CN111876354B - 甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用 - Google Patents

甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及菌株培育技术领域，特别涉及甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用。该甲基营养型芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.11232。本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF‑3具有抗真菌范围广、拮抗效果显著的特性，可用于防治植物土传真菌病，因而具有良好的工业化应用前景。同时，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF‑3在大田实验中防效显著，对农作物病害防治具有很大的实用价值，且对农作物具有很好的促生长效果。

Description

甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用
技术领域
本发明涉及菌株培育技术领域，特别涉及甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用。
背景技术
土传病害是指病原体如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。包括立枯、纹枯、青枯、枯萎、疫病、猝倒、根腐、软腐、根结线虫、胞囊线虫等众多植物的土传病害。这些病害通常侵染植物根部或茎部，从而引起作物根茎部乃至全株发病，造成重大经济损失。
目前主要是通过化学药剂对土传病害进行防控，而化学药剂的长期使用，会造成水源土壤污染、生态平衡被破坏、农药残留、次要病害猖獗和使病源微生物产生抗药性等一系列严重的后果。随着人们环保意识的增强，对食品安全问题的重视，以及对生态环境建设，保护生物多样性和农业可持续发展的要求，使得生物防控土传病害成为当前研究和开发的热点。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧生活，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和抗有机溶剂的内生孢子，所产芽孢可制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型，且与化学农药混用后不失活，是理想的生防菌筛选对象。在芽孢杆菌中，甲基营养型芽孢杆菌是一种具有广谱抑菌活性的细菌，该枯草芽孢杆菌具有较强的代谢产物产生能力，能够产生多种抑菌物质，因而具有较好的应用前景。
公开号CN105557756A、CN105670958A中分别公开了两种甲基营养型芽孢杆菌，但还需要筛选出抑菌能力更强、抑菌谱更广的甲基营养型芽孢杆菌。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用。该甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3具有抗真菌范围广、拮抗效果显著的特性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种甲基营养型芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.11232。
在本发明中，甲基营养型芽孢杆菌的筛选方法包括如下步骤：
通过多点采样法采集土样，将采集到的土样研细，制成不同浓度的土壤悬浮液；土样取自湘西自治州泸溪；
选取浓度为10-5～10-7的土壤悬浮液，加入到NA培养基平板上进行涂布处理，在30℃条件下培养，得到菌落；
挑选单菌落进行划线保种，培养20～30小时，得到甲基营养型芽孢杆菌。
在本发明中，NA培养基的组成包括：10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉粉， 5g/L的NaCl，20g/L的琼脂；pH值为7.2～7.4。
本发明还提供了该甲基营养型芽孢杆菌的发酵培养方法，包括如下步骤：将甲基营养型芽孢杆菌接种在灭菌后的液体培养基中，在25～30℃下进行震荡培养2～4d，然后离心。
作为优选，液体培养基组成为10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉粉，20g/L 的蔗糖，5g/L的NaCl；pH值为7.2～7.4。
作为优选，震荡培养的转速100～300r/min；离心的转速为10000～15000 r/min，时间为2～10min。
优选地，震荡培养的转速180r/min；离心的转速为12000r/min，时间为 5min。
本发明还提供了一种生防菌剂，包括上述甲基营养型芽孢杆菌和水。
作为优选，生防菌剂的浓度为103～107CFU/mL。
优选地，生防菌剂的浓度为105CFU/mL。
本发明还提供了上述甲基营养型芽孢杆菌或生防菌剂在防治植物土传真菌病中的应用。
作为优选，植物土传真菌病为由立枯丝核菌、油茶炭疽菌、亚麻炭疽菌、尖镰孢亚麻专化型、辣椒疫霉菌、番茄灰霉菌、尖孢镰刀菌的一种或几种引起的植物病害。
优选地，植物土传真菌病为百合枯萎病、黄瓜枯萎病、亚麻炭疽病、油茶炭疽病。
优选地，液体发酵培养基的灭菌条件为：在121℃下灭菌20min。
本发明提供了甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用。该甲基营养型芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.11232。本发明具有的技术效果为：
