CN108587938A - 一种防治草莓枯萎病的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种防治草莓枯萎病的解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种防治草莓枯萎病的解淀粉芽孢杆菌及其应用。本发明中的一种解淀粉芽孢杆菌JM‑3，2018年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.15444。由解淀粉芽孢杆菌JM‑3发酵液制备的微生物制剂因水分含量较低，菌体处于半休眠状态，且芽孢具有较强的抗逆性，该制剂的贮存期可达2年；解淀粉芽孢杆菌JM‑3微生物制剂可有效降低草莓枯萎病的发生，降低了化学药剂的使用量。

Description

一种防治草莓枯萎病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种功能微生物，更具体地说涉及一种防治草莓枯萎病的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM-3及其应用，属于生物农药技术领域。
背景技术
草莓枯萎病是由半知菌亚门瘤座菌科尖孢镰刀菌草莓专化型(Fusariumoxysporum f.sp.Fragariae)引起的一种重要土传病害。由于草莓特殊的栽培条件及多年生种植方式，该病害在各草莓主产区发生普遍且日趋严重，已成为影响草莓产业经济效益与可持续发展的主要病害之一。
目前，我国对草莓枯萎病的防治仍以化学药剂为主，杀菌剂的频繁且不合理使用，不仅易造成病原菌抗药性的爆发，也对生态环境和人类健康产生了严重的威胁。生物防治因具有无毒、环境友好及持效期长等优点而成为近年来的研究热点。但是目前市场上可选择的生物拮抗剂往往因在土壤中定殖和竞争能力较差，无法完全满足生物防治的需要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种防治草莓枯萎病的解淀粉芽孢杆菌JM-3及其应用，解决现有生防技术中拮抗菌定殖能力不足、防控效率不佳的问题。
本发明的技术方案如下：
一种解淀粉芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM-3，2018年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.15444。
上述解淀粉芽孢杆菌JM-3的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
一种解淀粉芽孢杆菌JM-3的应用，所述解淀粉芽孢杆菌JM-3及所述解淀粉芽孢杆菌JM-3的微生物制剂应用于防治草莓枯萎病。
上述解淀粉芽孢杆菌JM-3的微生物制剂的制备方法，包括步骤：
A、菌液的制备：挑取预先在LB培养基固体平板上活化好的解淀粉芽孢杆菌JM-3单菌落，接种于装有约100mL灭菌LB液体培养基的250mL三角瓶中，于37℃、150rpm摇床培养24h，制得菌株种子液；将上述种子液转入装有50L灭菌LB液体培养基、容积为100L的发酵罐中，37℃、300rpm培养16h，制得菌体浓度为108～109cfu·mL-1的发酵液；
B、将步骤(A)制得的发酵液在4000rpm条件下离心15min，弃上清液；0.5～1.5kg沉淀物加入0.25～0.75kg黄腐酸钾、0.25～0.75kg硅藻土和0.5～1.5kg腐殖酸，充分搅拌、混匀，60℃烘干至水分含量<15％，粉碎，过筛，制得解淀粉芽孢杆菌JM-3的微生物制剂。
根据本发明优选的，上述步骤(A)中LB培养基的配方如下：NaCl 10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L，以NaOH溶液调pH为7.0。
上述微生物制剂的活菌含量为5～10亿cfu/g。
上述微生物制剂的施用方法为草莓根际土壤处理，施用剂量为10～20g/株或80～160kg/亩。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一种可防治草莓枯萎病菌的解淀粉芽孢杆菌JM-3，由该菌株发酵液制备的微生物制剂因水分含量较低，菌体处于半休眠状态，且芽孢具有较强的抗逆性，该制剂的贮存期可达2年。解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂可有效降低草莓枯萎病的发生，降低了化学药剂的使用量。
2、本发明所制备的解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂可直接接触草莓根系，对草莓生长发育无任何不良影响。
3、本发明提供的解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂，贮藏性能稳定，防治效果好，加工方便，生产和运输成本均较低。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌JM-3的扫描电镜照片；
图2为解淀粉芽孢杆菌JM-3对草莓枯萎病菌的拮抗效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。实施例中未作详细说明的操作方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
本发明中所用试剂及药品均为普通市售产品。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM-3，2018年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.15444。
实施例1
本发明从解决连作障碍效果较好的土壤中分离得到多株益生拮抗菌株，经紫外诱变和胁迫驯化，筛选得到1株对草莓枯萎病菌具有较高拮抗性能的细菌菌株，命名为JM-3，对该菌株进行16s rDNA序列测定，得到长度为1413bp的基因序列片段，经过序列比对，将菌株JM-3鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM-3，2018年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.15444。
上述解淀粉芽孢杆菌JM-3的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述解淀粉芽孢杆菌JM-3的菌落形态及生理生化特征见表1，扫描电镜照片见图1。
表1解淀粉芽孢杆菌JM-3的菌落形态及生理生化特征
注：“+”为阳性，“-”为阴性。
实施例2
按照本领域内的常规操作，活化和纯化草莓枯萎病菌株，在超净工作台上，在PDA固体培养基平板中央接种直径7mm的预先活化的生长旺盛的草莓枯萎病菌菌饼，25℃黑暗培养24h后，以牙签挑取实施例1所述的活化好的解淀粉芽孢杆菌JM-3单菌落，在距离菌饼中央2cm处的上、下、左、右4个方位各接种1点，以保鲜膜封口，25℃、黑暗培养3～4d，观察结果。
解淀粉芽孢杆菌JM-3与靶标病原菌草莓枯萎病菌的拮抗效果见图2，解淀粉芽孢杆菌JM-3对草莓枯萎病菌的抑制效果非常明显，抑菌圈清晰可见。
实施例3
挑取活化好的解淀粉芽孢杆菌JM-3单菌落，接种于装有约100mL灭菌LB液体培养基的250mL三角瓶中，于37℃、150rpm摇床培养24h，制得菌体浓度为108～109cfu·mL-1的解淀粉芽孢杆菌JM-3菌液。
从草莓枯萎病发生严重的田块取土，装于直径15cm的塑料花盆中，移栽草莓幼苗，处理组每盆草莓根际浇灌20mL菌体浓度为108～109cfu·mL-1的解淀粉芽孢杆菌JM-3菌液，对照组以清水代替菌液。每个处理设3次重复，每个重复10盆。采用常规栽培管理，每隔30d调查1次各处理组的草莓枯萎病发病率，并计算相对防效，连续4次。
解淀粉芽孢杆菌JM-3菌液对草莓枯萎病的防治效果如表2所示。较对照组，移栽后30、60、90和120d，解淀粉芽孢杆菌JM-3对草莓枯萎病的相对防效分别为66.67％、66.65％、77.77％和80.00％，具有较长的持效期。
表2解淀粉芽孢杆菌JM-3菌液对草莓枯萎病的防治效果
实施例4
解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂，其制备方法如下：
A、菌液的制备：挑取预先在LB培养基固体平板上活化好的JM-3单菌落，接种于装有约100mL灭菌LB液体培养基的250mL三角瓶中，于37℃、150rpm摇床培养24h，制得菌株种子液。将上述种子液转入装有50L灭菌LB液体培养基、容积为100L的发酵罐中，37℃、300rpm培养16h，制得菌体浓度为108～109cfu·ml-1的发酵液；
B、将步骤(A)制得的发酵液在4000rpm条件下离心15min，弃上清液。1kg沉淀物加入0.5kg黄腐酸钾、0.5kg硅藻土和1kg腐殖酸，充分搅拌、混匀，60℃烘干至水分含量<15％，粉碎，过筛，得到活菌含量为5～10亿cfu/克的粉末状微生物制剂。
实施例5
从草莓枯萎病发生严重的田块取土，装于直径15cm的塑料花盆中，移栽生长正常的草莓幼苗，处理组每株草莓根际分别撒施10g和20g实施例4制备的解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂，对照组未处理。每个处理设3次重复，每个重复10盆。采用常规栽培管理，每隔30d调查1次各处理组的草莓枯萎病的发病率，并计算相对防效，连续4次。
解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂对草莓枯萎病的防治效果如表3所示。较对照组，移栽后30、60、90和120d，解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂10g/株对草莓枯萎病的相对防效分别为66.67％、60.00％、80.00％和72.73％，20g/株对草莓枯萎病的相对防效分别为100.00％、80.02％、80.00％和81.81％，高剂量解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂处理对草莓枯萎病的防效均高于低剂量，且具有较长的持效期。
表3解淀粉芽孢杆菌JM-3粉末状制剂对草莓枯萎病的防治效果
实施例6
在连续多年种植草莓、枯萎病发生严重的温室大棚内种植生长正常的草莓幼苗，处理组每株草莓根际分别撒施10g和20g实施例4制备的解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂，对照组未处理。每个处理设3次重复，每个重复为1个小区。小区长7m，宽5m，面积35m2，约种植草莓30株。随机区组排列，处理间设保护行。采用常规栽培管理，每隔30d调查1次各处理的草莓枯萎病的发病率，并计算相对防效，连续4次。
解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂对草莓枯萎病的田间防效如表4所示。较对照组，移栽后30、60、90和120d，解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂10g/株对草莓枯萎病的相对防效分别为76.50％、68.19％、62.50％和61.56％，20g/株对草莓枯萎病的相对防效分别为82.36％、77.30％、75.00％和73.10％，高剂量解淀粉芽孢杆菌JM-3微生物制剂处理对草莓枯萎病的防效均高于低剂量，且具有较长的持效期。
表4解淀粉芽孢杆菌JM-3粉末状制剂对草莓枯萎病的田间防效
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省果树研究所
<120> 一种防治草莓枯萎病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 1
gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120
tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 420
ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720
cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780
gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960
cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200
aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc cag 1413

