CN114231447A - 一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法及应用，制备方法包括：步骤一：菌种活化，将解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168接入LB固体培养基，转接2代；步骤二：种子液制备，将活化后的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168接入到LB液体培养基中，放到恒温摇床上振荡，即得种子液；步骤三：发酵液制备，将种子液与固体发酵培养基以1：10的质量比混合，发酵；步骤四：菌剂制备，将发酵液与硅藻土载体以93.5：6.5的质量比混合后制成母液，烘干后研磨，得到母粉；将母粉与木质素磺酸钠、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、糊精保护剂以82：5：7：2：4的质量比混合后烘干，即得。本发明制备的解淀粉芽孢杆菌菌剂绿色环保无污染，能够有效防治烟草花叶病毒病。
Description
技术领域
本发明涉及农业和生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法及应用。
背景技术
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus；TMV)是一种RNA病毒，是植物病毒中最具有破坏性的病毒之一，它可侵染36科400多种植物，包括茄科的烟草和番茄、番杏科、豆科、葫芦科、十字花科等。烟草花叶病毒主要在烟草幼苗期和生长前期为害，烟草花叶病毒不仅危害烟株生长而且会降低烟草品质，影响上等烟比例，大幅降低烟草经济效益。烟草花叶病毒通过汁液摩擦传毒，尤其农事操作过程中传播速度非常快，危害很大。该病毒同时也可以在土壤中进行传播，也是烟草连作障碍的主要原因之一。烟草花叶病毒在土壤中可以存活3年，因此化学防治和轮作倒茬都难于防治该种病毒病。
对于烟草花叶病毒的防治，国内外每年都有大量的报道，包括新的天然抗病毒剂的发现，以及大量的新型化学药剂的开发和应用。以天然植物活性物质为有效成分的植物源抗病毒剂具有环境友好、安全、开发成本低等优点，但到目前为止，只有很少一部分物质得到实际应用。而且常用的化学农药防治，不但效果低、毒性大还会造成环境污染等严重问题，且长期连续高剂量的施用单一的抗病毒化学农药，容易造成大量农药的残留、环境再污染以及病毒的耐药性提高等问题。烟草花叶病毒以预防为主，一旦田间管理不当，就容易大面积发病，因此寻找一种经济、有效的防治烟草花叶病毒的生物菌剂成为保障烟草安全绿色生产的迫切任务。
植物根际促生菌(PGPR)，是植物根际中能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的多种有益微生物，是植物病毒病绿色防控研发热点，特别是芽孢杆菌属具有很好的应用前景。芽孢杆菌首先是通过占位以及竞争占位来排斥病毒的作用，同时通过产生抗菌物质来抑制有害生物，另一方面是直接分泌特异性抗性物质抵抗病原菌。其次芽孢杆菌属可分泌酶类、金属离子载体等促进植物对营养元素的吸收，分泌植物激素促进植物生长，提高植物的免疫力。因此，芽孢杆菌属在植物病毒病绿色防控中有很好的应用前景。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法及应用。
具体的，一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一：菌种活化
将解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168接入LB固体培养基，放入31℃恒温箱内培养，连续转接2代，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168；
所述LB固体培养基的配方：10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母浸粉、10g蔗糖、18g琼脂和1000mL蒸馏水，控制LB固体培养基的PH值为7.5；
步骤二：种子液制备
在无菌操作台上，用接种环将步骤一中活化后的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168接入到LB液体培养基中，放到恒温摇床上振荡，在温度36℃、转速220r/min条件下振荡18小时，即制得种子液；
LB液体培养基的配方：10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母浸粉、10g蔗糖和1000ml蒸馏水；
步骤三：发酵液制备
将步骤二中的种子液与固体发酵培养基以1：10的质量比混合，在温度36℃、初始PH值6.0条件下发酵，直至活孢子数达到500亿/克，停止发酵，得到解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168发酵液；
所述固体发酵培养基的制备：将150g豆饼粉、350g玉米粉、100g淀粉酶、50gNa2HPO4、10gNaCl、75g蔗糖、1gMgSO4、0.5gMnSO4混合后灭菌，即得；
步骤四：菌剂制备
将步骤三中的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168发酵液与硅藻土载体以93.5：6.5的质量比混合后制成母液，烘干后研磨，得到母粉；
将母粉与木质素磺酸钠、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、糊精保护剂以82：5：7：2：4的质量比混合后烘干，即得所述解淀粉芽孢杆菌菌剂。
