CN103039530B - 一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂，其特征在于，所述可湿性粉剂采用特定方法制得的甲基营养型芽孢杆菌的原粉、轻质碳酸钙、十二烷基苯磺酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和分散剂亚甲基双甲基萘磺酸钠2-3重量份组成。进一步地，本发明涉及所述可湿性粉剂防治柑橘病害，特别是柑橘溃疡病的用途。

Description

一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物农药，特别是涉及一种以甲基营养型芽孢杆菌的发酵产物为活性成分的可湿性粉剂，以及所述可湿性粉剂的制备方法，特别是涉及所述可湿性粉剂防治柑橘溃疡病的应用。 

技术背景

柑橘溃疡病是一种由杆状细菌引起的危害柑橘生长的世界性病害，为国内外植物检疫对象，早期与柑橘疮痂病混淆。直到1913年才被描述为2种不同的病害，并于1915年分离并鉴定了病原菌。此病起源于亚洲，且以亚洲国家发生最为普遍，故又称亚洲病害。该病害在我国的广东、广西、福建、台湾、江西、浙江、江苏、湖南、湖北、贵州、四川、陕西等省均有分布。柑橘溃疡病病原菌在植物组织上越冬，靠风、雨、昆虫和枝叶交接从伤口、气孔和皮孔等处浸入而近距离传播；远距离传播主要通过带病苗木、接穗和果实；高温多雨、刮大风利于病害流行。该病每年均可发生流行为害，主要为害叶片，也为害枝条和果实。以苗木、幼树受害最重，造成落叶、枯梢、树势衰弱、落果等，严重影响果树产量和品质。可为害芸香科数十种植物，传播途径广，传染迅速，危害严重，顽固难防。在我国，柑橘种植向规模化发展，随着规模的扩大，柑橘溃疡病暴发风险增加。 

目前柑橘溃疡病防治措施的研究工作还比较薄弱，进展比较缓慢。防治柑橘溃疡病主要依赖的化学防治且所用的药剂品种少，生产上用药防治效果不理想，更无高效特效杀菌药剂。迄今为止，柑橘溃疡病仍然无法根治，局部地区有蔓延趋势。伴随无公害水果生产的需要以及大量微生物农药的出现，国外已经取得一定的研究成果，生物防治必将成为溃疡病防治措施的研究重点和热点。 

因此，寻找对柑橘溃疡病防治效果好的微生物杀菌药剂，对控制柑橘溃疡病的危害有重要意义。本发明所涉及的甲基营养型芽孢杆菌的发酵产物对柑橘溃疡病具有良好的防治效果，其防治效果高达83.27％，且无药害产生。但是，单纯的甲基营养 型芽孢杆菌的发酵产物的稳定性不好，不能长时间放置，也不适合生产大面积应用。 

发明内容

为克服通常存在的甲基营养型芽孢杆菌的发酵产物不能长时间放置以及不便与使用的缺点，本发明提供了一种稳定性好的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂。经实验证明，这种制剂性质稳定，便于长期存放，且对柑橘溃疡病防治效果显著。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本申请所涉及的甲基营养型芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，其命名为Bacillus methylotrophicus；保藏登记号为CGMCC No.6793，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路；保藏时间为2012年11月07日。实验室编号为LW-6。 

本发明的上述甲基营养型芽孢杆菌是从烟草根际土壤分离得到的，通过菌株的分离、纯化以及筛选步骤获得的。 

菌株鉴定：采用形态特征、生理生化实验、分子生物学鉴定法，以及16SrDNA同源序列比对分析最终确定上述保藏编号的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)。 

本申请涉及一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂，其特征在于，所述可湿性粉剂由以下重量份的组分组成的：甲基营养型芽孢杆菌的原粉50-90重量份，轻质碳酸钙20-60重量份，十二烷基苯磺酸钠2-3重量份，磷酸二氢钾1-2重量份，磷酸氢二钾1-2重量份，分散剂亚甲基双甲基萘磺酸钠2-3重量份； 

所述甲基营养型芽孢杆菌的原粉是通过以下方法制备得到的： 

步骤一：将上述保藏登记号为CGMCC No.6793的甲基营养型芽孢杆菌接种到LB液体培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；所述LB液体培养基为酵母浸膏3-5g，蛋白胨8-10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4～7.6； 

步骤二：种子罐发酵培养：将上述培养好的菌种按种子罐所用的培养基的体积比10％接种量接入30L种子罐，培养至对数生长期；所述种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO₄ 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培养条件：溶氧量为15～20％，搅拌速度200rpm，发酵温度30℃； 

