CN102732469B

CN102732469B - 一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN102732469B
Application number: CN201210241442.6A
Authority: CN
Inventors: 姬广海; 魏兰芳; 张丽辉; 何月秋
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CN102732469A

Abstract

本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用，属生物技术领域。本发明的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus) BWJ已于2012年5月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC N0.6159。本发明的甲基营养型芽孢杆菌用于大田防治十字花科蔬菜根肿病制剂的制备中。本发明具有高效、无毒、安全无残留，BWJ菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产的特点，其生产菌株甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus) BWJ能够用于制备大田防治十字花科蔬菜根肿病的制剂中。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用

技术领域：

本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用，属生物技术领域。

背景技术：

十字花科作物包括油菜和大宗蔬菜，如大白菜、甘蓝、花椰菜、苤蓝、茎芥菜、芥菜、萝卜、小白菜、瘤芥菜(榨菜)及特种作物板蓝根和山葵等，每年发生根肿病面积达2000多万亩(次)，特别是一旦发生，病害逐年加重，十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae woron.)侵染引起。十字花科根肿病对蔬菜产量影响极大，十字花科作物，最严重的可能会导致减产70％-80％，甚至让菜农颗粒无收，不能在同地块种植十字花科作物。由于近些年来，种子和蔬菜种苗大范围、远距离引种，根肿病发生范围扩大，西自新疆的霍尔果斯、西藏的察隅，东至台湾，北自黑龙江，南至海南岛全国各省区均有分布。特别是大棚温室育苗和漂浮育苗更加快了病害流行速度，致使新的病区只能种植一年，第二年就无法种植。病菌能在土壤中存活10年以上，且可以通过侵染杂草而得到繁殖，导致轮作不能很好地起到防病作用，水旱轮作导致病菌均匀扩散，还会加重病害。

目前，防治根肿病的措施主要有检疫，农业栽培措施，抗病品种、及化学防治措施，但防治效果均不理想。

经文献检索，尚未见利用甲基营养型芽孢杆菌制备生物制剂，并应用于大田防治十字花科蔬菜根肿病的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种高效、无毒、安全无残留的甲基营养型芽孢杆菌及其应用。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ已经保藏。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2012年5月28日；保藏号CGMCC NO：6159。

本发明的生产菌株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ，分离自云南省昆明市郊蔬菜根际，经形态学、培养性状、常规生理生化、Biolog全自动鉴定系统测定和16S rDNA序列测定及其系统发育学分析，该生产菌株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ为一个新菌株。

该菌株具有以下特征：

(1)菌落圆形，表面有皱褶，不透明，白色，革兰氏染色阳性，在显微镜下菌体短杆状，产芽孢，周生鞭毛。

(2)该菌株抑菌谱广、抑菌能力强，能在大白菜等多种作物根际定植，对一些细菌性海棠叶斑病菌、甘蓝黑腐病菌、魔芋细菌性软腐病菌、水稻细菌性病菌等病原细菌都有较强的抑制作用，菌株BWJ对尖镰孢菌抑制效果最好，其次是辣椒疫霉病菌和立枯丝核菌、茄镰胞菌，而对茄镰胞菌的抑菌效果也非常明显。

(3)具有以下生理生化特征：Biolog生理生化特征：能利用糊精、甘露聚糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡糖酸、a-D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露醇、D-山梨糖醇、蔗糖、L-苹果酸、丙酮酸、N-乙酰-L-谷氨酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰氨、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘油等。不能利用吐温40、N-乙酰-甘露、L-岩藻糖、L-鼠李糖、水杨苷、果糖-6-磷酸、葡糖-1-磷酸、葡糖-6-磷酸。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ菌株用于大田防治十字花科蔬菜根肿病制剂的制备中，即：通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物；通过常规的液体发酵生产，加入润湿剂、展着剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和晾干，制备成液剂或可湿性粉剂。

本发明具有高效、无毒、安全无残留，BWJ菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产的特点，其生产菌株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ能够用于制备大田防治十字花科蔬菜根肿病的制剂中。

具体实施方式：

本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ已经保藏。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2012年5月28日；保藏号：CGMCC NO.6159。

本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ菌株用于制备大田防治十字花科蔬菜根肿病的制剂中，即：通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物；通过常规的液体发酵生产，加入润湿剂、展着剂，或与吸附载体按一定比例混合后，经过滤、浓缩、粉碎和晾干，制备成液剂或可湿性粉剂。