具体的，步骤三中，将种子液与固体发酵培养基混合，堆成小山状，在已优化好的最适培养条件下(培养温度36℃、培养时间65h、初始PH值6.0)发酵，观察菌落生长情况，优选的，观察时间为6天。活孢子数的检测方法为：将发酵液在50℃烘箱内烘干后，用粉碎机粉碎，用200目筛网上过筛后分装到塑料袋中，检测其活孢子数。
步骤四中，考虑到各载体的湿润性、分散性、成本等多个方面的因素，并且硅藻土对解淀粉芽孢杆菌Ba168发酵液吸附效果最好，吸附容量为3.12L/kg，硅藻土载体的含量应用平板计数法得到是6.5％，按重量百分比计算，故选用硅藻土作为载体与发酵液混合制备母液。
需要说明的是，木质素磺酸钠作为分散剂，聚乙二醇作为湿润剂，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为稳定剂，考虑到制剂的悬浮率、润湿度，优选的，聚乙二醇与木质素磺酸钠的复配比为7：5。
由于解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168菌剂施用到大田里，为了避免阳光中的紫外线直射会对其造成影响，需要加入保护剂，优选的，保护剂选用糊精。
进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌菌剂为可湿性粉剂。
进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌Ba168，分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens；保藏登记编号为CGMCC No.6462，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2012年08月21日。
需要说明的是，采用形态特征、生理生化实验、分子生物学鉴定法，以16SrDNA同源序列比对分析，最终确定上述保藏编号的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌Ba168从烟草根际土壤中分离得到。
另一方面，本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的应用，所述解淀粉芽孢杆菌菌剂用于防治烟草花叶病毒，用量为1g/m2。
进一步地，将解淀粉芽孢杆菌菌剂用水稀释300倍，制成喷雾，喷洒于烟苗的叶面。
进一步地，烟苗移栽后一个月，对烟苗的叶面进行第一次喷雾，间隔10天，再进行第二次喷雾。
进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌菌剂对烟草花叶病毒的防治效果达到82.95％。
相比现有技术，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌剂具有如下有益效果：
(1)本发明的解淀粉芽孢杆菌菌剂，是从烟草根际土壤中分离、纯化、筛选、鉴定获得，通过发酵处理和加入助剂，制备成解淀粉芽孢杆菌Ba168可湿性粉剂，是一种绿色环保无污染的生防菌剂，可提高植物的抗病毒特性，对人畜无害、不污染环境；
(2)本发明的解淀粉芽孢杆菌菌剂，具有对烟草花叶病毒的高效针对性，属于植物病害的绿色防控技术，成本低廉，工艺简单，后期处理损耗较低；
(3)本发明提供的解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，利用发酵产物制备生物菌剂，并进行田间防效试验，该菌剂环境相容性好，有效活孢子数达500亿/g以上，具有很高的生物活性，并且对烟草花叶病毒病的防治效果显著，可达到82.95％。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如果没有特殊说明，本发明所采用的各种试剂、原料、仪器和设备均为市售获得。
实施例1：解淀粉芽孢杆菌Ba168的分离、纯化及筛选
(1)解淀粉芽孢杆菌的分离：称取烟草根际土壤10g，倒入装有90ml灭菌水的锥形瓶中，220r/min振荡30min，再经65℃水浴加热40min，以10倍体积比稀释，涂布分离，得到分离后的解淀粉芽孢杆菌；
(2)解淀粉芽孢杆菌的纯化：根据细菌的特征及时挑取单个细菌落至LB斜面试管(即LB固体培养基)上，采用斜面划线法分离纯化，置于培养箱中培养3d，待目标菌长为菌株，纯化的菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢，G+的分离物为芽孢杆菌；
LB固体培养基配方为：酵母浸膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂18g、水1000ml，调整pH值为7.5；
(3)解淀粉芽孢杆菌的筛选：将4℃保存的烟草花叶病毒病病原接种于PDA培养基上活化，用打孔器打菌饼，置于PDA平板正中间，十字交叉法接已分离纯化的芽孢杆菌菌株于等距的四端，31℃培养2d，测定抑菌圈直径和抑菌带(即从活性菌菌落的边缘到抑菌圈的外缘)的大小。
PDA培养基的配方为：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000mL，调节pH值7.5。
采用上述步骤分离筛选获得本发明的解淀粉芽孢杆菌Ba168，分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；保藏登记编号为CGMCC No.6462，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2012年08月21日。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168的鉴定
对实施例1所得的解淀粉芽孢杆菌Ba168进行鉴定，具体如下：