本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3具有抗真菌范围广、拮抗效果显著的特性，可用于防治植物土传真菌病，因而具有良好的工业化应用前景。同时，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3在大田实验中防效显著，对农作物病害防治具有很大的实用价值，且对农作物具有很好的促生长效果。
生物保藏说明
分类命名：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，于2015 年08月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11232。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的制备流程图；
图2是本发明实施例1提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的菌落形态图；
图3是本发明实施例1提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的革兰氏染色图；
图4是本发明实施例1提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的芽孢染色图；
图5是本发明实施例1提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的PCR产物琼脂糖电泳图；
图6是本发明实施例1提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的16S序列构建的系统发育树图；
图7是实施例2中甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3对不同病原菌抑制效果图；A：百合枯萎病；B：黄瓜枯萎病；C：亚麻立枯病；D：油茶炭疽病。
图8是本发明实施例3提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的大田增产效果的示意图，其中，8-1为百合种球对比，8-2为百合植株对比。
具体实施方式
本发明公开了甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌及其发酵培养方法、生防菌剂、应用中所用培养基、病原菌、试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的制备与鉴定
一、甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的制备
请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌 IBFCBF-3的制备流程图。本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌 IBFCBF-3的制备步骤为：
S01：通过多点采样法采集土样，并将采集到的土样研细，本发明实施例中的土样取自湘西自治州泸溪；
S02：将研细的土样放入装有无菌水的离心管中充分震荡，制成浓度为 10-1的土壤悬浮液；
S03：将所述土壤悬浮液梯度稀释，得到不同浓度的土壤悬浮液；
S04：选取浓度为10-5、10-6和10-7的土壤悬浮液，并加入到NA培养基平板上进行涂布处理，放到30℃的培养箱中培养，得到菌落；
S05：挑选形态不一的单菌落进行划线保种，培养24小时，得到分离菌，将所述分离菌置于4℃的冰箱中保存备用；
S06：用直径0.5cm的打孔器将亚麻立枯、百合枯萎病、油茶炭疽病原菌菌块接种于PDA培养基平板中心，在距平板中央2.5cm十字交叉处等距离接种不同的分离菌，以不接种分离菌为对照(CK)，每次处理进行3次重复实验，在温度为25℃条件下培养，当对照组(CK)长满全部器皿时，记录抑菌圈的大小，选择抑菌圈最大的为甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3。
其中，NA培养基为营养琼脂培养基，该营养琼脂培养基的组成按照浓度包括10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉粉，5g/L的NaCl，20g/L的琼脂。NA 培养基在制备时的pH值为7.2～7.4，并经过20min的灭菌处理，且灭菌时的温度为121℃。PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
本发明实施例提供了甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3拮抗百合枯萎病、黄瓜枯萎病、亚麻立枯病、油茶炭疽病原菌的示意图，示意图请参考附图7。从附图7中能够看出，当对照组全部长满器皿时，接种有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3分离菌的PDA培养基上出现了明显的抑菌圈，且抑菌圈的直径均在2.0cm以上，由抑菌圈的出现能够说明本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3对百合枯萎、黄瓜枯萎、亚麻立枯、油茶炭疽病原菌具有明显的抑制作用，因而能够很好的应用于防治真菌病害。
本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的发酵液的制备包括：将甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3接种在液体发酵培养基中，在25-30℃进行发酵培养，摇床震荡2-4天，得到甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的发酵液。
