CN104911129B

CN104911129B - 防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株及其微生物有机肥

Info

Publication number: CN104911129B
Application number: CN201510315357.3A
Authority: CN
Inventors: 谭石勇; 谭武贵; 丰来; 罗志威; 林炜
Original assignee: Taigu Biotechnology Group Co ltd
Current assignee: Hunan Huigu Agricultural Ecology Research Institute Co.,Ltd.
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2035-06-10
Also published as: CN104911129A

Abstract

本发明涉及微生物肥料领域，具体是一株防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株T‑5及其微生物有机肥。本发明菌株T‑5的保藏号为CGMCC NO.8547。本发明含菌株T‑5的微生物有机肥含有T‑5的有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g以上。本发明还提供制备含菌株T‑5的微生物有机肥的方法。本发明的菌株T‑5是抑制番茄青枯病病原菌生长的专一性高效菌株，本发明的微生物有机肥含有丰富的有机质、氨基酸和小分子多肽，没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，可以在营养钵施用，也可以在大田施用，不仅具有有机肥的功能，而且其中所含的生防菌通过多种促生及生防机制起作用，从而达到促生或防治番茄土传青枯病的效果。

Description

防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株及其微生物有机肥

技术领域

本发明涉及微生物肥料领域，具体是一株防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株及其微生物有机肥。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum Mill)是世界上主要的果蔬之一，在人类饮食习惯中占有非常重要的地位，广泛种植于热带、亚热带和温带地区，在我国也有大面积种植。番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia.solanacearum)引起的一种毁灭性土传细菌病害，严重制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。该病害在高温、高湿的条件下容易爆发，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，并且在部分低温地区同样发现青枯菌的存在，给全球的农作物生产带来极大的威胁。该病害一旦发生就难以控制，往往造成作物大面积萎蔫死亡甚至绝收，导致番茄产量严重下降，严重制约着番茄产业的发展和经济效益的提高。目前，国内外对番茄青枯病的防治方法多种多样，但由于青枯菌是一个复杂的群体，有明显的生理分化，不同地区和不同寄主来源的菌株，在寄主范围、致病力、生化型、血清型等生物学特征上差异很大，分布范围广泛，寄主范围广，存活和传播能力强，尚没有一种比较好的防治方法。

另外一方面，农业生产上的农作物秸秆一般就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等，使大量的养分资源流失于土壤—土壤系统之外，不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和微生物有机肥生产原料的有机物资源，不利于我国农业的可持续发展。将这些农业有机废弃物制备成微生物有机肥再施入土壤中，将有效解决农业有机废弃物的问题，不仅能够变废为宝，实现资源在利用，而且还能够净化和完善农业生态环境。因此，将这些农业有机废弃物经过高温发酵成高品质的有机肥，再用作土壤有益微生物的载体，制备成为具有明确功能的微生物有机肥将具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于针对现状，提供一株防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株及其微生物有机肥。

本发明提供的一株防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株T-5(Bacillusamyloliquifaciens)，其保藏号为CGMCC NO.8547，2013年12月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

所述解淀粉芽孢杆菌菌株T-5主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞为杆状，芽孢端生或近端生，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，甲基红试验阳性，V-P反应阳性，明胶水解阳性，纤维素分解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，不能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，能利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、D-果糖、D-木糖，最适生长温度为30℃，pH值为7.0。

本发明还提供含有上述解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的微生物有机肥，含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g(含)以上。

所述微生物有机肥还含有氮、磷、钾。

所述氮(全氮)的含量为30.6mg/kg。

所述磷(全磷)的含量为19.2mg/kg。

所述钾(全钾)的含量为38.7mg/kg。

所述微生物有机肥，优选为含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g，氮(全氮)的含量为30.6mg/kg，磷(全磷)的含量为19.2mg/kg，钾(全钾)的含量为38.7mg/kg的有机肥。

本发明还提供所述微生物有机肥的制备方法，包括如下步骤：

1)对解淀粉芽孢杆菌菌株T-5进行液体发酵培养，得到含菌或芽孢量≥4.0×10⁹个/ml的发酵液；

2)按体积比为4:6混合腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥，得到混合有机肥；

3)将发酵液按按体积质量比为30％接种到混合有机肥中进行固体发酵，使得解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g(含)以上，在温度不超过60℃的条件下干燥至水的质量百分含量低于30％，获得含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的微生物有机肥。

其中，步骤1)所述液体发酵培养，为将解淀粉芽孢杆菌菌株T-5接种到PDA培养液中进行液体发酵培养。

其中，液体发酵培养的发酵条件为：初始pH值为7.0-7.2，培养温度为30℃，溶氧：通气量范围30％-100％，转速170转/分钟。

其中，所述PDA培养液的配置方法为(以配置1L的PDA培养液为例)：用200g土豆削皮后切成小块放入到500mL水中，加热煮沸30min，经过滤后滤液中加入20g蔗糖，定容至1000mL，pH值调至7.0-7.4，115℃灭菌30min。