用本发明的生产菌株制备的生物制剂制剂，通过浸种、喷雾的方式施用。已在云南昆明市郊、楚雄州元谋县、楚雄禄丰县和玉溪通海县等地的温室和田间小区进行了防效试验，证明了该生物制剂防效显著、稳定，能够有效地控制十字花科植物根肿病，对十字花科植物根肿病的防治效果达到56％-78％。

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：生防菌BWJ制剂对大白菜根肿病的药效试验

(一)生防菌株的离体抑菌试验

1.供试材料：

1.1供试菌株：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BWJ。

1.2供试病原菌

植物病原细菌(甘蓝黑腐病菌、魔芋细菌性软腐病菌、海棠斑点病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌)，病原真菌(疫霉菌、尖镰孢菌、茄镰孢菌、立枯丝核菌)，均由云南农业大学生物多样性与病害控制国家工程中心细菌研究室提供。

1.3供试试剂和培养基

NA培养基(蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蔗糖10g，琼脂17g，水1000mL，pH7.0)；PDA培养基(马铃薯200g，琼脂15g，葡萄糖15g，水1000mL)。

2.试验方法

拮抗试验采用平板对峙

1)菌悬液的制备：将得到的芽孢杆菌和病原细菌分别接入装有50ml的NA液体培养基的三角瓶中，置于28℃、160r／min摇床上培养48h。将菌悬液用无菌水适当稀释，摇均匀后，用600nm波长、1cm比色皿测定OD值。测定时用无菌NA培养基作空白对照。用无菌水稀释使得菌悬液的为OD值0.5，待用。

2)对病原细菌抑菌作用的测定：取上步所得病原细菌菌悬液200ul加入培养皿中，将冷却至45℃左右的NA培养基倒入已加过病原细菌菌悬液的培养皿中，混匀。等完全凝固后，放置牛筋环于培养基表面，取上步所得BWJ菌悬液200μl加入牛筋环，28℃中培养2-4d。观察、记录试验结果。

3)对病原真菌抑菌作用的测定：在PDA平板中心接种植物病原菌菌盘(直径5mm)，两侧2cm处接种BWJ菌株。置28℃培养箱中培养，观察抑菌情况。

表1生防菌BWJ菌株对植物病原细菌的抑菌效果

实施例二：生防菌BWJ制剂对大白菜根肿病的温室控病效果

1、实验材料与方法

1.1、供试菌剂：生防菌BWJ液剂

1.2、供试作物：大白菜

1.3、防治对象：大白菜根肿病

1.4.实验地点：云南省农业大学植保学院温室大棚，盆栽种植高感根肿病大白菜品种83-1，每处理设3个重复。

1.5病原菌和生防菌剂的制备：

1.5.1接种体的制备

每份病菌取鲜质量15g匀浆，配置100mL菌液，利用菌落计数法使菌液孢子浓度为12×10⁷个／mL，将菌液加入到300g风干草炭土中，搅拌均匀，其含水量以手握成团、触之能散为宜，密封48h以上，病菌孢子浓度为4×10⁷个／g。

1.5.2接种方法

培养土按草炭∶蛭石∶珍珠岩=2V∶1V∶1V配制，装入营养钵(规格为10cm×10cm)，浇足底水，中心用实心棒插一深3cm、直径2cm的圆穴，置入病菌土。每份病菌土分装10钵，每钵播4粒种子，均播在病菌土上，每份菌土保苗20株以上。播种后苗床地温控制在25℃，土壤湿度保持在90％，pH值控制在6～7，为病菌的发病营造良好的条件。

1.5.3生防菌BWJ液体制剂不同浓度稀释液

将生防菌剂BWJ液体制剂，用水稀释成含不同浓度的菌液，采用稀释涂平板法测定各稀释液的浓度，用浇根法，在播种时每株大白菜浇30ml，间隔10天后再浇一次，再隔15天后，浇第三次。