(1)形态特征：解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168在LB培养基上的菌落形态为椭圆形或圆形，颜色为乳白色，边缘褶皱，表面光滑，革兰氏染色呈阳性，在电镜下观察菌体为杆状；
(2)生理生化实验：通过对解淀粉芽孢杆菌进行生理生化特性试验并结合该菌株的形态特征，对照《伯杰氏细菌手册》(Buchanan&Gibbons，1984)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，2001)进行检索，鉴定为芽孢杆菌属。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备
一种解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，包括以下几个步骤：
步骤一：菌种活化
将解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168接入LB固体培养基，放入31℃恒温箱内培养，连续转接2代，1代需要培养48h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168；
所述LB固体培养基的配方：10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母浸粉、10g蔗糖、18g琼脂和1000mL蒸馏水，控制LB固体培养基的PH值为7.5；
步骤二：种子液制备
在无菌操作台上，用接种环将步骤一中活化后的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168接入到LB液体培养基中，放到恒温摇床上振荡，在温度36℃、转速220r/min条件下振荡18小时，即制得种子液；
LB液体培养基的配方：10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母浸粉、10g蔗糖和1000ml蒸馏水；
步骤三：发酵液制备
将步骤二中的种子液与固体发酵培养基以1：10的质量比混合，在温度36℃、初始PH值6.0条件下发酵，直至活孢子数达到500亿/克，停止发酵，得到解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168发酵液；
具体的，活孢子数的检测方法为：将解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168发酵液在50℃烘箱内烘干后，用粉碎机粉碎，用200目筛网上过筛后分装到塑料袋中，检测其活孢子数。
所述固体发酵培养基的制备：将150g豆饼粉、350g玉米粉、100g淀粉酶、50gNa2HPO4、10gNaCl、75g蔗糖、1gMgSO4、0.5gMnSO4混合后灭菌，即得；
步骤四：菌剂制备
将步骤三中的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168发酵液与硅藻土载体以93.5：6.5的质量比混合后制成母液，烘干后研磨，得到母粉；
将母粉与木质素磺酸钠、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、糊精保护剂以82：5：7：2：4的质量比混合后烘干，即得所述解淀粉芽孢杆菌菌剂。
实施例4：解淀粉芽孢杆菌Ba168菌剂对烟草花叶病毒防治试验
该防治试验在西北农林科技大学植物保护学院试验站进行。
供试验的烟草：烤烟NC89。
该试验包括三组对比实验，具体如下：
一、将实施例3制得解淀粉芽孢杆菌菌剂用水稀释300倍后进行喷雾，喷洒于烟叶的叶面上，解淀粉芽孢杆菌菌剂的用量为1g/㎡；
二、使用防治烟草花叶病毒的化学制剂8％宁南霉素AS600倍液，按照说明书要求进行喷施，用量与解淀粉芽孢杆菌菌剂的用量相同；
三、使用等量清水(即CK)喷施。
设置上述三组对比试验，每个试验重复3次，共有9个随机区组排列的小区，并设有保护行。
解淀粉芽孢杆菌Ba168可湿性粉剂对烟草花叶病毒综合防治的效果对比实验：
使用手动喷雾器将上述的三组制剂(即解淀粉芽孢杆菌菌剂、8％宁南霉素AS600和水)在烟苗移栽后30天开始进行第一次喷雾处理，喷洒要均匀，间隔10d进行第二次喷雾，每组实验均重复3次。第二次喷雾后10d进行第一次调查，每隔10d调查一次，共调查2次，观察并记录发病情况，计算病情指数及防治效果。试验结果见表1。
烟草花叶病毒病严重度分级标准：每小区采用5点取样方法，每点固定调查5株，每株全叶调查，记录调查总株数及各级病株数。
烟草花叶病毒病分级评定方法：
0级：全株无病；
1级：心叶脉明或轻微花叶，或上部三分之一叶片花叶但不变形，植株无明显矮化；
2级：三分之一至二分之一叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常株高的三分之二以上；
3级：二分之一至三分之二叶片花叶、或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的三分之二至二分之一；
4级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常植株高度的二分之一以上至三分之一。
病情指数＝[∑(各级病叶数x相对级数值)]/[调查总叶数X9]X100
相对防效％＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]X100％
表1解淀粉芽孢杆菌菌剂、8％宁南霉素AS和水对烟草花叶病毒病的防治效果
由表1可知，使用本发明制得解淀粉芽孢杆菌Ba168可湿性粉剂对烟草花叶病毒病的防治有显著效果，防效可达82.95％，相比较市售的化学防治剂8％宁南霉素AS600倍液防治效果为74.04％，本发明的解淀粉芽孢杆菌Ba168可湿性粉剂防治效果更好。
