and phytopathogenic fungi.
  • phytopathogens such as bacteria, insects, nematodes and phytopathogenic fungi.
  • the present invention relates to the use of microorganisms of the Bacillus methylotrQphicus species, to different culture methods of said microorganisms and to the products that comprise them, as plant growth stimulants and for the biological control of phytopathogens such as bacteria, insects, fungi and phytopathogenic nematodes.
  • the present invention relates to the use of microorganisms of the species Bacillus methyiotrophicus, to different culture methods and to the products that they comprise for the biological control of phytopathogenic bacteria, phytopathogenic nematodes, phytopathogenic insects and phytopathogenic fungi with the exception of fungi belonging to the Magnaporthe oryzae species.
  • the present invention relates to the use of microorganisms of the Bacillus methylotrophicus species, to different culture methods and to the products that comprise them for the biological control of bacteria such as those belonging to the species Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum and xanthomonas campestris, fungi such as Oidium, Botrytis or those belonging to the species Alternar ⁇ a alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus orymerotorium scorotorium scorotorium scorotorium scorotorium scorotorium scorotorium scorotorium sclerotonia, Scumotorium scorotorium sclerotonia, Scorotorium scumotorium scorotorium scumotorium
  • microorganisms belonging to Bacillus methylotrophicus strain XT1 (deposit number CECT8661) deposited on April 23, 2014 in the Spanish Type Culture Collection (CECT) by the University of Granada and / or microorganisms with a high degree homology with strain XT1 whose DNA sequence of the 16S rRNA gene is identical in at least 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% with the DNA sequence of the 16S rRNA gene of strain XT1, based on the identity of all the nucleotides of said DNA sequences; and / or microorganisms belonging to Bacillus methylotrophicus strain XT2 (deposit number CECT8662) deposited on April 23, 2014 in the Spanish Type Culture Collection (CECT) by the University of Granada and / or microorganisms with a high degree of homology with the strain XT2 whose DNA sequence of the 16S rRNA gene is identical in at least 99.6%,
  • the object of the present invention is also a culture of bacteria comprising or consisting of microorganisms belonging to Bacillus methylotrophicus strain XT1 and / or microorganisms with a high degree of homology with strain XT1 whose sequence of DNA of the 16S rRNA gene is identical in at least 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% with the DNA sequence of the 16S rRNA gene of strain XT1, based on the identity of all nucleotides of said sequences of DNA; and / or microorganisms belonging to Bacillus methylotrophicus strain XT2 and / or microorganisms with a high degree of homology with strain XT2 whose DNA sequence of the 16S rRNA gene is identical in at least 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% with the DNA sequence of the 16S rRNA gene of strain XT2, based on the identity of all the nucleotides of said DNA sequences.
  • a subject of the present invention is also a composition comprising microorganisms belonging to Bacillus methylotrophicus strain XT1 and / or microorganisms with a high degree of homology with strain XT1 whose DNA sequence of the 16S rRNA gene is identical in at least 99.6%, 99.7 %, 99.8% or 99.9% with the DNA sequence of the 16S rRNA gene of strain XT1, based on the identity of all the nucleotides of said DNA sequences; and / or microorganisms belonging to Bacillus methylotrophicus strain XT2 and / or microorganisms with a high degree of homology with strain XT2 whose DNA sequence of the 16S rRNA gene is identical in at least 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% with the DNA sequence of the 16S rRNA gene of strain XT2, based on the identity of all the nucleotides of said DNA sequences.
  • the present invention also aims at the use of the bacteria, cultures and / or compositions described above in a process for stimulating plant growth and / or in a process of biological control of phytopathogenic organisms.
  • bacteria belonging to strains XT1 or XT2 or those microorganisms that have a high degree of homology with these strains, as described above
  • their cultures or compositions that are subject to the present invention they include them, as well as the products that comprise some of them or the products obtainable from them or from their cultivation as stimulants of plant growth and / or for the biological control of plant pathogens, such as bacteria, insects, fungi and / or nematodes
  • the use of bacteria belonging to strains XT1 or XT2 or those microorganisms that have a high degree of homology with these strains, as described above
  • their cultures or compositions that are subject to the present invention they include them, as well as the products that comprise some of them or the products obtainable from them or from their cultivation as stimulants of plant growth and / or for the biological control of plant pathogens, such as fungi (with the exception of fungi belonging to the species Magnaporthe oryzaé) and / or or
  • the bacteria belonging to strains XT1 or XT2 are used as plant growth stimulants and / or for the biological control of plant pathogens, selected from the list that includes or consists of:
  • the bacteria belonging to strains XT1 or XT2 (or those microorganisms that have a high degree of homology with these strains, as described above), their cultures or compositions that comprise them, as well as the products that comprise some of them or the products obtainable from them or from their cultivation are used as stimulants of plant growth and / or for the biological control of nematodes, preferably nematodes belonging to one of the following genera: Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema and / or Trichodorus.
  • the bacteria belonging to strains XT1 or XT2 (or those microorganisms that have a high degree of homology with these strains, as described above), their cultures or compositions that comprise them, as well as the products that comprise some of them or the products obtainable from them or from their cultivation are used as plant growth stimulants and / or for the biological control of Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris.
  • the bacteria belonging to strains XT1 or XT2 (or those microorganisms that have a high degree of homology with these strains, as described above), their cultures or compositions that comprise them, as well as the products that comprise some of them or the products obtainable from them or from their cultivation are used as stimulants of plant growth and / or for the biological control of fungi belonging to the species Alternar ⁇ a alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris and Verticillium dahliae, even more preferred for the biological control of Botrytis cinnerea.
  • the bacteria belonging to strains XT1 or XT2 (or those microorganisms that have a high degree of homology with these strains, as described above), their cultures or compositions that comprise them, as well as the products that comprise some of them or the products obtainable from them or from their cultivation are used as plant growth stimulants and / or for the biological control of insects belonging to the Aphididae family, as well as insects belonging to the species commonly called "whitefly", in particular , the species Trialeurodes vaporariorum, predominantly in greenhouses.
  • the present invention also aims at a process for stimulating plant growth comprising the steps of:
  • the present invention also aims at a process for stimulating plant growth comprising the steps of:
  • the present invention also aims at a method of biological control of phytopathogenic organisms comprising the steps of:
  • step b Contact a plant affected by a phytopathogen with bacteria, bacteria cultures or compositions obtained in step a).
  • a subject of the present invention is also a method of biological control of phytopathogenic fungi belonging to the species Alternar ⁇ a alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cumeruscumercumeris
  • Verticillium dahliae preferably belonging to the species Botrytis cinnerea, which comprises the stages of:
  • step b Contact a plant affected by a phytopathogen with bacteria, bacteria cultures or compositions obtained in step a.
  • the present invention also aims at a method of biological control of phytopathogenic bacteria belonging to the species Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris comprising the steps of:
  • the present invention aims at a method of biological control of phytopathogenic nematodes (such as, for example, Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema and / or Trichodorus species) comprising the steps of:
  • step b Contact a plant affected by a phytopathogen with bacteria, bacteria cultures or compositions obtained in step a).
  • the present invention also aims at a method of biological control of phytopathogenic insects belonging to the family Aphididae, as well as insects belonging to the species commonly called whitefly comprising the steps of:
  • the methods described in the present invention may further comprise the use of a distribution system for the bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the methods of the present invention may comprise the use of droppers for the distribution of bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the methods of the present invention may comprise the use of self-contained droppers for the distribution of the bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the methods of the present invention may comprise the use of localized irrigation systems (such as micro sprinklers with rotating elements or diffusers) for the distribution of the bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the methods of the present invention may comprise the use of sprinklers for the distribution of the bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the aforementioned methods employ bacteria, bacteria cultures or compositions comprising Bacillus methyiotrophicus, strains XT1 and / or XT2, deposited with the Spanish Collection of Type Crops (CECT) with deposit number CECT8661 and CECT8662, respectively.
  • CECT Collection of Type Crops
  • Figure 4 Average number of nematodes found per plant treated with strains XT1, XT2 and type strain.
  • Figure 5. Average number of nematodes per root g found plants treated with strains XT1, XT2 and type strain.
  • Figure 7 Growth of pumpkin plants after 50 days of potting at room temperature. Pots B1 and B2 have been inoculated with strain XT1 while B3 and B4 have not been inoculated for control use.
  • the present invention relates to the use of microorganisms as stimulants of plant growth and for the biological control of bacteria, insects, fungi and phytopathogenic nematodes. More specifically, the present invention relates to the use of microorganisms of the genus Bacillus, specifically of the species Bacillus methyiotmphicus, to their cultures, to compositions comprising these bacteria, to different culture methods and to the products that comprise them, as growth stimulants. plant and for the biological control of bacteria, insects, fungi and phytopathogenic nematodes.
  • the present invention relates to to the use of microorganisms of the species Bacillus methy ⁇ otroph ⁇ cus, to their cultures, to compositions comprising these bacteria, to different culture methods and to the products that comprise them for the biological control of bacteria, insects, phytopathogenic nematodes and fungi.
  • the present invention relates to the use of microorganisms of the species Bacillus methy ⁇ otrophicus, to their cultures, to compositions comprising these bacteria, to different culture methods and to products that comprise them for the biological control of bacteria, insects, phytopathogenic nematodes. and fungi, with the exception of fungi belonging to the species Magnaporthe oryzae.
  • the present invention relates to the use of microorganisms of the species Bacillus methy! Oirophicus, to its cultures, to compositions comprising these bacteria, to different culture methods and to products that comprise them for the biological control of bacteria belonging to the species Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestres; of fungi belonging to the species Alternar ⁇ a alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris and Verticillium dahliae; of insects belonging to the Aphididae family, as well as insects belonging to the species commonly called whitefly and / or nema
  • Biocontrol or biocontrol is defined in the present invention as a method of control of pests, diseases and weeds that consists of using living organisms in order to control the populations of another organism (phytopathogenic organisms).
  • the invention relates to bacteria belonging to the strain with deposit number CECT8661, deposited on April 23, 2014 by the University of Granada in the Spanish Type Culture Collection (CECT). Throughout this report, reference may be made to this strain with the term "strain XT1". In another particular embodiment, the invention relates to bacteria belonging to the strain with deposit number CECT8662, deposited on April 23, 2014 by the University of Granada in the Spanish Type Culture Collection (CECT). Throughout this report, reference may be made to this strain with the term "strain XT2".
  • the use of the bacteria belonging to the strains is an object of the present invention.
  • XT1 and / or XT2 in a procedure of biological control of phytopathogenic organisms and / or in a procedure of stimulation of plant growth.
  • Strains XT1 and XT2 belong to the species Bacillus methyiotrophicus. This species was described by Madhaiyan et al. in 2010. It was isolated from the rhizosphere of a rice plant (Oryza sativa). The species Bacillus methyiotrophicus is closely related phylogenetically with Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. licheniformis and B. amyloliquefaciens microorganisms with various applications in the field of agriculture. The percentage of identity with these species ranges between 98.2 and 99.2%. Strains XT1 and XT2 have 99.5% and 99.3%, respectively, of identity with the type species of B. methyiotrophicus. This conclusion was reached after sequencing the entire 16S RNAr gene (1500 bp).
  • strains XT1 and XT2 of the present invention are as follows: Domain: Bacteria I Edge: Firmicutesl Class: Bacillil Order: Bacillalesl Family: Bacillaceae I Genus: Bacillus.
  • strains are sporulated Gram positive bacilli. Its size ranges between 1, 5 and 3.5 ⁇ in length by 0.5 ⁇ in width. They originate white-ivory colonies with irregular borders. They are negative oxidase and positive catalase.
  • Strains XT1 and XT2 have perimeter flagella that give them great mobility. They originate biofilms or films that allow their adhesion to lively and inanimate substrates and that act as a protection factor against predators in the environment. The formation of biofilms facilitates the adherence of the microorganism; if it is administered by drip irrigation it will adhere to the roots. If it is administered by foliar route, it will remain in the philosophy. In addition biofilm formation both the roots and the leaves and stem protect the plant against the attack of other living beings. Consequently, both the presence of flagella and the formation of biofilm represent an advantage that these bacteria (XT1 and XT2) possess for habitat colonization.
  • Strains XT1 and XT2 originate non-deforming ellipsoidal spores. In the 2xSG medium, these bacteria produce between three and five days more than 5 x 10 8 spores / mL. They are halotolerant, grow optimally in a wide range of salt concentrations [between 0 and 12% (w / v)]. They grow optimally between 20-45 ° C and at pH between 5-10. Their nutritional requirements are scarce: they can grow with a wide variety of organic compounds as the sole source of carbon, such as citrate or sucrose. They are capable of growing with ammonium nitrate as the sole source of nitrogen, without the need for the presence of yeast extract or a complex source of nitrogen.
