CN104232499A - 产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物及其农药制剂应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离自海泥样品，产生抗植物病原真菌脂肽的生防微生物及其应用。本发明的微生物为Bacillus licheniformis9912菌株（中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No.M2010343）。该菌发酵主要产生环脂肽类化合物6-Abu C16fengycin、anteiso-C15surfactin和anteiso-C15surfactin methyl ester，其具有广谱抗植物病原真菌生物活性，由该菌及包含上述发酵代谢产物，能与常规吸附载体和助剂制成有效防治黄瓜、番茄灰霉病、枯萎病、番茄茎腐病、苹果树腐烂病、苹果树干腐病、梨树枯萎病等的微生物制剂、生物农药制剂，具有成本低、生防高效、无残留、对人畜安全的特点。

Description

产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物及其农药制剂应用

技术领域

本发明涉由一种分离自海泥样品，产生抗植物病原真菌脂肽的生防微生物及其应用。本发明的微生物为Bacillus licheniformis9912菌株（中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No.M2010343）。该菌发酵主要产生环脂肽类化合物6-Abu C16fengycin、anteiso-C15surfactin、anteiso-C15surfactinmethyl ester，具有广谱抗真菌生物活性，由该菌及包含上述发酵代谢产物可制成能有效防治黄瓜灰霉病、枯萎病其它植物病原真菌病害作为生物农药、微生物制剂及植物根际促生菌剂的应用。

背景技术

近年来，微生物来源的脂肽被用于抗真菌病方面的研究有了很大的进展，它与化学农药相比污染少，对环境友好，因此在农业生物防治领域具有广阔的应用前景（Ongena M;Jacques P Bacillus lipopeptides:versatile weapons forplant disease biocontrol，Trends in Microbiology200816(3)doi:10.1016/j.tim.2007.12.009）。其中枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）以及蜡状芽孢杆菌（B.cereus）是产脂肽的主要菌种。芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素有表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和丰原素（Fengycin）三大类，分子量一般在2KDa以下。其中Iturin A具有强烈的抗真菌特性（-Regime Maget-Dana.Iturins,aspecial class of pore-forming lipopeptides:biologicaland physicochemical properties Toxicology，1994,87：151-174.），也抑制部分细菌活性，如Micrococcus luteus等。除抗生素类Iturin具有广谱抑制植物病原菌的作用，能够作为生物控制剂取代部分化学杀真菌剂，能有效抑制病原菌对农作物的危害外。表面活性素同系物的混合物（C₁₃,C₁₄和C₁₅）具有抗立枯丝核菌(Rhizoctonia solani-)和稻梨孢(Pyricularia oryzae)的作用（GaoX W,Yao S Y,Huong P,et al.Lipopeptide antibiotics produced by theengineered strain Bacillus subtilis GEB3and detection of its bioactivity.Sci Agri Sin,2003,36:1496-1501.）。地衣素与表面活性素相比，只是在肽序列中1位置地衣素以谷氨酰胺取代了表面活性素肽序列中谷氨酸，对瑞氏木霉(Trichoderma reesei)有抑制作用，最小抑菌浓度均为0.5mg/mL（-KosaricN.Biosurfactants:Production,Properties,Applications.New York:Marcel Dekker,1993.）。不同的枯草芽孢杆菌菌株还能产生杆菌抗霉素类似物，也具有强烈的抗真菌活性。

Kim等（Kim P I,Bai H,Bai D,et al.Purification andcharacterization of a lipopeptide produced by Bacillus thuringiensisCMB26.Appl Microbiol,2004,97:942-949.）分离到苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)用于控制植物病原真菌，结构鉴定表明，该菌产生的脂肽化合物为丰原素(fengycin)类似物，其抗真菌活性优于表面活性素(surfactin)和伊枯草菌素(iturin)，成为农业上用于抗植物病原真菌的候选化合物。Yetrib等（Yetrib Hathout,Yen-Peng Ho,Victur Ryzhov，et al．Kurstakins:A new class of lipopeptides isolated from Bacillus thuringiensis.Nat．Prod，2000,63：1492-1496.）从细菌B.thuringiensis Kumtmi HD-1发酵液中分离得到4个具有抗真菌Stachybotrys charatum活性的kurstatin类型环脂肽类成分。Nielsen等（Nielsen T H,Thrane C,Christophersen C,etal.Structure,production characteristics and fungal antagonism oftensin-a new antifungal cyclic lipopeptide from Pseudomonas fluorescensstrain96.578.Appl Microbiol,2000,89:992-1001）从荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens DR54和P.fluorescens96578中分别分离得到化合物viscosinamide和tensin，均具有拮抗植物病原菌终极腐霉菌(Pythiumuhimum)及辣椒丝核病菌(R.solani)的作用。