对比例5：解淀粉芽孢杆菌菌剂对烟草花叶病毒病田间小区防治试验
试验用地：陕西商洛，试验地面积667m2，土质为轻壤土，有机质含量为1.72％，pH值为7.2。
试验烟苗：烤烟NC89。
试验处理：本试验设置解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂300倍液、化学制剂8％宁南霉素AS600倍液、清水三组对比试验。每个试验重复三次，共9个小区，各小区随机排列，每个小区60m2，小区间及试验地周围设置0.6m宽的隔离带。
试验方法：所有试验小区栽培条件及管理措施一致，亩用药液30kg，使用16型喷雾器将上述3组试剂在烟苗移栽后30天开始进行第一次喷雾处理，喷洒要均匀，间隔10d进行第二次喷雾，每处理重复3次。第二次喷雾后10d进行第一次调查，每隔10d调查一次，共调查2次，每小区采用5点取样法，每点固定调查5株，每株全叶调查，记录调查总株数及各级病株数，并计算病情指数及防治效果。试验结果见表2。
表2解淀粉芽孢杆菌菌剂、8％宁南霉素AS和水的防治效果
由表2可知，解淀粉芽孢杆菌Ba168可湿性粉剂对烟草花叶病毒田间防效可达到79.01％，而8％宁南霉素AS的田间防效为72.38％，可见，本申请的解淀粉芽孢杆菌Ba168可湿性粉剂对烟草花叶病毒的防治效果更好。
目前，烟草花叶病毒发病率较高，在农业生产上我们要加强以预防为主，进行综合防治。本发明的解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂贯彻了绿色环保无污染防治病害的原理，并且取得一定防治效果，所以有很大的应用前景。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一：菌种活化
将解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168接入LB固体培养基，放入31℃恒温箱内培养，连续转接2代，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168；
所述LB固体培养基的配方：10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母浸粉、10g蔗糖、18g琼脂和1000mL蒸馏水，控制LB固体培养基的PH值为7.5；
步骤二：种子液制备
在无菌操作台上，用接种环将步骤一中活化后的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168接入到LB液体培养基中，放到恒温摇床上振荡，在温度36℃、转速220r/min条件下振荡18小时，即制得种子液；
LB液体培养基的配方：10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母浸粉、10g蔗糖和1000ml蒸馏水；
步骤三：发酵液制备
将步骤二中的种子液与固体发酵培养基以1：10的质量比混合，在温度36℃、初始PH值6.0条件下发酵，直至活孢子数达到500亿/克，停止发酵，得到解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168发酵液；
所述固体发酵培养基的制备：将150g豆饼粉、350g玉米粉、100g淀粉酶、50gNa2HPO4、10gNaCl、75g蔗糖、1gMgSO4、0.5gMnSO4混合后灭菌，即得；
步骤四：菌剂制备
将步骤三中的解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168发酵液与硅藻土载体以93.5：6.5的质量比混合后制成母液，烘干后研磨，得到母粉；
将母粉与木质素磺酸钠、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、糊精保护剂以82：5：7：2：4的质量比混合后烘干，即得所述解淀粉芽孢杆菌菌剂。
2.根据权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌菌剂为可湿性粉剂。
3.根据权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌Ba168，分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；保藏登记编号为CGMCC No.6462，保藏机构为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2012年08月21日。
4.根据权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌菌株Ba168从烟草根际土壤中分离得到。
5.一种权利要求1-4任一项所述解淀粉芽孢杆菌菌剂的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌菌剂用于防治烟草花叶病毒，用量为1g/m2。
6.根据权利要求5所述解淀粉芽孢杆菌菌剂的应用，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌菌剂用水稀释300倍，制成喷雾，喷洒于烟苗的叶面。
7.根据权利要求6所述解淀粉芽孢杆菌菌剂的应用，其特征在于，烟苗移栽后一个月，对烟苗的叶面进行第一次喷雾，间隔10天，再进行第二次喷雾。
8.根据权利要求5所述解淀粉芽孢杆菌菌剂的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌菌剂对烟草花叶病毒的防治效果达到82.95％。
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