  • Strains XT1 and XT2 are facultative anaerobes. They breathe aerobically in the presence of oxygen and, in the absence of oxygen, for example in the roots and in the vicinity of them, perform butanediolic fermentation, producing 2.3 butanediol and acetoin. They use numerous sugars as a source of carbon and energy, producing acids from them. Among the sugars that these strains use are glycerol, glucose, fructose, mannitol, sorbitol, cellobiose, lactose and sucrose. They can also perform nitrogen fixation, that is, in the absence of a nitrogen source, they capture the gaseous nitrogen and transform it into ammonium, which is the source of nitrogen usable by plants. They produce dihydroxyacetone and H 2 S.
  • Strains XT1 and XT2 are capable of synthesizing chelating compounds, such as siderophores, that capture Fe 3+ and transform it into Fe 2+ .
  • the iron ion Fe 3+ has very little solubility at neutral pH and therefore cannot be used by organisms.
  • the siderophores dissolve these ions to Fe 2+ complexes, which can be assimilated by active transport mechanisms.
  • Strains XT1 and XT2 are capable of producing numerous extracellular enzymes with high hydrolytic capacity, which facilitates the availability of substrates to plants.
  • strains XT1 and XT2 are capable of producing amylases that hydrolyze starch, urease that hydrolyzes urea causing ammonium, proteases that hydrolyze gelatin and casein, lipases that hydrolyze tween 80 and lecithin, DNases that hydrolyze DNA , phosphatases that hydrolyze organic phosphate and inorganic phosphate and ACC deaminase.
  • the XT1 and XT2 strains produce in a CAS medium, used for the detection of siderophores, a greater clearance zone (7 and 5 mm respectively) than the Bacillus velezensis strain of Botrybel used to control and produces 3 mm. Both strains grow better than the control strain (a greater amount of bacterial mass is observed on the surface of the solid medium) in solid nitrogen-free media, indicating greater nitrogen-fixing activity. Therefore its activity as a microbial fertilizer is greater.
  • Strains XT1 and XT2 are capable of forming biofilm. This activity has not been determined in the previous commercial preparation. This ability allows bacteria to more easily adhere to the roots or leaves of plants to exert their phytoprotective or growth stimulating action.
  • the XT1 and / or XT2 strains object of the present invention have an enzymatic activity superior to the Botrybel preparation strain; produce higher hydrolysis halos against starch (amylase activity, see Figure 3), gelatin and casein (protease activity), tween 80 and lecithin (lipase activity), and increased ACC activity deaminase and phosphatase, determined using phenolphthalein phosphate and phosphate calcic.
  • Hydrolysis halos are observed as the appearance of a transparent zone in the case of starch, casein and lecithin hydrolysis; for the gelatin the liquefaction of the same one is observed, that is to say the step to solid state to liquid; in the case of tween 80 a more opaque area of precipitation appears; for ACC deaminase activity, growth in media with amino carboxylic propane cycle is studied as the sole source of nitrogen and finally phosphatase activity It is observed with the appearance of a pink color when adding ammonia in the plate with phenolphthalein phosphate and the solubilization of calcium phosphate is analyzed by seeing the transparent area that originates around the bacterial mass grown in a medium with this compound. The activities have been analyzed using as a control the strain of Bacillus velezensis of the preparation Botrybel.
  • the inhibition values of the XT1 and XT2 strains and the type strain of B. methylothrophicus against Alternar ⁇ a alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusar ⁇ um oxysporum have been determined Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris and Verticillium dahliae. Growth inhibition values are very significant in the case of Botrytis cinnerea. The activity was lower compared to Fusar ⁇ um oxysporum. In general, the Bacillus de Botrybel strain exhibits lower activity (and in some cases similar) to the XT1 and XT2 strains and type strain (see table 1 in Example 2, below).
  • Strain XT1 and strain type B. methylothrophicus also have activity against phytopathogenic bacteria such as Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris while strain XT2 has activity against P. atrosepticum and X. campestris (see table 2 in example 3, below).
  • Strains XT1, XT2 and the type strain of B. methylothrophicus have activity against Rhopalosiphum padi (see table 3) and strain XT1 against whitefly (see example 6, b1, below).
  • Strains XT1, XT2 and the type strain of B. methylothrophicus significantly decrease the multiplication factor of Meloidogyne javanica and the number of nematodes per tomato plant and the number of nematodes per root g (see Figures 3, 4 and 5) also the treatment with strain XT1 recovered Dutch cucumber plants grown in greenhouse and highly infected by nematodes, (see example 4b, below)
  • Another advantage of strains XT1 and XT2 is their high sensitivity to the antimicrobial agents generally used in therapeutics.
  • Strains XT1, XT2 and the type strain of B. methylotrophicus have an additional advantage over fungi used for biological control and as stimulants of plant growth, which is its easy cultivation and therefore its easy to obtain at an industrial level.
  • the advantage over other bacterial strains of other genera described for the same purpose is the presence of spores by strains XT1 and XT2, which means total product stability during storage and in the environment when conditions are not those suitable for the multiplication of said microorganisms.
  • Strains XT1 and XT2 and the type strain of B. methylotrophicus produce compounds that lower the pH such as 2.3 butanediol and acetoin when they ferment sugars under anaerobic conditions.
  • Strains XT1 and XT2 and type strain produce different lipopeptides, surfactants.
  • surfactant lipopeptides is surfactin, similar to that produced by Bacillus subtilis.
  • the surfactin produced by strain XT1 does not have 12 carbon fatty acids (12C) in its lipid chain.
  • the lipopeptide extraction following the method of Cooper et al. 1981, yields of 0.12 g / L and 0.10 g / L of culture were obtained for strains XT1 and XT2 respectively.
  • the type strain produced 0.6 g / L.
  • the production of lipopeptides has not been described.
  • the strain XT1 object of the present invention produces other surfactant lipopeptides of the type fengicine and lichenisin.
  • the dry cell weight (PSC) of strains XT1, XT2 and of the type strain is 2.7 g / L, 2.5 g / L and 2.9 g / L respectively.
  • the critical micellar concentration (CMC) is 0.0025% (0.025 mg / mL); With this value a surface tension of 29.7mN / m was obtained.
  • the surfactin produced by B. subtilis and marketed by Sigma ® values of 26.7 mN / m were obtained at the same CMC. That is, strain XT1 produces very active surfactant lipopeptides and with activity similar to commercially available surfactin.
  • lipopeptides produced by Bacillus species have antibiotic activity, acting at the level of the fungal and Gram-negative cell membranes are, for example, fengicins, mycobacillins, iturins, bacillomycins, surfactins, mycosubtilins, fungistatins (Volpon et al., 2000; Yilmaz et al. 2006).
  • the lipopeptides produced by strain XT1 are a mixture of fatty acids of 13, 14 and 15 carbon atoms, which bind to a cyclic peptide by leucine or isoleucine.
  • the relative proportion of these fatty acids is 1, 6.5 and 5.7 respectively.
  • object of the present invention is a method for the biological control of phytopathogenic organisms comprising the steps of:
  • step b Contact a plant with bacteria, bacteria cultures or compositions obtained in step a).
  • a method for stimulating plant growth and / or for the biological control of phytopathogenic nematodes comprising the stages of:
  • a method of stimulating plant growth in plants comprising the steps of:
  • step b Contact a plant preferably not affected by a phytopathogen with bacteria, bacteria cultures or compositions obtained in step a.
  • the present invention also aims at a process for stimulating plant growth comprising the steps of:
  • the present invention aims at a method of biological control of phytopathogenic insects belonging to the family Aphididae, as well as insects belonging to the species commonly called whitefly comprising the steps of:
  • the bacteria, cultures and / or composition of the present invention can be contacted with the (affected) plant via foliar, such as by spraying and / or dripping, or by traditional irrigation, or by flooding, etc.
  • the methods described in the present invention may further comprise the use of a distribution system for the bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the methods of the present invention may comprise the use of droppers for the distribution of bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the methods of the present invention may comprise the use of self-contained droppers for the distribution of the bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the methods of the present invention may comprise the use of localized irrigation systems (such as micro sprinklers, optionally with rotating elements or diffusers) for the distribution of the bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • the methods of the present invention may comprise the use of sprinklers for the distribution of the bacteria, cultures or compositions of the present invention.
  • Localized irrigation systems can be defined as fluid distribution methods (water, fertilizers, or, in the case at hand, bacteria, crops or compositions according to the present invention), which, in order to maintain an adequate level and constant of the fluid distributed in the soil, apply said fluid drop by drop, in a slow, localized and uniform way in the root mass of the plant.
  • Localized irrigation systems may include drip, exudation and / or micro spray systems.
  • a dropper according to the present invention is defined as an emission point of the bacteria, cultures or compositions of the present invention in the proximity of the plants to be treated.
  • the person skilled in the art knows how a dripper works and how to make use of it. Therefore, a method for the biological control (prevention) of phytopathogenic organisms, preferably fungi, bacteria and nematodes, comprising the steps of:
  • step b Contacting a plant using a distribution system for the bacteria, cultures or compositions of the present invention, with bacteria, cultures or compositions obtained in step a.
  • prevention is the provision made in advance to minimize a risk.
  • the objective of preventing according to the present invention is to ensure that eventual damage (infection of phytopathogenic organisms) does not occur.
  • a method for the biological control (treatment) of phytopathogenic organisms preferably fungi, bacteria, insects and nematodes, comprising the steps of:
  • step b Contacting a plant affected by a phytopathogen using a distribution system of the bacteria, cultures or compositions of the present invention, with the bacteria, cultures or compositions obtained in step a.
  • treatment is understood as the set of means whose purpose is the cure or relief (palliation) of diseases or symptoms.
  • a method for the biological control of phytopathogenic organisms preferably fungi (except those belonging to the species Magnaporthe oryzaé), bacteria (preferably Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris, insects) is also object of the present invention.
  • nematodes such as the species belonging to the genera Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, and in general all plant parasitic nematodes), which includes stages of:
  • step b Contacting a plant affected by a phytopathogen using a distribution system of the bacteria, cultures or compositions of the present invention, with the bacteria, cultures or compositions obtained in step a.
  • the object of the present invention is also a method for the biological control of phytopathogenic organisms, preferably fungi belonging to the species Alternaria alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotmerphorus Thanateotorphoris sclerotiniaphorusphorus Verticillium dahliae, bacteria, preferably belonging to the species Agrobacter ⁇ um tumefaciens, Pectobacter ⁇ um atrosepticum, Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestr ⁇ s and / or nematodes, such as, for example, the species of the genera Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paylenipus, Paratylemachus, Paratylemachus, Paraty
  • step b Contacting a plant affected by a phytopathogen using a distribution system of the bacteria, cultures or compositions of the present invention, with bacteria, cultures or compositions obtained in step a.
  • the distribution systems of the bacteria, cultures or compositions of the present invention may comprise localized irrigation systems, drippers, self-compensating drippers, micro sprinklers, and / or sprinklers.
  • the bacteria, cultures and / or compositions of the present invention can be contacted with the plant affected at least once, preferably at least twice, preferably at least three times, preferably at least four times, preferably at least five times, preferably at least six times, or more.
  • the time interval between an application of the bacteria, culture to / or composition of the present invention and the following (in the case where they contact or apply more than once) is 2 days, or 3 days, or 5 days, or 10 days, or 15 days, or 20 days, or 30 days.
  • the bacteria, culture and / or composition of the present invention are contacted with the affected plant once every 10 days, for 60 days, or once every day for 8-12 days.
  • the culture and / or composition of the present invention having a concentration of microorganisms of at least 10 8 colony forming units (CFU) per ml_ are used at a dilution between 0.5- 5% (v / v), such as 0.5%, 1%, 1, 5%, 2%, 3% and / or 5% (v / v).
  • the culture and / or composition of the present invention have a concentration of microorganisms of 1.5% (v / v) of a preparation containing 5 x 10 8 CFU / mL.
  • a method for the biological control of phytopathogenic organisms preferably fungi belonging to the species Alternar ⁇ a alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sciorotinia, Sclerotinia, Sclerotinia Thanatephorus cucumer ⁇ s and Verticillium dahliae; bacteria, preferably belonging to the species Agrobacter ⁇ um tumefaciens, Pectobacter ⁇ um atrosepticum, Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris and / or nematodes, such as the species of the genera Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Ratylenchus, and
  • a method for the biological control of phytopathogenic organisms preferably fungi belonging to the species Alternaria alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia scleruminia Thanatephorus cucumer ⁇ s and Verticillium dahliae comprising the stages of:
  • a method for the biological control of phytopathogenic organisms preferably of bacteria, preferably belonging to the species Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum and Xanthomonas campestris comprising the steps of:
  • v / v 0.5-5%
  • bacteria, cultures or compositions obtained in step a preferably once every 10 days, for 60 days, or once every day for 8-12 days.