刘静等（刘静，王军，姚建明等．枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分离纯化．微生物学报，2004，4(4)：511-514.）从枯草芽孢杆菌JA分泌物中获得3种对水稻纹枯(R.solani)和小麦赤霉菌（Fusariumgraminearum）均具有抑菌作用的抗菌肽AFP1、AFP2和AFP3。刘颖等（刘颖，徐庆，陈章良．抗真菌肽LP-1的分离纯化及特性分析．微生物学报，1999，39(5)：441-447）从枯草芽孢杆菌TG-26中分离到一种环肽LP-1，对瓜果腐霉(P.aphanidermatum)、玉蜀黍赤霉病菌(Gibberella zeae)、长柄链格孢(Alternaria longipe)和番茄蔫座链孢霉(F.oxysporum f.Lycopersici)等植物病原真菌有很强的抑制作用。枯草芽孢杆菌B2菌株产生的脂肽类抗生素，用于防治大白菜软腐病和油菜菌核病，有很好的防治效果（高学文，姚仕义，Huong Pham等．枯草芽孢杆菌B2菌株产生的表面活性索变异体的纯化和鉴定．微生物学报，2003，43(5)：647-651）。

利用产生脂肽的微生物来制造生防制剂的例子很多（Tzeng Dean Der-Syh，Huang Win-De，US20080152684-Method for preparing a compositioncontaining Bacillus subtilis WG6-14and related use）。德国的汉堡大学与Taensa公司合作采用枯草芽孢杆菌制造的生物制剂FZB24，商品名TaegroTM。施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部,可防治由镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病，美国Gustafson公司的Yield Shield作为种衣剂，专门防治大豆根部真菌性病害，使用的是含Bacilis pumillus的粉剂。俄罗斯全俄植保所研发的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂Alifine2B,可用于防治多种作物真菌病害,田间防效高达60%-95%,增产达25%-35%。美国、加拿大均有组合多菌的制剂产品，如Companion liquid包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌；Gustafson将解淀粉枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂,称为BioYield，通过喷淋防治包括土传病在内的多种真菌病害。

我们对筛选到的活性菌株Bacillus licheniformis9912经过多年的试验研究，发现其对多种真菌性病害具有很好的生防效果。对其主要活性产物进行的研究发现，脂肽类抗真菌物质起着重要的作用。新近的鉴定发现，其与Bacilusmethylotrophicus特征相吻合，此种为2010年Munusamy Madhaiyan等（Madhaiyan M.,Poonguzhali S.,Kwon S.W.,et al.Bacilus lincheniformissp.nov.,a methanol-utilizing,plant-growth-promoting bacteriumisolated from rice rhizosphere soil，International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology,2010.60(10):p.2490-5）自水稻根系土壤中分离得到，并首次明确为新种，但作为植物根际促生细菌，没有报道其可能的抗菌活性物质；莫明和等（莫明和,林碧莲,黄英等.一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用，中国发明专利.CN102120969A.2011.）申请应用于对作物的真菌病害防治的发明专利，也未阐明抗菌作用物质及作用机理。

本发明阐明由海泥样品分离得到的Bacillus licheniformis9912菌株，不仅菌体产生芽孢作为生物制剂的应用，也对其产生抗菌脂肽化合物及应用进行了研究揭示。

发明内容

本申请经过对分离自海洋样品的细菌进行抗真菌活性筛选研究发现，由海泥样品中分离得到的Bacillus licheniformis9912对黄瓜灰霉病及苹果腐烂病等有很好的生物防治效果，经发酵产生至少3种环脂肽类化合物6-Abu C16fengycin、anteiso-C15surfactin和anteiso-C15surfactin methyl ester，具有广谱抗真菌生物活性。

本发明的目的在于提供由该菌及包含上述发酵代谢产物制成能有效防治黄瓜灰霉病等植物真菌病害的微生物制剂、生物农药制剂及其应用方法。

本发明所提供的Bacillus licheniformis9912，于2010年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No.M2010343。于2012年6月7日，由中国科学院微生物研究所鉴定更名为甲基-营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）9912。