其中，步骤2)所述腐熟的猪粪堆肥，要求发芽指数为98％(含)以上，有机质质量比含量为大于等于35％，有机氮质量比含量为1.5-2.3％，水的质量百分含量为25-30％。

其中，步骤3)所述的固体发酵，发酵过程中每天翻堆1-2次，使发酵温度不超过60℃，发酵周期为5-7d。

本发明提供所述解淀粉芽孢杆菌菌株T-5在制备微生物有机肥中的应用。

本发明提供所述解淀粉芽孢杆菌菌株T-5在防治番茄青枯病中的应用。

本发明还提供含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的微生物有机肥在防治番茄青枯病中的应用。

所述应用具体为在作物种植过程中作基肥(沟施或穴施或撒施)或作追肥使用。用量可根据不同的作物和土壤肥力酌情设定。

本发明的优点在于：

1、本发明的防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株T-5是抑制番茄青枯病病原菌生长的专一性高效菌株，其拮抗效果非常显著。盆栽试验结果表明，番茄青枯病的防治率达到80％以上。在番茄青枯病连作障碍严重的田间试验中连续施用本肥料产品，可以有效控制番茄青枯病的发生。

2、本发明含有防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的微生物有机肥含有丰富的有机质(质量百分含量35％以上)、氨基酸和小分子多肽。肥料中含有的丰富营养不仅能够促进作物的生长，也为其中的生防菌(T-5)提供了生长繁殖的条件，使其在土壤中存活下来并形成优势种群，从而发挥防病作用。

3、本发明的微生物有机肥是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且减少了农产品中的农药残留，有利于农产品的出口。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。

4、本发明的微生物有机肥可以在营养钵施用，也可以在大田施用，不仅具有有机肥的功能，而且其中所含的生防菌通过多种促生及生防机制起作用，从而达到促生或防治番茄土传青枯病的效果。

附图说明

图1为菌株T-5对番茄青枯病病原菌的抑制效果照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

用于防治番茄青枯病的菌株T-5，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquifaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年12月06日，保藏号为CGMCC NO.8547。

实施例1菌株的分离和鉴定

菌株的获得：从番茄青枯病发病田块中的健康番茄植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验最终筛选出高效拮抗菌株T-5，其对番茄青枯病病原菌的抑制效果照片见图1(透明空白圆形区域为T-5对番茄青枯病病原菌的抑制效果，乳白色区域为青枯病原菌)，鉴定到属种，菌种于体积百分含量30％甘油中-70℃保存。将拮抗菌T-5送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2013年12月06日，保藏号为CGMCCNO.8547。

拮抗菌T-5，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens)，主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，杆状，芽孢端生或近端生。菌株T-5在NA平板表面生长的菌落不规则近圆形，白色，不透明，边缘不光泽，表面干燥无褶皱，不产色素。过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，甲基红试验阳性，V-P反应阳性，明胶水解阳性，纤维素分解阳性，吲哚试验阴性，不能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，能利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、D-果糖、D-木糖。

实施例2菌剂生产

1)对解淀粉芽孢杆菌菌株T-5进行液体发酵培养，得到含菌或芽孢量≥4.0×10⁹个/ml的发酵液，具体为：

将菌株T-5(CGMCC NO.8547，见实施例1)接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵条件为：初始pH值范围为7.0-7.2，培养温度为30℃，溶氧：通气量范围30％-100％，转速170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵得到的发酵液中T-5的含菌或芽孢量≥4.0×10⁹个/ml。

所用PDA培养液配置方法为(以配置1L培养基为例)：用200g土豆削皮后切成小块放入到500mL水中，加热煮沸30min，经过滤后滤液中加入20g蔗糖，定容至1000mL，pH值调至7.0-7.4，115℃灭菌30min。

2)按体积比为4:6混合腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥，得到混合有机肥，具体为：

以腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥以体积比6:4混合制成。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.5-2.3％，含水量为25-30％。本实施例所用氨基酸有机肥为江苏新天地氨基酸肥料有限公司产品，登记证号：苏农肥(2008)准字0180号，肥料规格：N+P2O5+K2O≥6％，有机质≥30％，氨基酸≥5％。

3)将发酵液按按体积质量比为30％接种到混合有机肥中进行固体发酵，使得解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g(含)以上，在温度不超过60℃的条件下干燥至水的质量百分含量低于30％，获得含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的微生物有机肥，具体为：

将步骤1)制备的发酵液按30％(V/W)的比例接种到步骤2)所述的混合有机肥中进行二次固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1-2次，发酵周期5-7d，使菌株T-5的菌含量达到1.0×10⁸个/g以上(即有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g以上)，获得菌株T-5的固体菌剂，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，获得含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的微生物有机肥。

按照本实施例方法制备的微生物有机肥料，含有不低于1.0×10⁸个/g的上述的生防菌株T-5的菌落形成单位(即含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g以上)，全氮含量为30.6mg/kg，有全磷含量为19.2mg/kg，全钾含量为38.7mg/kg。