  • a method for the biological control of phytopathogenic organisms preferably of nematodes, such as the species of the genera Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, and in the subject of the present invention general all plant parasitic nematodes, comprising the stages of: to.
  • nematodes such as the species of the genera Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, and in the subject of the present invention general all plant parasitic nematodes, comprising the stages of: to.
  • a method for the biological control of phytopathogenic organisms preferably of insects, such as species belonging to the Aphididae family, as well as insects belonging to species commonly referred to as white fly, is comprised of the present invention. stages of:
  • a method of stimulating plant growth comprising the steps of:
  • b. Contacting, for example, distribution systems, and / or drippers, and / or localized irrigation systems, and / or sprinklers, at least once, preferably at least twice, preferably at least three times, preferably at least four times , preferably at least five times, preferably at least six times, or more, to a plant (affected or not by a phytopathogen) using a distribution system for the bacteria, cultures or compositions of the present invention, where the cultures or Compositions have a concentration of microorganisms of at least 10 8 colony forming units (CFU) per ml_, used at a dilution between 0.5-5% (v / v), such as 0.5%, 1% , 1, 5%, 2%, 3% and / or 5% (v / v), with bacteria, cultures or compositions obtained in step a, preferably once every 10 days, for 60 days, once every day for 8-12 days, or twice in a 30-day period (once on time 0 days and again at 30 days time).
  • strain XT1 deposit number CECT8661
  • object of the invention was isolated in 1999 from a sample of the rhizosphere of a soil near the Capacete lagoon, located in Fuente de Piedra, Málaga (Spain).
  • the strain XT2 was isolated in 2010 in a soil near the mouth of the Velez River (Malaga, Spain).
  • the medium used was the MY medium (Moraine and Rogovin 1966) added with 7.5% of sea salts in the case of strain XT1 and the medium MY with 3% of sea salts in the case of strain XT2 Both strains were selected due to its characteristics among some 5000 colonies (looking for those with the highest surfactant activity by the method of Jain et al. 1991).
  • the activity against fungi was carried out by sowing the XT1, XT2 strains, the type and Botrybel strains in a small extension in PDA medium (potato dextrose agar). Next, a piece of agar of approximately 1 cm 2 was placed at the opposite end with mycelium of the fungus to be tested, and after 20 days and after incubation at 25 ° C, the maximum and minimum radius of the mycelium of the fungus was measured to calculate the percentage of fungus growth reduction
  • strains XT1 and XT2 and the type strain against Saccharomyces cerevisiae were also determined and the absence of it was observed, that is, the zone of inhibition was zero mm.
  • Example 3 Use of strains XT1, XT2 and type strain as antibacterial agents
  • the antibacterial activity was determined by incorporating, in a Petri dish with soy tripticase agar (TSA), an overlay with 6 ml of sterile TSA at 45 ° C and 1 mi of a crop of the phytopathogenic strain to be analyzed in exponential phase of growth in a concentration equivalent to scale 1 of Mac Farland. Then, once the medium solidified, it was inoculated in a well 100 of crop supernatant. After 24 hours of incubation, the inhibition zone was measured (Table 2. Figure 2).
  • Example 4 Use of strains XT1, XT2 and type strain as agents for biological control of nemaids a) Tests in tomato plants inoculated with Meloidogyne javanica (Fig. 3, 4, and 5)
  • strains XT1 and XT2 Greenhouse test with strain XT1 in a Dutch cucumber crop with recurring problems every year due to excess soil moisture, difficulty rooting and high incidence of root rot, as well as nematode infection.
  • a sector of 2000 m 2 was used to inject into drip irrigation and another similar sector as a control.
  • 7.5 L of culture were applied in 6 separate applications for a period of 10 days (1, 250 I of a crop with at least 10 8 CFU / mL in each application).
  • Both the fertilizer and phytosanitary treatments were maintained in both the control and treatment sector.
  • the number of plants lost during this treatment in the control sector was 36 while the one treated with strain XT1 was 6.
  • the differences in production were also significant, obtaining 30% more production in the treated sector.
  • Example 5 The differences in production were also significant, obtaining 30% more production in the treated sector.
  • strain XT1, XT2 and type strain as agents for biological control of insects a) Experiments were carried out in the laboratory with barley aphid (Rhopalosiphum padi) and Anthocoris nemoralis in order to determine the percentage of mortality , which originate the bacterial cultures of the three strains of B. methylotrophicus and their surfactants, on these insects. Since the first is a sucking insect, the tests are done only topically, while in the second case they are done both topically and ingestion.
  • the activity of bacterial cultures of strains XT1 and XT2 was analyzed with 5 x 10 8 CFU / ml, as well as their surfactants at a concentration of 1/1000 in distilled water, in both types of insects, by topical use. For each treatment, 10 individuals were used. In the case of Anthocoris, 5 ⁇ was applied with a pipette over their body and the same amount was impregnated with aphids with a brush. The bacterial culture medium SG was used as control. The results obtained expressed as a percentage of mortality after 48 hours are the following:
  • Example 6 Use of strains XT1, XT2 and type strain as phytofortifying agents a) Potted test with pepper plants (genus Capsicum) and squash (genus Cuc ⁇ rbita) with strains XT1, XT2 and type strain
  • Foliar treatments were carried out at three different doses of the culture broth containing at least 10 8 CFU / mL (0.5, 1 and 1.5% v / v) by spraying and with two repetitions (at zero time and at 30 days). In each treatment 6 plants were treated. An untreated control was used. During the study period, in the greenhouse, and therefore in the control, there were several pests: whitefly, aphid, oidium and Botrytis. The number of plants that were lost in the areas treated with the culture of strain XT1 was lower than those lost in the control area, the most appropriate dose being 1.5% (v / v). On the other hand, the weight of the tomatoes collected from the treated plants was higher than that of the control plant (see Table 6).

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de microorganismos como estimulantes del crecimiento vegetal y para el control biológico de bacterias, insectos, hongos y nematodos fitopatógenos. Más concretamente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos del género Bacillus, concretamente de la especie Bacillus methylotrophicus,a sus cultivos, a composiciones que comprenden estas bacterias, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden, como estimulantes del crecimiento vegetal y para el control biológico de bacterias, insectos, hongos y nematodos fitopatógenos.

Description

USO DE BACILLUS ME THYL O TROPHÍCUS COÍVÍO ESTIMULANTE DEL
BIOLÓGICO, Y CEPAS AISLADAS
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CAMPO TÉCNICO DE LA PRESENTE INVENCIÓN
La presente invención tiene como principal aplicación la agricultura. Las bacterias de la presente invención, así como los productos producidos por las mismas, tienen utilidad como estimulantes del crecimiento vegetal y para el control de patógenos de plantas como bacterias, insectos, hongos y nematodos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
1. Los organismos fitopatógenos
Los organismos fitopatógenos son una causa importante de las enfermedades de las plantas; determinan cambios en su forma, función o integridad y pueden conducir a su muerte. Entre ellos se encuentran los nematodos, bacterias, insectos, hongos y virus.
Uno de los grupos más importantes son los hongos fitopatógenos que incluyen, entre otros, especies de los géneros Botrytis, Pyíhium, Alternaría, Fusarium, Phytophthora, Rhizoctonia, Coiieotrichium, Eutypa, Rhizopus, PeniciHium, Sderotinia y Vertidíiium. Ocasionan daños locales, como machas foliares, hipertrofia de tejidos o tizón, o bien daños generalizados, cuando afectan a la raíz o al sistema vascular, ocasionando el marchitamiento y la muerte de la planta. Hay más de 8000 especies que atacan a las plantas, algunas son muy específicas, y otras tienen un amplio rango de hospedadores. El impacto económico que estos organismos ocasionan es muy importante. A modo de ejemplo, cuando Botrytis dnnerea afecta a las viñas se producen miles de toneladas de pérdidas en ¡a industria vinícola.
Las enfermedades de plantas producidas por bacterias tienen una incidencia menor que las producidas por los hongos o los virus (Vidhyasekaran 2002). Entre las bacterias fitopatógenas se encuentran: Erwinia amylovora, responsable de la enfermedad denominada fuego bacteriano, que afecta especialmente a peral, manzano, níspero, membrillero y rosáceas ornamentales; Erwinia carotovora (Pectobacterium carotovorum), productora de podredumbres blandas; Raistonia soianacearum, que causa podredumbre y marchitez en las solanáceas cultivadas, pero también en plantas de más de cincuenta familias; los distintos patovares de Pseudomonas syringae, que producen manchas, quemados y ulceraciones; Agrobacteríum tumefaciens, una bacteria causante de tumores en cuello, raíces y con menor frecuencia en tallo y que tiene un amplío espectro de huéspedes, abarcando más de 700 especies; y Xanthomonas campestris, responsable de manchas y quemados en plantas, entre otras.
Los nematodos tienen también gran importancia en la agricultura. Son gusanos microscópicos de entre 0,2-1 mm con un estilete en la parte superior que utilizan para alimentarse de la planta. Las larvas entran por cualquier parte del vegetal en contacto con el suelo húmedo, pero principalmente por la punta de los pelos absorbentes radiculares, ya que su estilete no es muy vigoroso. Una vez que se alojan en los tejidos no se mueven ni cambian de situación. Los síntomas se manifiestan por la aparición de ios típicos nodulos o engrasamientos en las raíces. Estos daños producen la obstrucción de vasos e impiden la absorción por las raíces, lo que se traduce en un menor desarrollo de las plantas y síntomas de marchitamiento, clorosis y enanismo. Entre los nematodos fitopatógenos se encuentran las especies de los géneros Meloidogyne, Heterodera, Radopholus y Pratylenchus.
Las plagas de insectos también son un importante problema en las plantas. En algunos casos son vectores de infecciones bacterianas y/o víricas. En otros, pueden debilitar la planta e incluso frenar su crecimiento y desarrollo, y su control o eliminación resulta tremendamente complejo. Es el caso de los escarabajos barrenadores, que perforan la corteza y se introducen bajo ella para construir sus galerías y que las hembras depositen los huevos. O el arañuelo del olivo, que chupa la savia de la planta picando en yemas, hojas, flores, frutos y brotes jóvenes a la vez que inyecta toxinas a la planta, deteniendo el crecimiento y deformando los órganos afectados. Otro ejemplo es la mosca blanca, que absorbe la savia hasta que las hojas empiezan a manifestar manchas moteadas amarillos y finalmente se secan. Además las secreciones producidas por este insecto favorecen la proliferación de hongos. Pulgones, hormigas podadoras, cochinillas, avispas serradoras, mariposas del geranio, escarabajos de las flores, etc son otros ejemplos de los principales insectos que causan daño en las plantas.
2. Control de los fitopatógenos
Para controlar los patógenos de plantas antes mencionados e incrementar los rendimientos de las cosechas se utilizan generalmente productos químicos, en algunos casos, con elevada toxicidad asociada, lo cual afecta negativamente al medioambiente. Tanto el agua como la tierra se están contaminando; se están destruyendo seres vivos fundamentales en la agricultura, como los insectos polinizadores, y se está afectando la salud de animales y de humanos. La Directiva 2009/128/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 21 de octubre de 2009, establece el marco de actuación para conseguir un uso sostenibie de dichos compuestos y señala ámbitos prioritarios para la puesta en marcha de acciones innovadoras ecológicamente sostenibies y que aumenten la productividad agrícola y la eficacia de los recursos.
Una alternativa al uso indiscriminado de productos químicos en agricultura es la utilización de microorganismos beneficiosos, tanto hongos como bacterias. Es un método no contaminante, respetuoso con el medio ambiente y que reduce notablemente los riesgos de adquisición de resistencia por parte de ios patógenos.
2.1 , Rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR)
Las rizobacterias son microorganismos del suelo que viven en las proximidades de las raíces y que son también muy utilizadas en el biocontrol. Ai ser en la mayoría de los casos bacterias que en su estado natural se encuentran en la rizosfera, no suelen dañar a otros organismos beneficiosos y además en muchos casos benefician al ecosistema estimulando el crecimiento vegetal y haciendo más sostenibie la producción agrícola. Por otra parte, sus efectos sobre la salud humana son mínimos o nulos. Estos microorganismos, llamados también rizobacterias promotoras del crecimiento o PGPR (de sus siglas en inglés, plañí growth promoting rhizobacteríá), colonizan las raíces de las plantas, compiten y controlan los patógenos de plantas, y actúan como fertilizantes.