其中，本申请中提供的于2010年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No.M2010343的保藏证明中，培养物名称拼写错误，应为“Bacillus licheniformis9912”(见蔡妙英等主编“细菌名称”（第二版）科学出版社1980年第一版，1996年第二版77页；或杨瑞馥等主编的“细菌名称双解及分类词典”2011年化学工业出版社第112页)，特此说明。

本发明所用的术语“发酵”或“培养”具有本领域技术人员通常熟知的惯常技术手段。

在一个具体的实施方案中，应用于本培养可以为采用500ml容积的三角瓶3个，每瓶装100ml发酵培养基（蔗糖2%，KH₂PO₄0.3%,Na₂HPO₄1%,NH₄NO₃0.2%,MgSO₄·7H₂O0.02%,酵母粉0.02%,CaCl₂0.7μg/100ml,MnSO₄·H₂O1μg/100ml,初始pH7.0-7.2，余量为水），121℃灭菌30分钟，冷却后分别接种一环新鲜的活化好的抗真菌脂肽产生菌Bacillus licheniformis9912，置于28℃摇床内、180rpm振荡培养24小时，培养结束取出取出镜检无杂菌即可作为种子液。

将培养好的种子液按体积比5%的接种量接种于内装6L灭菌（于121℃灭菌25分钟，冷却）发酵培养基的10L发酵生物反应器中，在罐温28℃±1℃下，罐压0.05Mpa、通风量为6L/min、搅拌速度为200rpm，通气搅拌发酵48h即可放罐，此发酵液可用于提取粗脂肽。

在培养时可以采用豆油、泡敌等消泡剂进行消泡。在一些较佳的实施方案中，pH控制在7.0～7.2，培养温度27～29℃。培养时间通常在24-72小时之间。然而，本领域技术人员应当了解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体的培养及配方和培养条件。

一种产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物，其特征在于：所用微生物为分离自辽宁省渤海海域海泥样品的Bacillus licheniformis9912菌株，以于2010年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No.M2010343。

一种农药制剂，

所述农药制剂是以培养Bacillus licheniformis9912得到的发酵液或发酵液的上清液为活性成份制备得到的用于防治植物真菌病害的生物农药制剂；

或，所述农药制剂是以Bacillus licheniformis9912或培养Bacilluslicheniformis9912得到的内生芽孢为活性成份制备得到的用于防治植物真菌病害的微生物农药制剂。

所述的农药制剂，

一、所述培养Bacillus licheniformis9912得到发酵液的过程为：

于容积中装50～100ml发酵培养基，121℃灭菌15～25min，冷却后接种一环新鲜的活化好的Bacillus licheniformis9912，置于27～35℃摇床内，150～240rpm振荡培养24～72h，培养结束取出镜检无杂菌即可作为种子液；

其中，所述发酵培养基的组成为：蔗糖0.5～3%，KH₂PO₄0.1～0.5%,Na₂HPO₄0.5～2%,NH₄NO₃0.1～0.3%,MgSO₄·7H₂O0.01～0.03%,酵母粉0.01～0.03%,CaCl₂0.1～1.5μg/100ml,MnSO₄·H₂O0.5-1.5μg/100ml,初始pH7.0-7.2，余量为水；

将培养好的种子液按体积比3～10%的接种量接种于内装6L灭菌（灭菌条件：于121℃灭菌15-25min，冷却）发酵培养基的10L发酵生物反应器中，在罐温27～40℃下，罐压0.03～0.08Mpa，通风量为3～9L/min，搅拌速度为150～300rpm，通气搅拌发酵24～72h即可放罐，得发酵液；

或所述培养Bacillus licheniformis9912得到发酵液的上清液过程为：

在获得了上述发酵液后，将发酵液用质量浓度1～3%的NaOH溶液调pH至7.5～8.5，然后常温下3000～5000rpm离心20～30min或板框压滤除去菌体及其它固形物，得上清液；

或，二、所述培养Bacillus licheniformis9912得到的内生芽胞的过程为：

（1）发酵培养：克氏瓶种子培养，采用500ml容积克氏瓶，装40～80ml培养基，121℃灭菌15～25min，冷却后放斜面，接种Bacillus licheniformis9912，而后将接种后的克氏瓶放在25～28℃保温箱中保温培养48～72h，取出即可作为种子用；