Claims (6)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JM-3，2018年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.15444。
2.一种解淀粉芽孢杆菌JM-3的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌JM-3及所述解淀粉芽孢杆菌JM-3的微生物制剂应用于防治草莓枯萎病。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌JM-3的微生物制剂的制备方法，包括步骤：
A、菌液的制备：挑取预先在LB培养基固体平板上活化好的解淀粉芽孢杆菌JM-3单菌落，接种于装有约100mL灭菌LB液体培养基的250mL三角瓶中，于37℃、150rpm摇床培养24h，制得菌株种子液；将上述种子液转入装有50L灭菌LB液体培养基、容积为100L的发酵罐中，37℃、300rpm培养16h，制得菌体浓度为108～109cfu·mL-1的发酵液；
B、将步骤(A)制得的发酵液在4000rpm条件下离心15min，弃上清液；0.5～1.5kg沉淀物加入0.25～0.75kg黄腐酸钾、0.25～0.75kg硅藻土和0.5～1.5kg腐殖酸，充分搅拌、混匀，60℃烘干至水分含量<15％，粉碎，过筛，制得解淀粉芽孢杆菌JM-3的微生物制剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂的制备方法，步骤(A)中，LB培养基的配方如下：NaCl 10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L，以NaOH溶液调pH为7.0。
5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂的活菌含量为5～10亿cfu/g。
6.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂的施用方法为草莓根际土壤处理，施用剂量为10～20g/株或80～160kg/亩。
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