Las PGPR se caracterizan por su capacidad de estimular el crecimiento de las plantas, a través de mecanismos de tipo directo o indirecto. La estimulación directa incluye la fijación de nitrógeno (Sessitsch et a/., 2002); la producción de hormonas, tales como auxinas, gibereiinas y citoquininas que aumentan el alargamiento, la división y el tamaño de las raíces (Perrine et al., 2004; García de Saiamone ef a/., 2001 ); la soiubilización de fosfatos (Rodríguez y Fraga, 1999); y la secreción de sideróforos (Carson et al., 2000), entre otros. La estimulación indirecta del crecimiento de plantas incluye diversos mecanismos de biocontrol de los organismos fitopatógenos (bacterias, hongos y nematodos entre otros) entre ios que se encuentran: la competencia por nicho ecológico o sustratos; la producción de enzimas hídrolítícos (proteasas, lipasas, quitinasas, colagenasas y glucanasas); la producción de antibióticos (Hassan et al. , 1997; Essalmani y Lahlou, 2003); la colonización de las raíces convirtiéndoias en "envolturas biológicas" que retrasan la invasión por los nematodos (Rodríguez-Kábana 1997; Loeppler 1997); la alteración de los exudados de las raíces, haciéndolas menos atractivas a los nematodos (Oostendorp, y Sikora, 1990); la producción de sideróforos y la producción por parte de algunas PGPR de compuestos volátiles como la acetoina y el 2,3 butanodiol que producen un aumento de la resistencia de las plantas a las infecciones (llamada también resistencia sistémica inducida o ISR) (Choudhary y Johri 2009) y la producción de H2S que impide el desarrollo de nematodos (Mena 2004 y 2005).
A través de todos los mecanismos descritos, las PGPR, a determinadas concentraciones en el suelo (al menos se requieren 106 microorganismos/mL) actúan, además de cómo estimulantes del crecimiento vegetal (fitofortificantes o f itof e rti I iza ntes) , como agentes de control biológico, evitando el desarrollo de bacterias, hongos y nematodos fitopatógenos.
Entre las bacterias PGPR más utilizadas se encuentran especies de ios géneros Arthrobacter, Azospirillum, BacUlus, Pseudomonas, Rhizobium y Serratia, entre otros (Kloepper et al. 2004) Otras como Tsukamurelia paurometabola se utilizan también, por ejemplo, en el bionematicida HeberNem®, efectivo en el control de Meloidogyne spp., Radopholus simiiis y Pratylenchus spp. Su modo de acción está relacionado con la liberación de sulfuro de hidrógeno y quitinasas (Mena, 2004 y 2005).
2.1.1. Bacterias de! género Baciílus
Unas de las bacterias más utilizaras en agricultura, en el control de patógenos o como PGPR, son las bacterias del género BacUlus.
Las bacterias de este género poseen muchas de las características anteriormente mencionadas, y por otra parte la formación de esporas permite a este género su viabilidad a largo plazo en ios preparados comerciales, a diferencia de otras rizobacterias como Pseudomonas, Rhizobium o Serratia.
En el mercado existen diversos productos comerciales del género BacUlus. Entre ellos se encuentran:
Producto Empresa Composición Control
Serenade"9 AgraQuest S. su //s QST713 Hongos y bacterias en frutos
Ecoguard* Novozyme B. licheniformis SB3088 Sclerotinia homoeocarpa
Kodiak81 Gustafson S. subtílís GB03 Hongos en algodón, soja y legumbres
Yield ShielcT Gustafson S. pumilus GB34 Hongos de la soja
BioYielcf Gustafson S. amylolique aciens Hongos GB99+S.suM//s GB122
Subtiíex18' Beker B. subtilis MB1600 Hongos en legumbres, algodón y soja
Underwood
Hi Síick Beker S. subtilis Hongos en soja
L+Su tilex® Underwood MBI &QQ+Rhizobium
Otras patentes/solicitudes de patente que describen el uso de microorganismos del género Bacilius para el control biológico son:
• Cepa de B. velezensis como biofungicida (US 2010/0179060 A1)
· Cepa de B. pumilus como nematicida (WO 2013/067275) .
• Cepa de B. pumilus como insecticida (WO2010146204).
• Cepa de B. thuringiensis como nematicida (WO 2010/078708 A1 , US 6077506)
• Cepa de B. thuringiensis, sus genes y toxinas como nematicida (EP 0853671).
• Tres cepas de Bacilius subtilis, Pseudomonas putida y Sporobolomyces roseus para el control de fitopatógenos (WO 2004/024865 A2).
• Varias cepas de Bacilius spp. y Brevibacillus parabrevis con efecto fungicida y bactericida (WO 2010/142055).
Otras bacterias utilizadas como PGPR y en control biológico están descritas en las patentes/solicitudes de patente siguientes:
· Cepa de Serratia para el control de patógenos (CA2822178 A1).
• Tres cepas de Bacilius thuringiensis, Bacilius mojavensis y Azospirillum brasilense como estimulantes del crecimiento de la planta y bionematicidas (WO2011 121408 A1).
• Una preparación conteniendo distintas cepas de Pseudomonas como estimulante del crecimiento de plantas y como agente de control biológico
(US6048713 A).
• Un cultivo de Delfíia acidovorans que oxida los sulfuras y estimula el crecimiento (US20080242543 A1).
• Cepas de Rhizobium para incrementar el crecimiento de las plantas (WO2003089640 A2).
Shan et al. (Crop Protection 44 (2013), 29-37) describen el uso de la cepa BC79 de Bacilius methylotrophicus en el biocontrol de la enfermedad del arroz, también conocida como añublo del arroz, causada por el hongo Magnaporthe oryzae ("rice blast" en inglés). Madhaiyan et al (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2010), 60, 2490-2495) describen Bacillus methylotrophicus sp., aislada de la rizosfera del arroz. Khusro et al. (Indian Journal of Research (2013) Vol. 2, Issue 1 1 , pages 243-244) describen la mejora de una nueva cepa de Bacillus methylotrophicus para la producción aumentada de metabolitos antimicrobianos.
A pesar de los numerosos intentos de desarrollar estrategias para la estimulación del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de bacterias, hongos y/o nematodos fitopatógenos, existe en la actualidad una imperiosa necesidad de desarrollar estrategias alternativas o estrategias mejores que las actuales, capaces de estimular el crecimiento vegetal y/o controlar biológicamente la presencia de fitopatógenos, como por ejemplo de bacterias, hongos y/o nematodos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al uso de microorganismos como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de bacterias, insectos, hongos y/o nematodos fitopatógenos. Más concretamente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos de la especie Bacillus methylotrophicus, a diferentes métodos de cultivo de dichos microorganismos y a los productos que los comprenden, como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de fitopatógenos como bacterias, insectos, hongos y/o nematodos. Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos de la especie Bacillus methylotrophicus, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden para el control biológico de fitopatógenos como bacterias, insectos, nematodos y hongos fitopatógenos.
En una realización particular, la presente invención se refiere al uso de microorganismos de la especie Bacillus methylotrQphicus, a diferentes métodos de cultivo de dichos microorganismos y a los productos que los comprenden, como estimulantes del crecimiento vegetal y para el control biológico de fitopatógenos como bacterias, insectos, hongos y nematodos fitopatógenos. Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos de la especie Bacillus methyiotrophicus, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden para el control biológico de bacterias fitopatógenas, nematodos fitopatógenos, insectos fitopatógenos y hongos fitopatógenos con excepción de los hongos pertenecientes a la especie Magnaporthe oryzae.
Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos de la de la especie Bacillus methylotrophicus, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden para el control biológico de bacterias como por ejemplo aquellas pertenecientes a la especie Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum y xanthomonas campestris, hongos como por ejemplo oidio, Botrytis o aquellos pertenecientes a las especies Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris y Verticillium dahliae, insectos como por ejemplo la mosca blanca y el pulgón y/o nematodos como por ejemplo las especies pertenecientes a los géneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, y en general todos los nematodos parásitos de plantas.
Es también objeto de la presente invención microorganismos pertenecientes a Bacillus methylotrophicus cepa XT1 (número de depósito CECT8661) depositada el 23 de abril de 2014 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) por la Universidad de Granada y/o microorganismos con un alto grado de homología con la cepa XT1 cuya secuencia de ADN del gen 16S rRNA sea idéntica en al menos el 99.6%, 99.7%, 99.8% o el 99.9% con la secuencia de ADN del gen 16S rRNA de la cepa XT1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dichas secuencias de ADN; y/o microorganismos pertenecientes a Bacillus methylotrophicus cepa XT2 (número de depósito CECT8662) depositada el 23 de abril de 2014 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) por la Universidad de Granada y/o microorganismos con un alto grado de homología con la cepa XT2 cuya secuencia de ADN del gen 16S rRNA sea idéntica en al menos el 99.6%, 99.7%, 99.8% o el 99.9% con la secuencia de ADN del gen 16S rRNA de la cepa XT2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dichas secuencias de ADN.
Es también objeto de la presente invención un cultivo de bacterias que comprende o consiste en microorganismos pertenecientes a Bacillus methylotrophicus cepa XT1 y/o microorganismos con un alto grado de homología con la cepa XT1 cuya secuencia de ADN del gen 16S rRNA sea idéntica en al menos el 99.6%, 99.7%, 99.8% o el 99.9% con la secuencia de ADN del gen 16S rRNA de la cepa XT1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dichas secuencias de ADN; y/o microorganismos pertenecientes a Bacillus methylotrophicus cepa XT2 y/o microorganismos con un alto grado de homología con la cepa XT2 cuya secuencia de ADN del gen 16S rRNA sea idéntica en al menos el 99.6%, 99.7%, 99.8% o el 99.9% con la secuencia de ADN del gen 16S rRNA de la cepa XT2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dichas secuencias de ADN.
La presente invención tiene además por objeto una composición que comprende microorganismos pertenecientes a Bacillus methylotrophicus cepa XT1 y/o microorganismos con un alto grado de homología con la cepa XT1 cuya secuencia de ADN del gen 16S rRNA sea idéntica en al menos el 99.6%, 99.7%, 99.8% o el 99.9% con la secuencia de ADN del gen 16S rRNA de la cepa XT1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dichas secuencias de ADN; y/o microorganismos pertenecientes a Bacillus methylotrophicus cepa XT2 y/o microorganismos con un alto grado de homología con la cepa XT2 cuya secuencia de ADN del gen 16S rRNA sea idéntica en al menos el 99.6%, 99.7%, 99.8% o el 99.9% con la secuencia de ADN del gen 16S rRNA de la cepa XT2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dichas secuencias de ADN.
La presente invención tiene por objeto también el uso de las bacterias, cultivos y/o composiciones anteriormente descritas en un procedimiento para estimular el crecimiento vegetal y/o en un procedimiento de control biológico de organismos fitopatógenos.
En particular, es objeto de la presente invención el uso de las bacterias pertenecientes a las cepas XT1 o XT2 (o aquellos microorganismos que presenten un alto grado de homología con estas cepas, tal y como se ha descrito anteriormente), sus cultivos o composiciones que las comprenden, así como de los productos que comprenden alguna de ellas o de los productos obtenibles de ellas o de su cultivo como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de patógenos de plantas, como bacterias, insectos, hongos y/o nematodos. En particular, es objeto de la presente invención el uso de las bacterias pertenecientes a las cepas XT1 o XT2 (o aquellos microorganismos que presenten un alto grado de homología con estas cepas, tal y como se ha descrito anteriormente), sus cultivos o composiciones que las comprenden, así como de los productos que comprenden alguna de ellas o de los productos obtenibles de ellas o de su cultivo como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de patógenos de plantas, como hongos (con excepción de hongos pertenecientes a la especie Magnaporthe oryzaé) y/o nematodos.
Preferiblemente, las bacterias pertenecientes a las cepas XT1 o XT2 (o aquellos microorganismos que presenten un alto grado de homología con estas cepas), sus cultivos o composiciones que las comprenden, así como los productos que comprenden alguna de ellas o los productos obtenibles de ellas o de su cultivo se usan como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de patógenos de plantas, seleccionados de la lista que comprende o consiste en:
Bacterias pertenecientes a las especies Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas campestris, hongos pertenecientes a las especies Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris y Verticillium dahliae, insectos pertenecientes a la familia Aphididae, así como insectos pertenecientes a las especies denominadas comúnmente mosca blanca y/o nematodos, como por ejemplo los pertenecientes a los géneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema y/o Trichodorus.