其中，摇床震荡的转速为180r/min。
液体发酵培养基按照浓度包含以下组分：10g/L的胰蛋白胨，3g/L的牛肉粉，20g/L的葡萄糖，5g/L的NaCl。液体发酵培养基在制备时的pH值为 7.2～7.4，并经过20min的灭菌处理，且灭菌时的温度为121℃。
二、甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的鉴定：
1、形态学鉴定
将本发明实施例提供的菌株划线到NA培养基平板上，然后将平板倒转，在温度为30℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况。本发明实施例提供的菌株的菌落形态图请参考附图2。
从附图2中能够看出，本发明实施例提供的菌株的菌落呈微黄色，不透明，圆形或不规则形，边缘不整齐，表面粗糙褶皱。
进一步，用试剂盒对本发明实施例提供的菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，并在油镜下观察菌株和对菌株进行拍照。该菌株的革兰氏染色和芽孢染色请参考附图3和附图4。
从附图3中能够看出，经革兰氏染色后，本发明实施例提供的菌株为杆状，且呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。从附图4中能够看出，经芽孢染色后，本发明实施例提供的菌株菌体显蓝色，芽孢显红色，由此说明本发明提供的菌株能够产生芽孢。
2、生理生化鉴定
(1)接触酶实验
在菌株的液体培养液中直接滴加3％的过氧化氢，立即观察。若有大量气泡产生，则为阳性；若不产生气泡，则为阴性。本发明提供的菌株立即产生大量气泡，实验结果为阳性。
(2)氧化酶实验
取白色洁净滤纸一角，蘸取少量的菌株菌落，加入浓度为1％的盐酸二甲基对苯二胺水溶液一滴，阳性者立即呈粉红色，且颜色会逐渐加深。在此次实验中，菌落呈粉红色，颜色逐渐加深，实验结果为阳性。
(3)淀粉水解实验
将菌株的菌种点接到淀粉培养基上，在温度为37℃的条件下培养24h，滴加少量碘液在淀粉培养基平板上，轻轻旋转，使碘液均匀分布在淀粉培养基平板上，观察菌落周围的情况。若菌落周围出现无色透明圈表明有水解淀粉的能力，反之，则没有。本菌株菌落的周围有透明圈产生，由此能够说明本菌株具有水解淀粉的能力。
(4)甲基红MR实验
挑取少量的本菌株，并接种于通用培养基上，在温度为30℃的条件下培养3～5天，培养结束后取培养液1mL，并加入甲基红指示剂1～2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。在此次实验中，菌液变黄，所以为阴性。
(5)VP实验
挑取少量的本菌株，并接种于通用培养基，在温度为30℃的条件下培养4 天，培养结束后取培养液2.5mL先加入a萘酚纯酒精溶液0.6mL，再加入浓度为40％的氢氧化钾水溶液0.2mL，摇动2-5min，阳性菌通常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或30℃的恒温箱中，若2h内仍不显现红色，则可判定为阴性。在此次实验中，菌液立即变红，所以为阳性。
(6)明胶液化实验
取本菌株，穿刺接种于明胶中，并使本菌株位于明胶深度的2/3处。在温度为20℃的条件下培养5-7d。每天观察结果本菌株是否被细菌液化，若被液化，则为试验阳性；若不被液化，则为阴性。在此次实验中，明胶被液化，因此本菌株为阳性。
(7)硝酸盐还原实验
将本菌株接种于硝酸盐肉汤中，在温度为28℃的条件下摇床培养3d，然后取5mL培养液，按试剂盒(海博生物技术有限公司硝酸盐还原试剂盒)说明加入显色剂，变黄为阳性，反之，不变色为阴性。在此次实验中，菌液变黄，说明本菌株为阳性。
(8)产硫化氢实验
将本菌株穿刺接种于醋酸铅培养基中，在温度为35℃的条件下培养24～ 48h，并观察结果。若培养基变黑，则为阳性；不变黑，则为阴性。在此次实验中，培养基变色，说明本菌株为阳性。
(9)柠檬酸盐利用实验
挑本菌株在西蒙斯氏柠檬酸盐培养基斜面上划线接种,在温度为37℃的条件下培养3-7天。若培养基为碱性者，即指示剂蓝色或桃红色的为阳性；若培养基不变色，则为阴性。在此次实验中，培养基未变色，说明本菌株为阴性。
(10)卵磷脂酶活性实验
用75％的乙醇将新鲜鸡蛋的表面进行消毒，并用灭菌的镊子将鸡蛋打个孔，倾去蛋清，然后用无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50℃左右的 NA培养基中，混和均匀后放倒平板，点接本菌株，在温度为30℃的条件下培养24h，并进行观察。若菌落边缘出现浑浊圈者为酶阳性。在此次实验中，菌落边缘出现明显的浑浊圈，说明本菌株为阳性。
(11)丙二酸盐利用实验
挑取培养12h菌苔接种于丙二酸盐培养基，在温度为35℃的条件下培养 24-48h，培养基由绿变蓝者为阳性，反之为阴性。在此次实验中，培养基变色，说明本菌株为阳性。
(12)葡萄糖发酵实验
挑取少量本菌株穿刺接种于葡萄糖氧化发酵培养基，在温度为30℃的条件下培养3d，观察培养基颜色的变化。若无颜色变化，则需要继续观察7d，培养基变黄者为发酵型。在此次实验中，培养基变黄，说明本菌株为阳性。
(13)纤维素分解实验
涂布平板于羧甲基纤维素钠固体培养基上，待有明显菌落时，向平板中滴入一滴管刚果红染液，并使刚果红染液均匀的分布在平板上。15分钟后加入1mL氯化钠溶液，浸泡15分钟后，洗去染色，观察是否产生透明圈。若有透明圈产生，则为阳性。在此次实验中，有透明圈产生，说明本菌株为阳性。
(14)半乳糖利用实验阳性