1.5.4病情调查

接种后45d开始调查，病情分级标准〔1〕：

0级：根部无肿瘤；

1级：侧根有小肿瘤；

3级：主根肿大，其直径小于2倍茎基部；

5级：主根肿大，其直径是茎基部的2～3倍；

7级：主根肿大，其直径是茎基部的3～4倍；

9级：主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上或肿大的根部出现变黑。

发病率=(发病株数／调查总株数)×100

相对防效=(对照病情指数-处理病情指数)×100／对照病情指数

试验结果与分析

表2生防菌剂BWJ防治大白菜根肿病效果

从表2结果可知，生防菌株BWJ液体制剂对大白菜根肿病有很好的防治效果，在生防菌剂浓度(含菌量)为10⁶CFU／ml时，对白菜根肿病的防治效果为75.29％，明显高于化学农药氰霜唑2000倍处理的60％的防效，与新型生物农药呻嗪霉素300倍处理的70.05％略有提高。

实施例三：生防菌BWJ制剂防治大白菜根肿病田间药效试验

播种大白菜种子，品种选用春喜霸王1号，供试材料随机排列，每个材料种植5行，每行42株苗，设置三次重复。试验地点在云南省玉溪市通海县王武营村进行。

生防菌剂BWJ固体制剂，分别用水稀释100倍、200倍和500倍液，采用浇根法，在播种后7天、14天和21天将制备好的生防菌株BWJ的菌悬液灌根。每株大白菜苗灌菌100mL。

对照杀菌剂氰霜唑2000倍稀释液，采用上述同样的方法浇根，施药次数为3次，每株大白菜苗灌菌100ml。

空白对照：施用清水，采用上述同样的方法浇根，施用次数为3次，每株大白菜苗灌清水100ml。

试验设5个处理，3次重复，共15个小区，小区面积30平方米，随机排列。

试验中于病害发生高峰期进行采样，每次采样100株，调查并记录各个品种株高、叶面积、植株鲜重等生理指标和发病等级，统计根肿病发生率及病情指数，分析结果。病情调查按以下标准进行。

接种后45d开始调查，病情分级标准如下：

0级：根部无肿瘤；

1级：侧根有小肿瘤；

3级：主根肿大，其直径小于2倍茎基部；

5级：主根肿大，其直径是茎基部的2～3倍；

7级：主根肿大，其直径是茎基部的3～4倍；

发病率=(发病株数／调查总株数)×100

相对防效=(对照病情指数-处理病情指数)×100／对照病情指数

田间试验结果如下：

通过田间防效试验，从表3看出：施用生防菌BWJ生物制剂对大白菜根肿病有很好的防治效果，其中制剂稀释100倍的效果最好，在收获期防治仍达76.84％，稀释200倍和500倍的防治效果分别达62.11和56.31％。与生产中常用的防治根肿病病害的氰霜唑2000倍的处理的74.21％相比，施用生物制剂BWJ100倍各个处理的发病率和病情指数都有所降低，防治效果相当，显示了该菌具有潜在的开发应用前景。

表3生防菌剂BWJ防治大白菜根肿病效果通海试验点

实施例四：生防菌BWJ制剂对大白菜根肿病田间控病试验

1、实验材料与方法

1.1、供试药剂：生防菌BWJ可湿性粉剂

1.2、供试作物：大白菜，品种为成杂5号

1.3、防治对象：大白菜根肿病

1.4.实验地点：云南省楚雄州禄丰县南雄村委会，肥力中等，小区为一畦为6行区，面积30平方米，每处理设3个重复，随机排列，共9个小区，四周设保护行，按高产、优质蔬菜栽培措施规范化管理。

1.5试验方法：

试验方法和处理方式同实施例三。

2.试验结果与分析

从表4和表5知，生防菌BWJ固体制剂采用浸种处理生防菌悬液浸泡白菜种子3h后自然晾干，待种，然后用浇根法处理的效果最好，生防菌和药剂处理过的田块发病率和病情指数相对于对照都有明显的降低，病情指数的差异达到显著性水平。在收获期调查对大白菜根肿病的防治效果，生防菌剂BWJ高达85％，明显高于防治根肿病的农药氰霜唑2000倍的处理的73.42％。生防菌BWJ固体制剂田间可增加大白菜的生物量，生物制剂BWJ增加116kg／小区，比对照提高了15％。由此看出，生防菌剂能增加大白菜株植株的鲜重。

表4生防菌BWJ制剂防治大白菜根肿病的田间防治效果禄丰试验点

表5生防菌BWJ制剂对大白菜生理指标的影响

Claims

1.一种甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)BWJ，其特征在于该菌已于2012年5月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0：6159。

2.权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)BWJ在制备大田防治十字花科蔬菜根肿病制剂中的应用。