Preferiblemente, las bacterias pertenecientes a las cepas XT1 o XT2 (o aquellos microorganismos que presenten un alto grado de homología con estas cepas, tal y como se ha descrito anteriormente), sus cultivos o composiciones que las comprenden, así como los productos que comprenden alguna de ellas o los productos obtenibles de ellas o de su cultivo se usan como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de nematodos, preferiblemente nematodos pertenecientes una de los siguientes géneros: Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema y/o Trichodorus. Preferiblemente, las bacterias pertenecientes a las cepas XT1 o XT2 (o aquellos microorganismos que presenten un alto grado de homología con estas cepas, tal y como se ha descrito anteriormente), sus cultivos o composiciones que las comprenden, así como los productos que comprenden alguna de ellas o los productos obtenibles de ellas o de su cultivo se usan como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas campestris. Preferiblemente, las bacterias pertenecientes a las cepas XT1 o XT2 (o aquellos microorganismos que presenten un alto grado de homología con estas cepas, tal y como se ha descrito anteriormente), sus cultivos o composiciones que las comprenden, así como los productos que comprenden alguna de ellas o los productos obtenibles de ellas o de su cultivo se usan como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de hongos pertenecientes a las especies Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris y Verticillium dahliae, aún más preferente para el control biológico de Botrytis cinnerea.
Preferiblemente, las bacterias pertenecientes a las cepas XT1 o XT2 (o aquellos microorganismos que presenten un alto grado de homología con estas cepas, tal y como se ha descrito anteriormente), sus cultivos o composiciones que las comprenden, así como los productos que comprenden alguna de ellas o los productos obtenibles de ellas o de su cultivo se usan como estimulantes del crecimiento vegetal y/o para el control biológico de insectos pertenecientes a la familia Aphididae, así como insectos pertenecientes a las especies denominadas comúnmente "mosca blanca", en particular, la especie Trialeurodes vaporariorum, predominante en invernaderos.
La presente invención tiene también por objeto un procedimiento para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones según lo descrito anteriormente; y
b. Poner en contacto una planta con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidas en la etapa a). La presente invención tiene también por objeto un procedimiento para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones según lo descrito anteriormente; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidas en la etapa a). La presente invención tiene también por objeto un procedimiento de control biológico de organismos fitopatógenos que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones según lo descrito anteriormente; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidas en la etapa a).
La presente invención tiene también por objeto un procedimiento de control biológico de hongos fitopatógenos pertenecientes a las especies Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris y
Verticillium dahliae, preferiblemente pertenecientes a la especie Botrytis cinnerea, que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones según lo descrito anteriormente; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidas en la etapa a.
La presente invención tiene también por objeto un procedimiento de control biológico de bacterias fitopatógenas pertenecientes a la especie Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum yXanthomonas campestris que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones según lo descrito anteriormente; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidas en la etapa a. La presente invención tiene por objeto un procedimiento de control biológico de nematodos fitopatogenos (como por ejemplo especies de Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema y/o Trichodorus) que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones según lo descrito anteriormente; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidas en la etapa a).
La presente invención también tiene por objeto un procedimiento de control biológico de insectos fitopatogenos pertenecientes a la familia Aphididae, así como insectos pertenecientes a las especies denominadas comúnmente mosca blanca que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones según lo descrito anteriormente; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidas en la etapa a). Los procedimientos descritos en la presente invención pueden además comprender el uso de un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender el uso de goteros para la distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender el uso de goteros autocom pensantes para la distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender el uso de sistemas de riego localizado (como por ejemplo microaspersores con elementos giratorios o difusores) para la distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender el uso de aspersores para la distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención.
En una realización preferente, los procedimientos mencionados anteriormente emplean bacterias, cultivos de bacterias o composiciones que comprenden Bacillus methyiotrophicus, cepas XT1 y/o XT2, depositadas ante la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT8661 y CECT8662, respectivamente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Con la intención de complementar la descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de la invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:
Figura 1. Zona de inhibición de XT1 y XT2 frente a Botrytis y zona de inhibición de XT1 frente a Fusarium.
Figura 2. Actividad de la cepa XT1 frente a Agrobacterium tumefaciens
Figura 3. Factor de multiplicación de M. javanica en planas de tomate tratadas con las cepas XT1 , XT2 y cepa tipo.
Figura 4. Número medio de nematodos encontrados por planta tratada con las cepas XT1 , XT2 y cepa tipo.
Figura 5.- Número medio de de nematodos por g de raíz encontrados plantas tratadas con las cepas XT1 , XT2 y cepa tipo.
Figura 6. Nectarino afectado por una plaga de pulgones antes del tratamiento con la cepa XT1.
Figura 7. Crecimiento de plantas de calabaza tras 50 días de cultivo en maceta a temperatura ambiente. Las macetas B1 y B2 se han inoculado con la cepa XT1 mientras que las B3 y B4 no se han inoculado para utilizarlas de control.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al uso de microorganismos como estimulantes del crecimiento vegetal y para el control biológico de bacterias, insectos, hongos y nematodos fitopatógenos. Más concretamente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos del género Bacillus, concretamente de la especie Bacillus methyiotmphicus, a sus cultivos, a composiciones que comprenden estas bacterias, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden, como estimulantes del crecimiento vegetal y para el control biológico de bacterias, insectos, hongos y nematodos fitopatógenos. Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos de la especie Bacillus methyíotrophícus, a sus cultivos, a composiciones que comprenden estas bacterias, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden para el control biológico de bacterias, insectos, nematodos fitopatógenos y hongos.
Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos de la especie Bacillus methyíotrophicus, a sus cultivos, a composiciones que comprenden estas bacterias, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden para el control biológico de bacterias, insectos, nematodos fitopatógenos y hongos, con excepción de los hongos pertenecientes a la especie Magnaporthe oryzae.
Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso de microorganismos de la de la especie Bacillus methy!oirophicus, a sus cultivos, a composiciones que comprenden estas bacterias, a diferentes métodos de cultivo y a los productos que los comprenden para el control biológico de bacterias pertenecientes a las especies Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas campestres; de hongos pertenecientes a las especies Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris y Verticillium dahliae; de insectos pertenecientes a la familia Aphididae, así como insectos pertenecientes a las especies denominadas comúnmente mosca blanca y/o de nematodos como por ejemplo especies de Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, y en general todos los nematodos parásitos de plantas.
El control biológico o biocontrol se define en la presente invención como un método de control de plagas, enfermedades y malezas que consiste en utilizar organismos vivos con objeto de controlar las poblaciones de otro organismo (organismos fitopatógenos).
En una realización particular, la invención se refiere a bacterias que pertenecen a la cepa con número de depósito CECT8661 , depositada el 23 de abril de 2014 por la Universidad de Granada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). A lo largo de la presente memoria se podrá hacer referencia a esta cepa con el término "cepa XT1". En otra realización particular, la invención se refiere a bacterias que pertenecen a la cepa con número de depósito CECT8662, depositada el 23 de abril de 2014 por la Universidad de Granada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). A lo largo de la presente memoria se podrá hacer referencia a esta cepa con el término "cepa XT2".
Es objeto de la presente invención el uso de las bacterias pertenecientes a las cepas
XT1 y/o XT2, en un procedimiento de control biológico de organismos fitopatogenos y/o en un procedimiento de estimulación del crecimiento vegetal.
Las cepas XT1 y XT2 pertenecen a la especie Bacillus methyiotrophicus. Esta especie fue descrita por Madhaiyan et al. en 2010. Fue aislada de la rizosfera de una planta de arroz (Oryza sativa). La especie Bacillus methyiotrophicus está muy relacionada filogenéticamente con Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. licheniformis y B. amyloliquefaciens microorganismos con diversas aplicaciones en el campo de la agricultura. El porcentaje de identidad con estas especies oscila entre 98,2 y 99,2 %. La cepas XT1 y XT2 tienen un 99,5 % y un 99,3%, respectivamente, de identidad con la especie tipo de B. methyiotrophicus. Esta conclusión se alcanzó tras secuenciar el gen completo del RNAr 16S (1500 pb).
La clasificación científica de las cepas XT1 y XT2 de la presente invención es la siguiente: Dominio: Bacteria I Filo: Firmicutesl Clase: Bacillil Orden: Bacillalesl Familia: Bacillaceae I Género: Bacillus.
Ambas cepas son bacilos Gram positivos esporulados. Su tamaño oscila entre 1 ,5 y 3,5 μηι de longitud por 0,5 μηι de ancho. Originan colonias de color blanco-marfil de bordes irregulares. Son oxidasa negativo y catalasa positivo. Las cepas XT1 y XT2 presentan flagelos perítricos que les confieren una gran movilidad. Originan biofilms o películas que permiten su adherencia a sustratos animados e inanimados y que actúan como factor de protección frente a depredadores existentes en el medio ambiente. La formación de biofilms facilita la adherencia del microorganismo; si se administra por riego por goteo se adherirá a las raíces. Si se administra por vía foliar se mantendrá en la filosfera. Además la formación de biofilm tanto en las raíces como en las hojas y tallo protege a la planta frente al ataque de otros seres vivos. En consecuencia, tanto la presencia de flagelos como la formación de biofilm suponen una ventaja que poseen estas bacterias (XT1 y XT2) para la colonización del hábitat.
Las cepas XT1 y XT2 originan esporas elipsoidales no deformantes. En el medio 2xSG, estas bacterias producen entre tres y cinco días más de 5 x 108 esporas/mL. Son halotolerantes, crecen óptimamente en un amplio rango de concentraciones de sal [entre el 0 y el 12% (p/v)]. Crecen óptimamente entre 20-45°C y a pH de entre 5- 10. Sus requerimientos nutricionales son escasos: pueden crecer con una gran variedad de compuestos orgánicos como única fuente de carbono, como citrato o sacarosa. Son capaces de crecer con nitrato amónico como única fuente de nitrógeno, sin necesidad de la presencia de extracto de levadura o de una fuente de nitrógeno compleja.
La formación de esporas, que permite a la bacteria su mantenimiento en el hábitat en condiciones adversas, y los escasos requerimientos nutricionales que permiten la elaboración de medios de cultivo de bajo coste, hacen a las cepas XT1 y XT2 muy atractivas desde el punto de vista industrial.
Las cepas XT1 y XT2 son anaerobias facultativas. Respiran aerobiamente en presencia de oxígeno y, en ausencia de éste, por ejemplo en las raíces y en las cercanías de éstas, realizan fermentación butanodiólica, produciendo 2,3 butanodiol y acetoína. Utilizan numerosos azúcares como fuente de carbono y energía, produciendo ácidos a partir de ellos. Entre los azúcares que estas cepas utilizan se encuentran el glicerol, la glucosa, la fructosa, el manitol, el sorbitol, la celobiosa, la lactosa y la sacarosa. También pueden realizar la fijación de nitrógeno, es decir en ausencia de una fuente nitrogenada captan el nitrógeno gaseoso y lo transforman en amonio que es la fuente de nitrógeno utilizable por las plantas. Producen dihidroxiacetona y H2S.
Las cepas XT1 y XT2 son capaces de sintetizar compuestos quelantes, como los compuestos sideróforos, que captan el Fe3+ y lo transforman en Fe2+. El ion hierro Fe3+ tiene muy poca solubilidad a pH neutro y por ende no puede ser utilizado por los organismos. Los sideróforos disuelven estos iones a complejos de Fe2+, que pueden ser asimilados por mecanismos de transporte activo. Las cepas XT1 y XT2 son capaces de producir numerosos enzimas extracelulares con una alta capacidad hidrolítica, lo cual facilita la disponibilidad de sustratos a las plantas. Entre otros, las cepas XT1 y XT2 son capaces de producir amilasas que hidrolizan el almidón, ureasa que hidroliza la urea originando amonio, proteasas que hidrolizan la gelatina y la caseína, lipasas que hidrolizan el tween 80 y la lecitina, DNasas que hidrolizan el DNA, fosfatasas que hidrolizan el fosfato orgánico y el fosfato inorgánico y ACC desaminasa.
Las cepas XT1 y XT2 producen en medio CAS, utilizado para la detección de sideróforos, una zona de aclaración mayor (7 y 5 mm respectivamente) que la cepa de Bacillus velezensis de Botrybel usada de control y que produce 3 mm. Ambas cepas crecen mejor que la cepa control (se observa una mayor cantidad de masa bacteriana en la superficie del medio sólido) en medios sólidos libres de nitrógeno, indicando una mayor actividad fijadora de nitrógeno. Por tanto su actividad como fertilizante microbiano es mayor.
Las cepas XT1 y XT2 son capaces de formar biofilm. Esta actividad no ha sido determinada en el preparado comercial anterior. Esta capacidad permite a las bacterias adherirse más fácilmente a las raíces o a las hojas de las plantas para ejercer su acción fitoprotectora o estimulante del crecimiento.