其中，所述克氏瓶种子培养用的培养基为改良淀粉培养基，其组成为：可溶性淀粉1～3％，牛肉膏0.3～0.8%，酵母膏0.3～0.8%，NaCl0.3～0.8%，pH自然；

（2）10L发酵生物反应器发酵，罐装培养基为6L，115℃蒸汽灭菌30min，冷却后，接种步骤（1）中所述的种子，种子用200ml无菌水洗下后，应用无菌技术接种至10L容积生物反应器中，在此条件下培养20～48h，即可放罐；

其中，发酵生产的培养条件为：罐压0.03～0.08Mpa，罐温28℃±1℃，通风量为4～8L/min，搅拌速度为150～300rpm；

其中，所述培养基为液体发酵培养基，其组成为：玉米粉1～2%，麸皮0.2～0.5%，黄豆饼粉0.05～0.2%，磷酸二氢钾0.02～0.08%，碳酸钙0.05～0.10%，其余为水，pH6.5；

上述得到Bacillus licheniformis9912的发酵液，每ml发酵液菌体细胞达到0.5亿个CFU以上，芽孢形成80%以上，作为制造微生物农药制剂的原料；

所述微生物农药制剂的制造：将草炭粉121℃灭菌15～25min，晾干后将与发酵液混合拌匀，其中草炭粉占总质量比的15～20％，含菌细胞数在0.3亿个CFU/ml～10亿个CFU/ml；或压滤离心获得菌体，与可接受载体混合制成1亿～100亿CFU/g固体制剂。

进一步地，所述生物农药制剂或微生物农药制剂分别包含所述活性组分，以及农药学上可以接受的载体。

进一步地，利用培养如权利要求1所述的Bacillus licheniformis9912得到的内生芽孢为活性成分的发酵菌液，混合可接受的载体制成应用剂型，芽孢含量10⁵～10¹⁰cfu/g。

进一步地，所述生物农药制剂或微生物农药制剂作为用于防治植物真菌病害的农药。

进一步地，所述的农药制剂用于抑制植物病原菌包括：黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）,苹果干腐病菌(Botryosphaeria berengriana)，苹果轮纹病菌(B.berengriana f.sp.Piricola)，黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.Cucumerinum)，玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)，禾谷镰刀菌(F.grammcarum)，小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)，大豆根腐病菌(F.solani)，棉花枯萎病菌(F.oxysporum.sp.Vasinfectum)，棉花黄枯病菌(Verticilliu dahliae)等病原菌中的一种或二种以上。

进一步地，所述的农药制剂用于抑制植物病包括：黄瓜灰霉病（Botrytiscinerea）,苹果干腐病(Botryosphaeria berengriana)，苹果轮纹病(B.berengriana f.sp.Piricola)，黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum.sp.Cucumerinum)，玉米纹枯病(Rhizoctonia solani)，玉米小斑病(Bipolarismaydis)，禾谷镰刀(F.grammcarum)，小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)，大豆根腐病(F.solani)，棉花枯萎病(F.oxysporum.sp.Vasinfectum)，棉花黄枯病(Verticilliu dahliae)等植物病中的一种或二种以上，实验表明施用于农作物及果树，可以有效地防止植物真菌病害的发生，且对作物生长无不良影响。

一种所述产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物的应用，采用Bacilluslicheniformis9912经发酵分离纯化产生三种抗菌活性脂肽化合物中的一种或二种或三种，所述化合物的结构如下所示：

所述产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物的应用，所述的制备抗菌活性脂肽化合物的方法包括以下步骤：

制备上述化合物的方法包括以下步骤：

（1）培养Bacillus licheniformis9912得到发酵液；

具体为：采用500ml容积的三角瓶3个，每瓶装100ml发酵培养基（蔗糖0.5～3%，KH₂PO₄0.1～0.5%,Na₂HPO₄0.5～2%,NH₄NO₃0.1～0.3%,MgSO₄·7H₂O0.01～0.03%,酵母粉0.01～0.03%,CaCl₂0.1～1.5μg/100ml,MnSO₄·H₂O0.5-1.5μg/100ml,初始pH7.0-7.2，余量为水），121℃灭菌15～25min，冷却后分别接种一环新鲜的活化好的抗真菌脂肽产生菌Bacillus licheniformis9912，置于27-35℃摇床内、150～240rpm振荡培养16～32h，培养结束取出取出镜检无杂菌即可作为种子液；