将本菌株接种在半乳糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用半乳糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，说明本菌株可以利用半乳糖。
(15)阿拉伯糖利用实验
将本菌株接种于阿拉伯糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用阿拉伯糖，反之，不行。在此次实验中，菌体不生长，说明本菌株不可以利用阿拉伯糖。
(16)甘露糖利用实验
将本菌株接种于甘露糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用甘露糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，本菌株可以利用甘露糖。
(17)D-果糖利用实验
将本菌株接种于D-果糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用D-果糖，反之，不行。在此次实验中，菌体生长，本菌株可以利用D-果糖。
(18)D-木糖利用实验
将本菌株接种于D-木糖培养基中，在温度为30℃的条件下培养2d，观察菌落生长情况，若菌落形成，则可以利用D-木糖，反之，不行。在此次实验中，有菌落形成，本菌株可以利用D-木糖。
综上，生理生化鉴定结果如表1。
表1：本菌株的生理生化鉴定结果
表性特征 反应特征 表性特征 反应特征
接触酶测定 + 柠檬酸盐利用 +
氧化酶测定 + 卵磷脂酶活性测定 +
淀粉水解测定 + 丙二酸盐利用 +
甲基红MR测定 — 纤维素分解 +
VP实验 + 半乳糖利用 +
明胶液化测定 + 阿拉伯糖利用 —
硝酸盐还原测定 + 甘露糖利用 +
葡萄糖发酵 + D-果糖利用 +
产硫化氢测定 — D-木糖利用 +
其中，+表示为本菌株有反应或可以利用，-表示为本菌株没有反应或不可以利用。
3、16S rDNA序列分析
本发明实施例采用康为世纪生物科技有限公司基因组提取试剂盒提取本菌株中的DNA。
其中，上述提取试剂盒包括50μL的PCR反应体系，而PCR反应体系包括25μL的2×MasterMix；2.5μL的上游引物；2.5μL的下游引物；18μL的 dd H2O；2μL的模板DNA。
PCR反应条件为：在温度为94℃预变性5min；94℃变性0.5min；53℃退火0.5min；72℃延伸1min；30个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
请参考附图5，附图5示出了本发明实施例提供的芽孢杆菌IBFCBF-3的 PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测的电泳图。PCR产物由长沙维世尔生物科技有限公司进行测序，测序结果参见下述的核苷酸序列。将所得序列通过 NCBI—BLAST进行同源性序列比对分析，得到相似性较高的序列。运用 MEGA6.06软件构建系统发育树，本菌株的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)的同源性达到99％，本菌株的发育树图请参考附图6。
综合上述形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析结果，能够确定本菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，其被命名为甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3。
IBFCBF-3 16S rDNA序列(1457bp)如下所示：
CTGGGGCGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGAT GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATA ACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACA TAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTG GTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCG GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTT TCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGC ACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGC GGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAA CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTG ACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA CGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGC TAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCC TTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTT GGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA AATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAA GGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATC GCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT TTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAAGGGTG AACCAGGGGTG