En particular, se ha comprobado que las cepas XT1 y/o XT2 objeto de la presente invención tienen una actividad enzimática superior a la cepa del preparado Botrybel; producen mayores halos de hidrólisis frente al almidón (actividad amilasa, véase la Figura 3), gelatina y caseína (actividad proteasa), tween 80 y lecitina (actividad lipasa), y mayor actividad ACC desaminasa y fosfatasa, determinada utilizando fosfato de fenolftaleína y fosfato cálcico. Los halos de hidrólisis se observan como la aparición de una zona transparente en el caso de la hidrólisis del almidón, caseína y lecitina; para la gelatina se observa la licuación de la misma, es decir el paso a estado sólido a líquido; en el caso del tween 80 aparece una zona más opaca de precipitación; para la actividad ACC desaminasa se estudia el crecimiento en medios con amino ciclo propano carboxilico como única fuente de nitrógeno y finalmente la actividad fosfatasa se observa con la aparición de un color rosa al adicionar amoniaco en la placa con fosfato de fenolftaleína y la solubilización de fosfato cálcico se analiza viendo la zona transparente que se origina alrededor de la masa bacteriana crecida en un medio con este compuesto. Las actividades se han analizado utilizando como control la cepa de Bacillus velezensis del preparado Botrybel.
En cuanto a sus actividades como agentes de control biológico frente a hongos, se han determinado los valores de inhibición que presentan las cepas XT1 y XT2 y la cepa tipo de B. methylothrophicus frente a Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusaríum oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris y Verticillium dahliae. Los valores de inhibición de crecimiento son muy significativos en el caso de Botrytis cinnerea. La actividad fue inferior frente a Fusaríum oxysporum. En general la cepa de Bacillus de Botrybel presenta una actividad inferior (y en algunos casos semejante) a las cepas XT1 y XT2 y cepa tipo (véase la tabla 1 en el Ejemplo 2, más adelante).
Las cepa XT1 y la cepa tipo de B. methylothrophicus presentan también actividad frente a bacterias fitopatogenas como Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas campestris mientras que la cepa XT2 presenta actividad frente a P. atrosepticum y X. campestris (véase tabla 2 en el ejemplo 3, más adelante). Las cepas XT1 , XT2 y la cepa tipo de B. methylothrophicus presentan actividad frente a Rhopalosiphum padi (véase tabla 3) y la cepa XT1 frente a mosca blanca (véase ejemplo 6, b1 , más adelante).
Las cepas XT1 , XT2 y la cepa tipo de B. methylothrophicus disminuyen considerablemente el factor de multiplicación de Meloidogyne javanica y el numero de nematodos por planta de tomate y el número de nematodos por g de raíz (véase las figuras 3, 4 y 5) igualmente el tratamiento con la cepa XT1 recuperó plantas de pepino holandés cultivadas en invernadero y altamente infectadas por nematodos, (véase ejemplo 4b, más adelante) Otra ventaja de las cepas XT1 y XT2 es su elevada sensibilidad a los agentes antimicrobianos generalmente utilizados en terapéutica. Son sensibles al ácido nalidixico (30 μg), amoxicilina (2 μg), amoxicilina-ácido clavulánico (30 μg), cefalotina (30 μg), colistina (10 μg), doxiciclina 30 μg, eritromicina (15 μg), kanamicina (30 μg), nitrofurantoina (300 μg), norfloxacina (5 μg), novobiocina (30 μg), rifampicina (30 μg), trimetoprim sulfametoxazol (1 ,25 μg-23,75 μg) y vancomicina (30 μg) siguiendo la técnica de difusión en medio sólido (Bauer y Kirby 1966). Por tanto no pueden transferir genes de resistencia a otras poblaciones microbianas de la rizosfera.
Las cepas XT1 , XT2 y la cepa tipo de B. methylotrophicus presentan una ventaja adicional frente a hongos empleados para el control biológico y como estimulantes del crecimiento vegetal, que es su fácil cultivo y por tanto su fácil obtención a nivel industrial. La ventaja frente a otras cepas bacterianas de otros géneros descritas con el mismo propósito es la presencia de esporas por parte de las cepas XT1 y XT2, lo que supone una total estabilidad del producto durante el almacenaje y en el medio ambiente cuando las condiciones no son las adecuadas para la multiplicación de dichos microorganismos. Las cepas XT1 y XT2 y la cepa tipo de B. methylotrophicus producen compuestos que disminuyen el pH como 2,3 butanodiol y acetoína cuando fermentan azúcares en condiciones de anaerobiosis. Además, son capaces de fijar nitrógeno, producir sideróforos y enzimas hidrolíticos. Todas estas características son mecanismos de estimulación directa del crecimiento de las plantas (Sessitsch et al., 2002; Perrine et al., 2004; Rodríguez y Fraga, 1999; Carson et al. 2000; Essalmani y Lahlou, 2003; Choudhary y Johri 2009).
Las cepas XT1 y XT2 y cepa tipo producen distintos lipopéptidos, surfactantes. Entre estos lipopéptidos surfactantes se encuentra la surfactina, semejante a la producida por Bacillus subtilis. En particular, la surfactina producida por la cepa XT1 no presenta ácidos grasos de 12 carbonos (12C) en su cadena lipídica.
Tras la extracción de los lipopéptidos, siguiendo el método de Cooper et al. 1981 , se obtuvo para las cepas XT1 y XT2 un rendimiento de 0, 12 g/L y 0, 10 g/L de cultivo respectivamente. La cepa tipo produjo 0,6 g/L. En el caso de la cepa de Bacillus del preparado comercial Botrybel no se ha descrito la producción de lipopéptidos. En particular, además de la surfactina, la cepa XT1 objeto de la presente invención produce otros lipopéptidos surfactantes del tipo fengicina y lichenisina. El peso seco celular (PSC) de las cepas XT1 , XT2 y de la cepa tipo es de 2,7 g/L, 2.5 g/L y 2,9 g/L respectivamente. En el caso de la cepa XT1 , la concentración micelar crítica (CMC) es de 0.0025% (0.025 mg/mL); con este valor se obtuvo una tensión superficial de 29.7mN/m. En el caso de la surfactina producida por B. subtilis y comercializada por Sigma® se obtuvieron valores de 26,7 mN/m a la misma CMC. Es decir, la cepa XT1 produce lipopéptidos surfactantes muy activos y con actividad análoga a la surfactina disponible comercialmente.
Muchos lipopéptidos producidos por especies de Bacillus presentan actividad antibiótica, actuando a nivel de las membranas celulares de hongos y bacterias Gram negativas son, por ejemplo, fengicinas, micobacilinas, iturinas, bacilomicinas, surfactinas, micosubtilinas, fungistatinas (Volpon et al., 2000; Yilmaz et al. 2006).
En particular, los lipopéptidos producidos por la cepa XT1 son una mezcla de ácidos grasos de 13, 14 y 15 átomos de carbono, que se unen a un péptido cíclico por leucina o isoleucina. La proporción relativa de estos ácidos grasos es 1 , 6,5 y 5,7 respectivamente.
La producción de enzimas (glucanasas, proteasas, lipasas, fosfatasas y ureasa) junto con los distintos lipopéptidos, y la liberación de SH2 son, de acuerdo con la bibliografía (véase estado de la técnica), responsables de la acción de dichas cepas en el control biológico de hongos, bacterias, insectos y nematodos.
También es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico de organismos fitopatogenos que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto una planta con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidos en la etapa a). También es objeto de la presente invención un procedimiento para estimular el crecimiento vegetal y/o para el control biológico de nematodos fitopatogenos (como por ejemplo las especies de los géneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, y en general todos los nematodos parásitos de plantas) que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
ter Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidos en la etapa a. También es objeto de la presente invención un procedimiento para estimular el crecimiento vegetal en plantas (preferiblemente no afectada por organismos fitopatógenos) que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto una planta preferiblemente no afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidos en la etapa a.
La presente invención tiene también por objeto un procedimiento para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidos en la etapa a.
La presente invención tiene por objeto un procedimiento de control biológico de insectos fitopatógenos pertenecientes a la familia Aphididae, así como insectos pertenecientes a las especies denominadas comúnmente mosca blanca que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones según lo descrito anteriormente; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones obtenidas en la etapa a). En los procedimientos de la presente invención, las bacterias, cultivos y/o composición de la presente invención se pueden poner en contacto con la planta (afectada) por vía foliar, como por ejemplo mediante pulverización y/o goteo, o por riego tradicional, o por inundación, etc. Los procedimientos descritos en la presente invención pueden además comprender el uso de un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender el uso de goteros para la distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender el uso de goteros autocom pensantes para la distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender el uso de sistemas de riego localizado (como por ejemplo microaspersores, opcionalmente con elementos giratorios o difusores) para la distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender el uso de aspersores para la distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención.
Los sistemas de riego localizado se pueden definir como métodos de distribución de fluidos (agua, fertilizantes, o, en el caso que nos ocupa, las bacterias, cultivos o composiciones de acuerdo con la presente invención), que, para mantener un nivel adecuado y constante del fluido que distribuye en el suelo, aplica dicho fluido gota a gota, de manera lenta, localizada y uniforme en la masa radicular de la planta. Los sistemas de riego localizado pueden comprender sistemas de goteo, de exudación y/o de microaspersión.
La persona experta en la materia conoce cómo funcionan los sistemas de riego localizado y cómo hacer uso de ellos.
Un gotero de acuerdo con la presente invención se define como un punto de emisión de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención en la proximidad de las plantas que se quieren tratar. La persona experta en la materia conoce cómo funciona un gotero y cómo hacer uso de él. Por lo tanto, también es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico (prevención) de organismos fitopatogenos, preferiblemente hongos, bacterias y nematodos, que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto una planta utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, con bacterias, cultivos o composiciones obtenidas en la etapa a.
De acuerdo con la presente invención, prevención es la disposición que se hace de forma anticipada para minimizar un riesgo. El objetivo de prevenir de acuerdo con la presente invención es lograr que un perjuicio eventual (infección de organismos fitopatogenos) no ocurra.
Por lo tanto, también es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico (tratamiento) de organismos fitopatogenos, preferiblemente hongos, bacterias, insectos y nematodos, que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, con las bacterias, cultivos o composiciones obtenidas en la etapa a.
En el contexto de la presente invención, el término "tratamiento" se entiende como el conjunto de medios cuya finalidad es la curación o el alivio (paliación) de las enfermedades o síntomas.
Por lo tanto, también es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico de organismos fitopatogenos, preferiblemente hongos (excepto los pertenecientes a la especie Magnaporthe oryzaé), bacterias (preferiblemente Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas campestris, insectos (preferiblemente insectos fitopatogenos pertenecientes a la familia Aphididae, así como insectos pertenecientes a las especies denominadas comúnmente mosca blanca), y/o nematodos (como por ejemplo las especies pertenecientes a los géneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, y en general todos los nematodos parásitos de plantas), que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, con las bacterias, cultivos o composiciones obtenidas en la etapa a.
También es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico de organismos fitopatógenos, preferiblemente de hongos pertenecientes a las especies Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumerís y Verticillium dahliae, bacterias, preferiblemente pertenecientes a la especie Agrobacteríum tumefaciens, Pectobacteríum atrosepticum, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas campestrís y/o nematodos, como por ejemplo las especies de los géneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, y en general todos los nematodos parásitos de plantas, que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, con bacterias, cultivos o composiciones obtenidos en la etapa a.
Los sistemas de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención pueden comprender sistemas de riego localizado, goteros, goteros autocompensantes, microaspersores, y/o aspersores. Además, en el procedimiento de la presente invención, las bacterias, cultivos y/o composiciones de la presente invención se pueden poner en contacto con la planta afectada al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más.
Además, el intervalo de tiempo entre una aplicación de las bacterias, cultivo a/o composición de la presente invención y la siguiente (en el caso en el que se pongan en contacto o apliquen más de una vez) es de 2 días, o 3 días, o 5 días, o 10 días, o 15 días, o 20 días, o 30 días.
Preferiblemente las bacterias, cultivo y/o composición de la presente invención se ponen en contacto con la planta afectada dos veces, una a tiempo (t) = 0 y otra a los 30 días.
Preferiblemente las bacterias, cultivo y/o composición de la presente invención se ponen en contacto con la planta afectada una vez cada 10 días, durante 60 días, o una vez cada día durante 8-12 días. Además, en el procedimiento de la presente invención, el cultivo y/o composición de la presente invención que presentan una concentración de microorganismos de al menos 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml_ son utilizados a una dilución entre 0,5-5%.(v/v), como por ejemplo de 0,5%, 1 %, 1 ,5%, 2%, 3% y/o 5% (v/v). Preferiblemente en el procedimiento de la presente invención, el cultivo y/o composición de la presente invención presentan una concentración de microorganismos de1 ,5% (v/v) de un preparado que contenga 5 x 108 UFC/mL.