步骤三：大规模工业发酵培养：将上述种子罐发酵培养好的培养液按照大规模工业发酵罐所用培养基的体积比10％接种量接入大规模工业发酵罐培养，大规模工业 发酵罐所用培养基配方为：玉米粉20g/L、豆饼粉50g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10g/L；培养条件：溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵温度30℃；培养至最终生物量为109cfu/克，芽孢形成率达到98％以上，发酵完成； 

步骤四：后处理：将经大规模工业发酵培养的培养液进行过滤，喷雾干燥即得原粉。 

优选地，上述甲基营养型芽孢杆菌的原粉70重量份，轻质碳酸钙34重量份，十二烷基苯磺酸钠2.5重量份，磷酸二氢钾1重量份，磷酸氢二钾1.5重量份，分散剂亚甲基双甲基萘磺酸钠3重量份。 

所述甲基营养型芽孢杆菌的原粉中甲基营养型芽孢杆菌含量为200-1000亿活芽孢/克。 

在本发明所制备得到的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂，含菌量(cfu/g)≥10¹⁰，活菌率(％)≥85％。 

本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：将各组分混合均匀，控制加工温度在0～50℃，在气流粉碎机中粉碎，过150目筛，即得最终产品。 

所述甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂可用于多种植物病害，特别是用于防治柑橘病害，特别是防治柑橘溃疡病，防治效果高达83.27％。 

应用时，使用方法为：使用本发明的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂800-1000倍叶面喷雾。 

进一步地，本发明提供上述甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂防治柑橘病害，特别是柑橘溃疡病的用途。 

本发明克服了甲基营养型芽孢杆菌的发酵发酵产物不能长时间放置以及不便与使用的缺点，经试验证明，本发明的可湿性粉剂性质稳定，便于长期存放，且对柑橘溃疡病有较好的防治效果。可以预见，本发明在生物防治领域将有着广阔的应用前景。 

具体实施方式

结合实施例，对本发明做详细描述。 

实施例1制备本发明的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂 

配方为：甲基营养型芽孢杆菌的原粉70千克、轻质碳酸钙34千克，十二烷基 苯磺酸钠2.5千克，磷酸二氢钾1千克，磷酸氢二钾1.5千克，分散剂亚甲基双甲基萘磺酸钠3千克。 

制备方法：将上述原料混合均匀，控制加工温度在25℃左右，在气流粉碎机中粉碎，过150目筛，即得。 

所述甲基营养型芽孢杆菌的原粉是通过以下方法制备得到的： 

(1)将本发明保藏登记号为CGMCC No.6793的甲基营养型芽孢杆菌接种到LB液体培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；所述LB液体培养基为酵母浸膏5g，蛋白胨8g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4～7.6； 

(2)将上述培养好的菌种按种子罐所用的培养基的体积比10％结种量接入30L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO₄0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培养条件：溶氧量为15％，搅拌速度200rpm，发酵温度30℃； 

(3)将上述种子罐发酵培养好的培养液按照大规模工业发酵罐所用培养基的体积比10％的接种量接入大规模工业发酵罐培养，大规模工业发酵罐所用培养基配方为：玉米粉20g/L、豆饼粉50g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10g/L；培养条件：溶氧量为15～18％，搅拌速度200rpm，发酵温度30℃；培养至最终生物量为109cfu/克，芽孢形成率达到98％以上，发酵完成； 

(4)发酵完成后，将经大规模工业发酵培养的培养液进行过滤，喷雾干燥即得原粉。 

实施例2本发明的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂防治柑橘溃疡病试验 

2010年至2011年连续两年，在陕西城固县宝山镇进行了上述实施例1所制得的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂对柑橘溃疡病的防治效果研究。试验果园面积为4hm2，规格为2m×3m，地势平坦，排灌方便，上壤肥力中等，其他肥水、虫害防治等管理措施相同。2010及2011年8月31日下午喷第1次药，此时秋梢已抽出5～8cm，采用喷雾器对树冠均匀喷雾，喷至叶片正反面和小枝湿透为度。9月15日下午喷第2次药。9月30日、10月10日下午调查防治效果。试验设5各处理：①上述实施例1所制得的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂的800倍液，②77％多宁600倍液，③3％克菌康600倍液，④80％金纳海800倍液，以清水为对照。 