实施例2甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的抑菌效果评价
1、抑菌效果评价
以百合枯萎病、黄瓜枯萎病、亚麻立枯病、油茶炭疽、辣椒疫病、亚麻炭疽病、番茄灰霉病为例对甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3抑制效果的进行研究，其具体内容如下：
以百合枯萎病、黄瓜枯萎病、亚麻立枯病、油茶炭疽病、辣椒疫病、亚麻炭疽病、番茄灰霉病原菌为靶标菌，挑单菌落，在距离平板中心2.5cm处点接甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3，以不接种IBFCBF-2细菌的平板为对照，每个处理重复3次。将平板倒置于28℃培养箱中，待对照组病原真菌长满平板时，测量候选拮抗细菌直径及细菌对每株病原真菌的抑菌圈直径。
由表2可知甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3对上述细菌的抑菌直径在 15-32mm之间，说明甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3具有广谱的抑菌性，且对上述植物病原真菌均有高效的抑菌效果。
表2 IBFCBF-3对不同植物病原真菌拮抗的作用
病原真菌 IBFCBF-3抑菌圈直径(mm)
百合枯萎病 32.75±0.45a
亚麻立枯病 20.00±0.38d
黄瓜枯萎病 20.50±0.33d
油茶炭疽病 24.55±0.37bc
辣椒疫病 23.85±0.42c
亚麻炭疽病 26.72±0.51b
番茄灰霉病 15.41±0.43e
注：表中小写字母表示拮抗菌IBFCBF-3对不同病原真菌拮抗效果的显著差异(P<0.05)。
本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3及其发酵液能够应用于防治真菌病害，该真菌病害为土传菌病害为亚麻立枯病(Rhizoctonia solani)、亚麻炭疽病(Colletotrichum linicola)、辣椒疫霉病(Phytophthora capsici)、番茄灰霉病(Botrytis cinerea)、百合枯萎病(Fusarium oxysporum)、黄瓜枯萎病(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、油茶炭疽病 (Colletotrichum camelliae)等的土传菌病害。
实施例3含有甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的生防菌剂在抑制百合枯萎病中的应用
本发明实施例以百合枯萎病菌为例进行了甲基营养型芽孢杆菌 IBFCBF-3及其发酵液对真菌病害的研究，研究内容如下：
(1)培养基的选用
甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3的培养采用NB液体培养基(即牛肉膏蛋白胨液体培养基)，该NB液体培养基的制备包含10g的蛋白胨，3g的牛肉粉和5g的NaCl，上述物质使用去离子水定容至1000mL，并调节pH值为 7.2-7.4，然后在1×105Pa的压力下灭菌20min，制得NB液体培养基。
百合枯萎病原真菌采用PDA液体培养基，该PDA液体培养基的制备包括200g的去皮马铃薯，20g的葡萄糖，上述物质使用去离子水定容至 1000mL，然后在1×105Pa的压力下灭菌20min，制得PDA液体培养基。
(2)百合品种的选择
百合选用湖南省邵阳市隆回县提供的龙牙百合。将龙牙百合的种球鳞茎用浓度为10％的双氧水进行表面消毒20min，然后用无菌水冲淋3遍。
(3)具体实验设计
实验共分为3组：
每个处理地面积为9m×37m2，实验分为四个处理，每小块实验田之间间隔一段距离作为保护行，具体如下：
CK：不进行处理对照组；
T：浓度为1×106cfu/mL甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3发酵液灌根处理，每株灌根约40mL，其他农事活动同常规处理，一周后进行第二次灌根。
病情指数＝∑(各级病植株数×相应级数)/(调查植株总株数×最高级数)×100
发病率＝(发病植株/总株数)×100％
防治效果％＝[(对照区病情指数－处理区病情指数)/对照区病情指数] ×100
9月百合种球沙藏15至30d方可播种，次年4月对百合植株进行株高、茎粗、上半部分鲜重及干重和根系鲜重及干重等生长指标的测定，统计每组百合枯萎病发病株数。
(4)测量方法
测量时从百合植株基部至主茎顶部即主茎生长点之间的距离为株高，植株近根结的第一节茎的直径为茎粗。将百合植株从近根结的第一个节点剪断，分别称取上半部分和根系部分的重量，记为鲜重，然后放置到85℃的烘箱中烘干至恒重，再次分别称取其重量，记为它们的干重。实验结果请参考表3-6 和附图8。
表3：处理组对百合生长的影响
Figure RE-GDA0002682739480000131
表4：处理组对百合枯萎病植株发生情况
处理 病情指数 发病率(％) 防治效果(％)
T 5.727 15.45 62.39
CK 15.186 47.2 -
表5：处理组对百合枯萎病球茎发生情况