Por lo tanto, es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico de organismos fitopatógenos, preferiblemente de hongos pertenecientes a las especies Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumerís y Verticillium dahliae; bacterias, preferiblemente pertenecientes a la especie Agrobacteríum tumefaciens, Pectobacteríum atrosepticum, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas campestris y/o nematodos, como por ejemplo las especies de los géneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, insectos pertenecientes a la familia Aphididae, así como insectos pertenecientes a las especies denominadas comúnmente mosca blanca y en general todos los nematodos parásitos de plantas e insectos, preferiblemente la mosca blanca, el pulgón, que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto mediante por ejemplo sistemas de distribución, y/o goteros, y/o sistemas de riego localizado, y/o aspersores, al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más, a una planta afectada por un fitopatógeno utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, donde los cultivos o composiciones presentan una concentración de microorganismos de al menos 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml_, utilizados a una dilución entre 0,5-5%.(v/v), como por ejemplo de 0,5%, 1 %, 1 ,5%, 2%, 3% y/o 5% (v/v), con bacterias, cultivos o composiciones obtenidos en la etapa a, preferiblemente una vez cada 10 días, durante 60 días, o una vez cada día durante 8-12 días.
Por lo tanto, es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico de organismos fitopatogenos, preferiblemente de hongos pertenecientes a las especies Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumerís y Verticillium dahliae que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto mediante por ejemplo sistemas de distribución, y/o goteros, y/o sistemas de riego localizado, y/o aspersores, al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más, a una planta afectada por un fitopatógeno utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, donde los cultivos o composiciones presentan una concentración de microorganismos de al menos 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml_, utilizados a una dilución entre 0,5-5%.(v/v), como por ejemplo de 0,5%, 1 %, 1 ,5%, 2%, 3% y/o 5%
(v/v), con bacterias, cultivos o composiciones obtenidos en la etapa a, preferiblemente una vez cada 10 días, durante 60 días, o una vez cada día durante 8-12 días. Por lo tanto, es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico de organismos fitopatogenos, preferiblemente de bacterias, preferiblemente pertenecientes a la especie Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum, Ralstonia solanacearum yXanthomonas campestris que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto mediante por ejemplo sistemas de distribución, y/o goteros, y/o sistemas de riego localizado, y/o aspersores, al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más, a una planta afectada por un fitopatógeno utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, donde los cultivos o composiciones presentan una concentración de microorganismos de al menos 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml_, utilizados a una dilución entre
0,5-5%. (v/v), como por ejemplo de 0,5%, 1 %, 1 ,5%, 2%, 3% y/o 5% (v/v), con bacterias, cultivos o composiciones obtenidos en la etapa a, preferiblemente una vez cada 10 días, durante 60 días, o una vez cada día durante 8-12 días.
Por lo tanto, es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico de organismos fitopatogenos, preferiblemente de nematodos, como por ejemplo las especies de los géneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema, Trichodorus, y en general todos los nematodos parásitos de plantas, que comprende las etapas de: a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto mediante por ejemplo sistemas de distribución, y/o goteros, y/o sistemas de riego localizado, y/o aspersores, al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más, a una planta afectada por un fitopatógeno utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, donde los cultivos o composiciones presentan una concentración de microorganismos de al menos 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml_, utilizados a una dilución entre 0,5-5%.(v/v), como por ejemplo de 0,5%, 1 %, 1 ,5%, 2%, 3% y/o 5% (v/v), con bacterias, cultivos o composiciones obtenidos en la etapa a, preferiblemente una vez cada 10 días, durante 60 días, o una vez cada día durante 8-12 días.
Por lo tanto, es objeto de la presente invención un procedimiento para el control biológico de organismos fitopatogenos, preferiblemente de insectos, como por ejemplo las especies pertenecientes a la familia Aphididae, así como insectos pertenecientes a las especies denominadas comúnmente mosca blanca, que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto mediante por ejemplo sistemas de distribución, y/o goteros, y/o sistemas de riego localizado, y/o aspersores, al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más, a una planta afectada por un fitopatógeno utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, donde los cultivos o composiciones presentan una concentración de microorganismos de al menos 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml_, utilizados a una dilución entre 0,5-5%. (v/v), como por ejemplo de 0,5%, 1 %, 1 ,5%, 2%, 3% y/o 5%
(v/v), con bacterias, cultivos o composiciones obtenidos en la etapa a, preferiblemente una vez cada 10 días, durante 60 días, o una vez cada día durante 8-12 días. Por lo tanto, es objeto de la presente invención un procedimiento para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
a. Obtener las bacterias, cultivos de bacterias o composiciones de acuerdo con la presente invención; y
b. Poner en contacto mediante por ejemplo sistemas de distribución, y/o goteros, y/o sistemas de riego localizado, y/o aspersores, al menos una vez, preferiblemente al menos dos veces, preferiblemente al menos tres veces, preferiblemente al menos cuatro veces, preferiblemente al menos cinco veces, preferiblemente al menos seis veces, o más, a una planta (afectada o no por un fitopatógeno) utilizando para ello un sistema de distribución de las bacterias, cultivos o composiciones de la presente invención, donde los cultivos o composiciones presentan una concentración de microorganismos de al menos 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml_, utilizados a una dilución entre 0,5-5%.(v/v), como por ejemplo de 0,5%, 1 %, 1 ,5%, 2%, 3% y/o 5% (v/v), con bacterias, cultivos o composiciones obtenidos en la etapa a, preferiblemente una vez cada 10 días, durante 60 días, una vez cada día durante 8-12 días, o dos veces en un periodo de 30 días (una vez a tiempo 0 días y otra vez a tiempo 30 días). A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El término "comprende" engloba también al término "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS Ejenip!o 1 , Aislamiento de las cepas XT1 y XT2 La cepa XT1 (número de depósito CECT8661), objeto de la invención fue aislada en 1999 de una muestra de la rizosfera de un suelo cercano a la laguna de Capacete, situada en Fuente de Piedra, Málaga (España). La cepa XT2 (número de depósito CECT8662) fue aislada en 2010 en un suelo cercano a la desembocadura del río Velez (Málaga, España). El medio empleado fue el medio MY (Moraine y Rogovin 1966) adicionado con un 7.5 % de sales marinas en el caso de la cepa XT1 y el medio MY con un 3% de sales marinas en el caso de la cepa XT2 Se seleccionaron ambas cepas por sus características entre unas 5000 colonias (buscando aquellas con mayor actividad surfactante mediante el método de Jain et al. 1991).
Ejem lo 2. Uso de las cepas XT1, XT2 y cepa tipo como antsfúngscos
La actividad frente a los hongos (tabla 1) fue realizada sembrando las cepas XT1 , XT2 la cepa tipo y la de Botrybel en una pequeña extensión en medio PDA (patata dextrosa agar). A continuación se colocó en el extremo opuesto un trozo de agar de aproximadamente 1 cm2 con micelio del hongo a testar, y a los 20 días y tras incubación a 25°C se procedió a medir el radio máximo y mínimo del micelio del hongo para calcular el porcentaje de reducción de crecimiento del hongo
Actividad antifúngica
Hongos
XT1 XT2 Cepa tipo Botrybel
Alternaría alternata
27 y 14 (49) 24 y 19 (21) 25 y 8 (68) 24 y 20 (17)
Aspergillus niger
30 y 22 (27) 25 y 10 (60) ND 0
Botrytis cynerea
45 y 8 (83) 45 y 2 (96) 40 y 20 (50) 46 y 16 (56)
Fusaríum oxysporum
30 y 28 (7) 0 32/29 (10) 0
Phytophthora cactorum
8 y 3 (63) 8 y 3 (63) ND 8 y 6 (21)
Phytophthora cinnamomi
22 y 16 (28) 22 y 15 (32) 16 y 12 (21) 20 y 14 (30)
Rhizopus oryzae
45 y 8 (82) 50 y 12 (76) ND 40 y 7 (82)
Sclerotinia sclerotiorum
16 y 7 (56) 16 y 12 (25) 16 y 10 (37) ND
Thanatephorus cucumerís
12 y 7 (42) 16 y 10 (37) 16 y 7 (56) ND
Verticillium dahliae
25 y 12 (52) 24 y 12 (50) 25 y 14 (44) 23 y 13 (44) Tabla 1.- Valores de inhibición máximos y mínimos frente a distintos hongos expresados en mm, entre paréntesis porcentaje de reducción del micelio. ND: No determinado Entre los hongos ensayados, la mayor inhibición se logró frente a Botrytis (cepas XT1 y XT2) y la menor frente a Fusarium (Figura 1).
También se determinó la actividad antimicrobiana de las cepas XT1 y XT2 y la cepa tipo frente a Saccharomyces cerevisiae (levadura beneficiosa y con grandes aplicaciones industriales) y se observó la ausencia de la misma, es decir la zona de inhibición fue de cero mm.
Ejemplo 3. Uso de las cepas XT1 , XT2 y cepa tipo como agentes ant bactenanos La actividad antibacteriana se determinó incorporando, en una placa Petri con agar tripticasa soja (TSA), una sobrecapa con 6 mi de TSA estéril a 45°C y 1 mi de un cultivo de la cepa fitopatogena a analizar en fase exponencial de crecimiento en una concentración equivalente a la escala 1 de Mac Farland. A continuación una vez solidificado el medio se inoculó en un pocilio 100 de sobrenadante de los cultivos. Tras 24 horas de incubación se realizó la medida de la zona de inhibición (Tabla 2. Figura 2).
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Tabla 2.- Actividad antibacteriana. Resultados expresados en mm de inhibición de crecimiento. R: Resistente
Ejemplo 4. Uso de las cepas XT1, XT2 y cepa tipo como agentes para control biológico de nemaíodos a) Ensayos en plantas de tomate inoculadas con Meloidogyne javanica (Fig. 3, 4, y 5)
Se utilizaron 5 lotes de 10 plantas de tomate cada uno (Solanum lycopersicum). Tres lotes se inocularon con las cepas seleccionadas (2 x 108 UFC) y posteriormente con M. javanica J2 (1500). Finalmente dos lotes, con y sin nemátodos, se utilizaron de control. A los 50 días se determinó el número de nemátodos en el suelo de cada planta, en las raíces y se calculó el factor de multiplicación (Talavera y col. 2012). Los resultados obtenidos pueden verse en las figura 3, 4 y 5.
Se observa que todas las cepas disminuyen el el factor de multiplicación de los nemátodos, el número de nemátodos por planta y el número de nemátodos por g de raíz, siendo los descensos más acusados en caso de las cepas XT1 y XT2. b) Ensayo en invernadero con la cepa XT1 en un cultivo de pepino holandés con problemas recurrentes cada año por exceso de humedad en suelo, dificultad para el enraizamiento y alta incidencia de pudrición en la raíz, así como infección por nemátodos.