实施例3盆栽试验

供试土壤为番茄连作土，青枯病发病严重。番茄种子采用番茄青枯病敏感型的“江蔬”，处理设置如下：

CK：对照，番茄连作土壤；T1：番茄连作土壤+有机肥处理；T2：番茄连作土壤+微生物有机肥处理

5kg连作土/盆钵，每处理30盆，3棵苗/盆。T1：每盆施用1％(W/W)的有机肥(50g，见实施例3中步骤2的混合有机肥)，T2:每盆施用1％(W/W)的微生物有机肥(制备方法见实施例3)，采用移苗前穴施，对照处理中补施与1％(W/W)有机肥营养成分相对的N、P、K化学肥料，所有处理均为等养分。

番茄品种为“江蔬”，种子表面消毒后，播种到营养钵中进行育苗，长至4叶期(25-28d)，移栽到5公斤的大盆钵中，在大盆钵生长至40d取样计算生物量，考察促生效果。生长至开花期，每周记录发病情况，统计病情指数，移栽40d后采集各处理的植株及土壤样品迅速带回实验室分析测定。

试验结果如下：

(1)移栽40d后，对照处理中植株的发病率达到了92.4％，而添加有机肥及本发明中微生物有机肥均能显著降低青枯病的发病率，其中T2：番茄连作土壤+微生物有机肥处理表现出最好的防治效果(表1)，其发病率为15.7％，防病率达83.1％。

(2)施用本发明的微生物有机肥不仅可以起到防治番茄青枯病的作用，而且具有减少土壤中青枯菌的数量，增加有益微生物数量，改善根际微生物群落结构的功能(表2)。

(3)施用本发明的微生物有机肥能促进番茄的生长，显著增加植株的生物量(表1)。CK处理中番茄的株高和地上部干重依次为42.5cm和3.3g，而使用含菌T-5的生物有机肥(T2处理)中的番茄株高和地上部干重依次为62.7cm和5.1g，T2处理中的番茄生物量相比CK处理和T1处理均要高。

表1 番茄盆栽的发病率、生防效果及生物量

表2 番茄根际土壤中微生物数量

实施例4田间试验

在南京麒麟镇连作10年的番茄青枯病发病大棚进行了田间试验，以100kg/亩使用量，设置二个处理：1、CK处理，施用化肥(用氮磷钾化肥补齐养分)；2、T-5处理，施用微生物有机肥(制备方法见实施例3)，每个处理三个重复，每个小区40m²。

移栽后定期到田间采集数据，统计发病率，最后采收后计算不同处理的生物量差异。施用本发明的微生物有机肥在田间能够显著降低番茄青枯病的发病率，番茄产量增加32％(表3)。

表3 田间试验效果

本发明专利从改善土壤微生物区系这一关键问题着手，研制出一种能够显著降低连作番茄青枯病发生的微生物有机肥料产品，防治率达75％以上。本产品的作用机制在于本肥料产品中的有益微生物能够与有机载体良好结合，能够使得该有益微生物菌株迅速大量繁殖，在番茄根际形成优势菌群；另外一方面，本肥料产品中含有较高含量的有机氮和有机磷，这些营养物质对连作障碍土壤中作物的生长十分有利，大大提高了作物的立苗率和抗逆能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株防治番茄青枯病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens)菌株T-5，其特征在于，其保藏号为CGMCC NO.8547，生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞为杆状，芽孢端生或近端生，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，甲基红试验阳性，V-P反应阳性，明胶水解阳性，纤维素分解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阴性，不能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，能利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖、D-果糖、D-木糖，最适生长温度为30℃，pH值为7.0。

2.含有权利要求1所述菌株的微生物有机肥，其特征在于，含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g以上。

3.根据权利要求2所述的微生物有机肥，其特征在于，还含有氮、磷、钾。

4.权利要求2～3任意一项所述的微生物有机肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3)将发酵液按按体积质量比为30％接种到混合有机肥中进行固体发酵，使得解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的有效活菌数含量为1.0×10⁸cfu/g以上，在温度不超过60℃的条件下干燥至水的质量百分含量低于30％，获得含有解淀粉芽孢杆菌菌株T-5的微生物有机肥。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述液体发酵培养，为将解淀粉芽孢杆菌菌株T-5接种到PDA培养液中进行液体发酵培养。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，液体发酵培养的发酵条件为：初始pH值为7.0-7.2，培养温度为30℃，溶氧：通气量范围30％-100％，转速170转/分钟。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述腐熟的猪粪堆肥，要求发芽指数为98％以上，有机质质量比含量为大于等于35％，有机氮质量比含量为1.5-2.3％，水的质量百分含量为25-30％。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述的固体发酵，发酵过程中每天翻堆1-2次，使发酵温度不超过60℃，发酵周期为5-7d。

9.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株T-5在制备微生物有机肥中的应用。

10.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株T-5及其微生物有机肥制品在防治番茄青枯病中的应用。