处理 病情指数 发病率(％) 防治效果(％)
T 2.22 32.5 86.21
CK 16.11 100 -
表6：处理组对百合亩产量的发生情况
Figure RE-GDA0002682739480000132
Figure RE-GDA0002682739480000141
从表3中能够看出，T组的处理使百合具有更高的株高、更粗的茎，更重的植株湿重和干重，根部的平均湿重和干重也显著高于CK对照组。同时，从附图8中能够看出百合植株长势良好。因而，本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3及其发酵液能够有效的促进植株的生长。从表4中能够看出，IBFCBF-3处理后百合植株的发病率显著低于对照组的发病率，防治效果为62.39％，从表5能够看出IBFCBF-3处理后对百合地下球茎的防治效果尤为突出，防治效果达到86.21％。从表6能看出IBFCBF-3处理后百合球茎亩产量较对照组增加了26.11％，增产明显。由此能够说明本发明实施例提供的甲基营养型芽孢杆菌IBFCBF-3及其发酵液具有显著的拮抗效果和增产效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus），其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.11232。
2.权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将甲基营养型芽孢杆菌接种在灭菌后的液体培养基中，在25~30℃下进行震荡培养2~4 d，然后离心。
3.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，所述液体培养基组成为10 g/L的胰蛋白胨，3 g/L的牛肉粉，20 g/L的蔗糖，5 g/L的NaCl；pH值为7.2~7.4。
4.根据权利要求2或3所述的发酵培养方法，其特征在于，所述震荡培养的转速100~300r/min；离心的转速为10000~15000 r/min，时间为2~10min。
5.一种生防菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌和水。
6.根据权利要求5所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂的浓度为103 ~107 CFU/mL。
7.权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌或权利要求5至6中任一项所述生防菌剂在防治植物土传真菌病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物土传真菌病为由立枯丝核菌、油茶炭疽菌、亚麻炭疽菌、尖镰孢亚麻专化型、辣椒疫霉菌、番茄灰霉菌、尖孢镰刀菌中的一种或几种引起的植物病害。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130096870A (ko) * 2012-02-23 2013-09-02 이기성 항진균 활성을 가지는 신규의 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 엘케이에스26
CN105557756A (zh) * 2016-02-05 2016-05-11 中国农业科学院植物保护研究所 利用甲基营养型芽孢杆菌nkg-1实施的植物抑菌方法
CN106686983A (zh) * 2014-07-31 2017-05-17 格拉纳达大学 甲基营养型芽孢杆菌作为植物生长刺激剂和生物控制要素的应用、以及该物种的分离物
CN108085269A (zh) * 2017-11-23 2018-05-29 中国农业科学院麻类研究所 甲基营养型芽孢杆菌菌株ibfcbf-2及其应用
CN109486703A (zh) * 2018-10-18 2019-03-19 淮海工学院 甲基营养型芽孢杆菌bmf 04与发酵方法及用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130096870A (ko) * 2012-02-23 2013-09-02 이기성 항진균 활성을 가지는 신규의 미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 엘케이에스26
CN106686983A (zh) * 2014-07-31 2017-05-17 格拉纳达大学 甲基营养型芽孢杆菌作为植物生长刺激剂和生物控制要素的应用、以及该物种的分离物
CN105557756A (zh) * 2016-02-05 2016-05-11 中国农业科学院植物保护研究所 利用甲基营养型芽孢杆菌nkg-1实施的植物抑菌方法
CN108085269A (zh) * 2017-11-23 2018-05-29 中国农业科学院麻类研究所 甲基营养型芽孢杆菌菌株ibfcbf-2及其应用
CN109486703A (zh) * 2018-10-18 2019-03-19 淮海工学院 甲基营养型芽孢杆菌bmf 04与发酵方法及用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
两株生防芽孢杆菌的分子鉴定及拮抗活性测定;谢永丽等;《西北农业学报》;20120831;第21卷(第8期);32-37页 *
寒地耐冷生防菌株筛选鉴定及特性研究;王玉霞 等;《东北农业大学学报》;20160831;第47卷(第8期);31-38页 *

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