Se utilizó un sector de 2000 m2 para inyectar en el riego por goteo y otro sector similar como control. Se aplicaron 7.5 L de cultivo en 6 aplicaciones separadas por un periodo de 10 días (1 , 250 I de un cultivo con al menos 108 UFC/mL en cada aplicación). Tanto en el sector control como tratamiento se mantuvieron los tratamientos habituales tanto fertilizantes como fitosanitarios. El número de plantas perdidas durante este tratamiento en el sector control fue de 36 mientras que el tratado con la cepa XT1 fue de 6. Las diferencias en la producción fueron también significativas obteniéndose un 30% más de producción en el sector tratado. Ejemplo 5. Uso de la cepa XT1, XT2 y cepa tipo como agentes para control biológico de insectos a) Se hicieron experimentos en el laboratorio con el pulgón de la cebada (Rhopalosiphum padi) y Anthocoris nemoralis con el fin de determinar el porcentaje de mortalidad, que originan los cultivos bacterianos de las tres cepas de B. methylotrophicus y sus surfactantes, sobre estos insectos. Dado que el primero es un insecto chupador los ensayos se hacen únicamente por vía tópica mientras que en el segundo caso se hacen tanto por vía tópica como por ingestión. Se analizó la actividad de los cultivos bacterianos de las cepas XT1 y XT2 con 5 x 108 UFC/ml, así como de sus surfactantes a una concentración 1/1000 en agua destilada, en ambos tipos de insectos, por uso tópico. Para cada tratamiento se utilizaron 10 individuos. En el caso de Anthocoris se aplicaron 5 μΙ con una pipeta sobre el cuerpo de los mismos y en los pulgones se les impregnó la misma cantidad con un pincel. Como control se utilizó el medio de cultivo bacteriano SG. Los resultados obtenidos expresados en porcentaje de mortalidad tras 48 h son los siguientes:
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Tabla 3. Mortalidad por uso tópico en el pulgón de la cebada Rhopalosiphum padi y Anthocoris nemoralis
Resultados expresados en porcentaje de individuos
Igualmente se analizó la actividad de los cultivos bacterianos de las cepas XT1 , XT2 y la cepa tipo de B. methylotrophicus con 5 x 108 UFC/ml, así como de los tres surfactantes correspondientes, a una concentración 1/1000 en agua destilada por ingestión sobre Anthocoris nemoralis. Como control se utilizó agua y Tween 80 (dilución 1/1000). Los distintos productos se aplicaron sobre una esponja humedecida con agua (1 mi) y por pulverización (0.25 mi) sobre la comida (huevos de Ephestia kuheniella) procurando que estuviera bien cubierta. Para cada tratamiento se realizaron 4 repeticiones de cinco individuos observándose diariamente durante 6 días. Los resultados obtenidos, expresados en porcentaje de mortalidad, se indican en la siguiente tabla:
Figure imgf000035_0002
Tabla 4. Mortalidad por ingestión en Anthocoris nemoralis . Resultados expresados en porcentaje de individuos b) Además, se llevó a cabo el tratamiento de un nectarino Prunus pérsica var. nectarina altamente afectado por una plaga de pulgones, verdes y negros (véase Fig. 6). Con un cultivo de XT1 con 5 x 108 UFC/ml. Concretamente se administró por vía foliar 50 mi de una dilución al 5% de dicho cultivo cada 10 días. Tras la segunda aplicación la población prácticamente desapareció aunque quedaron pequeñas zonas con pulgones en el extremo de algunas hojas que permanecían enrolladas y se eliminaron manualmente. Trascurrido un mes la plaga quedó controlada. c) Igualmente se observó la desaparición de mosca blanca en cultivo de tomates de invernaderos tratados con la cepa XT1 (véase ejemplo 6 b1)
Ejemplo 6. Uso de las cepas XT1 , XT2 y cepa tipo como agentes fitofortif ¡cantes a) Ensayo en maceta con plantas de pimiento (género Capsicum) y calabaza (género Cucúrbita) con las cepas XT1 , XT2 y cepa tipo
Se utilizaron dieciséis plántulas de 5 cm de altura de cada una de las plantas anteriores que se trasplantaron a macetas de 10 cm de diámetro y 15 cm de altura y se dejaron al aire libre a temperatura ambiente (rango de temperatura 20-38°C) durante 35 días. Las macetas se regaron cada 48 h con la misma cantidad de agua (aproximadamente 50 ml_). Se hicieron 4 lotes de 4 macetas de cada tipo de planta. Cada siete días se adicionó a tres lotes de cada tipo de planta, y después de regar, 5 ml_ de una dilución 1/100 de un cultivo de Bacillus cepa XT1 , cepa XT2 y cepa tipo con 5x108 UFC/mL. Un lote de cuatro macetas de cada tipo se utilizó como control y por tanto no se inoculó con cultivos bacterianos. A los 35 días se cortó la parte aérea y se pesó. Los resultados obtenidos se observan en la tabla adjunta.
Figure imgf000036_0001
Tabla 5. Efecto fitofortificante de las cepas XT1 , ΧΤ2 y cepa tipo Nota: En el cultivo del pepino hubo una pérdida, por las condiciones climatológicas y plagas, del 50% de plantas, en caso del control y en las regadas con la cepa tipo, y del 25% en las regadas con la cepa XT2; sin embargo todas las plantas regadas con XT1 se mantuvieron en condiciones óptimas. b) Además con la cepa XT1 se hicieron: b.1. Ensayo en cultivos de tomate de pera de invernaderos.
Se realizaron tratamientos por vía foliar a tres dosis distintas del caldo de cultivo conteniendo al menos 108 UFC/mL (0.5, 1 y 1.5% v/v) mediante pulverización y con dos repeticiones (a tiempo cero y a los 30 días). En cada tratamiento se trataron 6 plantas. Se utilizó un control, sin tratar. Durante el período del estudio, en el invernadero, y por tanto en el control, hubo varias plagas: mosca blanca, pulgón, oidio y Botrytis. El número de plantas que se perdieron en las zonas tratadas con el cultivo de la cepa XT1 fue inferior a las perdidas en la zona control, siendo la dosis más adecuada la del 1.5% (v/v). Por otra parte el peso de los tomates recolectados de las plantas tratadas fue superior a la de la planta control (véase Tabla 6).
Tratamiento 1 .5 % CONTROL 1 .5 % CONTROL
Experiencia (1) (1) (2) (2)
Plantas perdidas 1 4 0 3
Peso de los tomates
3,6 3,1 3.8 3.1
(total Kg)
Tabla 6. Plantas de tomates perdidas y peso de los tomates recolectados en dos zonas de cultivo de tomate de pera de invernadero tras tratamiento con XT1
Estos resultados mostraron una tendencia clara entre la aplicación del producto y el incremento en la producción de las plantas con respecto a los controles atribuible al efecto estimulante sobre el metabolismo de la planta. Asimismo, las plantas tratadas tuvieron una disminución importante de la plaga por mosca blanca y pulgón y se recuperaron de la infección de Botrytis y oidio b.2. Ensayo en maceta con la cepa XT1 a mayor plazo de tiempo con cultivo de plantas de tomates (Solanum lycopersicum), pimientos (género Capsicum), calabaza (género Cucúrbita) y pepino (Cucumis sativus) sanas y ya desarrolladas.
Se utilizaron cuatro plántulas de 10 cm de altura de cada una de las especies anteriores (tomates (Solanum lycopersicum), pimientos (género Capsicum), calabaza (género Cucúrbita) y pepino (Cucumis sativus). Se trasplantaron a macetas de 10 cm de diámetro y 15 cm de altura y se dejaron al aire libre a temperatura ambiente (rango de temperatura 15-32°C). Las macetas se regaron cada 48 h con la misma cantidad de agua (aproximadamente 100 ml_). Cada siete días se adicionó a la mitad de las macetas y después de regar 5 ml_ de una dilución 1/100 de un cultivo de Bacillus XT1 con 5x108 UFC/mL La otra mitad se utilizó como control y por tanto no se inoculó. A los 50 días se cortó la parte aérea y se pesó. Igualmente se anotó el número de hojas, flores y frutos así como la altura de las mismas. Los resultados obtenidos (valores medios) se observan en la tabla adjunta. Se obtiene un incremento del peso de la vegetación aérea del 86%, un aumento del número de hojas del 57,6% y un incremento del número de frutos y flores del 1 12,5 y 137,5% respectivamente (véase Tabla 7). Además el tamaño de la planta tratada se incrementó un 38,3%. En la Fig. 7 pueden observarse los resultados en el cultivo de calabaza.
Figure imgf000038_0001
Tabla 7. Efecto del riego con XT1 en plantas de pimiento, pepino, tomate y calabaza. Se indica la media

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de bacterias de la especie Bacillus methylotrophicus en un procedimiento de control biológico de bacterias fitopatogenas y/o nematodos fitopatogenos y/o hongos fitopatogenos no pertenecientes a la especie Magnaporthe oryzae.
2. Uso de bacterias de la especie Bacillus methylotrophicus de acuerdo con la reivindicación 1 en un procedimiento de control biológico de nematodos fitopatogenos.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado en que los nematodos pertenecen a los géneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema y Trichodorus.
4. Microorganismo perteneciente a la especie Bacillus methylotrophicus, cepa XT1 (número de depósito CECT8661) depositada el 23 de abril de 2014 por la Universidad de Granada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y/o microorganismo con un alto grado de homología con la cepa XT1 cuya secuencia de ADN del gen 16S rRNA sea idéntica en al menos el 99.6%, 99.7%, 99.8% o el 99.9% con la secuencia de ADN del gen 16S rRNA de la cepa XT1 , basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dichas secuencias de ADN.
5. Microorganismo pertenecientes a Bacillus methylotrophicus cepa XT2 (número de depósito CECT8662) depositada el 23 de abril de 2014 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) por la Universidad de Granada y/o microorganismos con un alto grado de homología con la cepa XT2 cuya secuencia de ADN del gen 16S rRNA sea idéntica en al menos el 99.6%, 99.7%, 99.8% o el 99.9% con la secuencia de ADN del gen 16S rRNA de la cepa XT2, basándose en la identidad de la totalidad de los nucleótidos de dichas secuencias de ADN.
6. Cultivo de microorganismos que comprende microorganismos según reivindicaciones 4 ó 5.
7. Cultivo de microorganismos de acuerdo con la reivindicación anterior que consiste en microorganismos según reivindicaciones 4 ó 5.
8. Composición que comprende microorganismos según reivindicaciones 4 ó 5.
9. Uso de los microorganismos de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 y/o del cultivo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 6 a 7 y/o de la composición de acuerdo con la reivindicación 8 en un procedimiento para estimular el crecimiento vegetal.
10. Uso de los microorganismos de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 y/o del cultivo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 6 a 7 y/o de la composición de acuerdo con la reivindicación 8 en un procedimiento de control biológico de organismos fitopatógenos.
1 1. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que los organismos fitopatógenos son bacterias y/o insectos y/o hongos y/o nematodos.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 , caracterizado porque los organismos fitopatógenos son insectos
13. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado por que el insecto pertenece a la familia Aphididae o a cualquiera de las especies denominadas comúnmente "mosca blanca"
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado por que los organismos fitopatógenos son nematodos.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado por que el nematodo pertenece a una de los siguientes géneros: Meloidogyne, Heterodera,
Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema o Trichodorus.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado por que los organismos fitopatógenos son hongos.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado por que los hongos pertenecen a una o más especies seleccionadas de la lista que consiste en: Alternaría alternata, Aspergillus niger, Botrytis cynerea, Fusaríum oxysporum, Phytophthora cactorum Phytophthora cinnamomi, Rhizopus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Thanatephorus cucumeris y Verticillium dahliae
18. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado por que los hongos pertenecen a la especie Botrytis cinnerea.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado por que los organismos fitopatógenos son bacterias.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación anterior caracterizado, caracterizado por que las bacterias pertenecen a la especie Agrobacterium tumefaciens, Pectobactenum atrosepticum, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas campestris.
21. Procedimiento para estimular el crecimiento vegetal que comprende las etapas de:
a. Obtener un microorganismo y/o un cultivo de bacterias y/o una composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8; y
b. Poner en contacto una planta con el microorganismo y/o cultivo de bacterias y/o composición obtenidas en la etapa a.
22. Procedimiento de control biológico de organismos fitopatógenos que comprende las etapas de:
a. Obtener un microorganismo y/o un cultivo de bacterias y/o una composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8; y
b. Poner en contacto una planta afectada por un fitopatógeno con el microorganismo y/o cultivo de bacterias y/o composición obtenidas en la etapa a.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado por que el organismo fitopatógeno es un nematodo.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado por que el nematodo pertenece a una de los siguientes géneros: Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Paratylenchus, Ratylenchus, Xiphinema o Trichodorus.
25. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizado por que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 se ponen en contacto con la planta afectada por vía foliar.
26. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado por que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 se ponen en contacto con la planta afectada mediante pulverización y/o goteo.
27. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-26, caracterizado por que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 se ponen en contacto con la planta afectada mediante el uso de sistemas de riego localizado.
28. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado por que el sistema de riego localizado es un microaspersor.
29. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-26, caracterizado por que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 se ponen en contacto con la planta afectada mediante el uso de aspersores.
30. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-29, caracterizado por que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 se ponen en contacto con la planta afectada mediante el uso de goteros.
31. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-29, caracterizado por que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 se ponen en contacto con la planta afectada al menos dos veces, una a t=0 y otra al menos tras 30 días.
32. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-31 , caracterizado por que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 presentan una concentración de microorganismos de al menos 5 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por mi utilizados a una dilución entre 0,5-5%(v/v).
33. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado por que los microorganismos, el cultivo de bacterias o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 presentan una concentración de microorganismos de 1 ,5% (v/v).
34. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-33 caracterizado en que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 se ponen en contacto con la planta afectada al menos 6 veces durante 6 días.
35. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-33 caracterizado en que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8 se ponen en contacto con la planta afectada al menos 2 veces durante 30 días.
36. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-33 caracterizado en que los microorganismos, el cultivo de bacterias y/o composición de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 7 se ponen en contacto con la planta afectada al menos 2 veces durante 30 días, una vez a tiempo t=0 días y otra vez a tiempo t=30 días.
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