表1不同杀菌剂对柑橘叶溃疡病的防治效果 

注：同列数据后小写字母不同表示在0.05水平差异显著。 

由表1可看出，末次施药后15d调查，本发明的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂对柑橘叶溃疡病的防治效果为87.27％，而其他三处理的防治效果均在75％以下，明显低于甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂。25d后调查，四处理防治效果都下降，但甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂的防效依然在80％以上；四处理及对照的病情指数都有所增大，但对照组病情指数增加明显快于处理组，而且甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂增加幅度明显低于对照，同时还低于其他三处理。 

表2不同杀菌剂对柑橘果溃疡病的防治效果 

注：同列数据后小写字母不同表示在0.05水平差异显著。 

由表2可看出，末次施药后15d调查，四处理防治效果差异显著，甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂对柑橘果溃疡病的防治效果为87.38％；77％多宁600倍液防效也达到了77.25％，高于对柑橘叶溃疡病的防治效果；3％克菌康600倍液防治效果最差，仅为55.85％。25d后调查，四处理防治效果均有所下降，甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂增加幅度明显最低，且防效依然在80％以上；其他三处理防效均低于65％，明显低于15d调查时的防效。 

实施例3本发明的甲基营养型芽孢杆菌的原粉和可湿性粉剂防治柑橘叶溃疡病试验 

2010年至2011年连续两年，在陕西城固县宝山镇进行了上述实施例1所制得的甲基营养型芽孢杆菌的原粉和可湿性粉剂对柑橘叶溃疡病的防治效果研究。试验果园面积为4hm2，规格为2m×3m，地势平坦，排灌方便，土壤肥力中等，其他肥水、虫害防治等管理措施相同。2010及2011年8月31日下午喷第1次药，此时秋梢已抽出5～8cm，采用喷雾器对树冠均匀喷雾，喷至叶片正反面和小枝湿透为度。9月15日下午喷第2次药。9月30日、10月10日下午调查防治效果。试验设3个处理：①上述实施例1所制得的甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂的800倍液，②上述实施例1所制得的甲基营养型芽孢杆菌的原粉800倍液，以清水为对照。 

表3对柑橘叶溃疡病的防治效果 

由表3结果可以看出，将甲基营养型芽孢杆菌原粉制成可湿性粉剂之后，在末次施药后15d，其对柑橘叶溃疡病的防治效果为87.63％，与原粉相比，较大地提高了其防治效果。 

本发明的一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。 

Claims (4)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌的可湿性粉剂，其特征在于，所述可湿性粉剂由以下重量份的组分组成的：甲基营养型芽孢杆菌的原粉50-90重量份，轻质碳酸钙20-60重量份，十二烷基苯磺酸钠2-3重量份，磷酸二氢钾1-2重量份，磷酸氢二钾1-2重量份，分散剂亚甲基双甲基萘磺酸钠2-3重量份；

所述甲基营养型芽孢杆菌的原粉是通过以下方法制备得到的：

步骤一：将保藏登记号为CGMCC No.6793的甲基营养型芽孢杆菌接种到LB液体培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；所述LB液体培养基为酵母浸膏3-5g，蛋白胨8-10g，NaCl5g，水1000ml，pH7.4～7.6；

步骤二：种子罐发酵培养：将上述培养好的菌种按种子罐所用的培养基的体积比10%接种量接入30L种子罐，培养至对数生长期；所述种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO₄0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培养条件：溶氧量为15～20%，搅拌速度200rpm，发酵温度30℃；

步骤三：大规模工业发酵培养：将上述种子罐发酵培养好的培养液按照大规模工业发酵罐所用培养基的体积比10%接种量接入大规模工业发酵罐培养，大规模工业发酵罐所用培养基配方为：玉米粉20g/L、豆饼粉50g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L，MnSO₄·H₂O10g/L；培养条件：溶氧量为15～18%，搅拌速度200rpm，发酵温度30℃；培养至最终生物量为10⁹cfu/克，芽孢形成率达到98%以上，发酵完成；

步骤四：后处理：将经大规模工业发酵培养的培养液进行过滤，喷雾干燥即得原粉。

2.根据权利要求1的可湿性粉剂，其特征在于，甲基营养型芽孢杆菌的原粉70重量份，轻质碳酸钙34重量份，十二烷基苯磺酸钠2.5重量份，磷酸二氢钾1重量份，磷酸氢二钾1.5重量份，分散剂亚甲基双甲基萘磺酸钠3重量份。

3.根据权利要求2的可湿性粉剂，其中所述甲基营养型芽孢杆菌的原粉中甲基营养型芽孢杆菌含量为200-1000亿活芽孢/克。

4.根据权利要求2或3的可湿性粉剂防治柑橘溃疡病害的用途。