将培养好的种子液按体积比3～10%的接种量接种于内装6L灭菌（于121℃灭菌15～25min，冷却）发酵培养基的10L发酵生物应器中，在罐温27～35℃下，罐压0.03～0.08Mpa、通风量为4～8L/min、搅拌速度为150～300rpm，通气搅拌发酵24～72h即可放罐，此发酵液可用于提取粗脂肽；

（2）在获得了上述发酵液后，通过离心或板框压滤除去菌体：于能够产生抗真菌脂肽的Bacillus licheniformis9912菌株发酵培养结束后，将发酵培养液用质量浓度1～3%的NaOH溶液调pH至7.5～8.5，然后常温下3000～5000rpm离心20～30min或板框压滤除去菌体及其它固形物；

用酸沉淀、有机溶剂提取、层析方法从所述发酵液中分离纯化获得下述多种抗真菌环脂肽类化合物；

A.酸沉淀：将上一步骤所得上清液用5～7mol/L盐酸调pH至1～3，于4℃冰箱内放置过夜，次日于3000～5000rpm离心20～30min，收集沉淀，并用pH1～3的稀盐酸反复洗涤三次，以除去表面残余上清；

B.甲醇提取：将上一步骤所得沉淀物用甲醇提取，反复提取三次，然后将甲醇提取液在35℃旋转蒸发仪上旋转蒸发除去甲醇，即得到粗脂肽；

C.硅胶色谱柱快速洗脱过程为：将600目硅胶填充于色谱柱内（60mm×100mm），然后准确称取3～6g粗脂肽样品上样，依次以0/100,1/99,2/98,5/95,10/90,20/80,30/70,50/50,100/0的甲醇/二氯甲烷洗脱液各300～500ml减压快速洗脱；然后收集各洗脱组分，旋干后称重并检测抗真菌活性，保留具有活性组分，检测抗真菌活性：分别用滤纸片法检测所得的环脂肽类化合物纯品抗真菌活性：过程为：取环脂肽类化合物纯品滴于无菌滤纸圆片，挥干后贴在中央有病原真菌菌落的沙氏培养基平板边缘，25-30℃恒温培养箱内培养24-72h观测产生抑菌圈以检测环脂肽类化合物的抗真菌活性；

D.应用RP-HPLC制备方法：将经过硅胶快速色谱洗脱后得到的抗真菌活性部分，用甲醇：0.05%TFA水溶液=75：25（v/v）溶解，然后采用YMC ODS-A半制备柱（250mm×10mm）进行制备，色谱条件为：流动相为甲醇：0.05%TFA水溶液=75：25（v/v），流速2～3ml/min，进样量250μl，检测波长210nm；分别收集流出的色谱峰，旋干溶剂后即得到脂肽纯品。

按照此方法放大培养，500L及1KL-10KL发酵罐发酵培养，为本专业技术人员熟练实施的范围，均在本发明内。

本发明具有如下优点：

本发明的微生物为Bacillus licheniformis9912菌株，发酵主要产生环脂肽类化合物6-Abu C16fengycin、anteiso-C15surfactin和anteiso-C15surfactin methyl ester，具有广谱抗植物病原真菌生物活性，由该菌及包含上述发酵代谢产物，能与常规吸附载体和助剂制成有效防治黄瓜、番茄灰霉病、枯萎病、番茄茎腐病、苹果树腐烂病、干腐病、梨树枯萎病等的微生物制剂、生物农药制剂，具有成本低、生防高效、无残留、对人畜安全的特点。利用该菌进行的微生物发酵，发酵原料为农业生产的边角料，成本低廉易得，发酵条件也易于控制。

附图说明

图1母离子为m/z739.42[M+2H]²⁺的正离子ESI-Q-TOF MS2质谱；

图2化合物9912-6-3母离子峰m/z739.42[M+2H]²⁺形成的碎片类型

其中，A:肽环开裂起始于4位Thr的N-端；B:肽环开裂起始于7位Pro的N-端，进而形成分支酰基阳离子，伴随之后肽链侧链P-Q-Y-I的进一步裂解；C:Orn的N-端y-型裂解及7位Pro的N-端开环裂解形成从属于侧链P-Q-Y-I内裂解的分支酰基阳离子；

图3生物制剂主要工艺流程图;

图4为Bacillus licheniformis9912菌株的脂肽指纹图谱；

图5为9912-6-3的¹H NMR图谱；

图6为9912-6-3的¹³C NMR图谱；

图7为9912-6-3的¹H-¹H COSY谱；

图8为9912-6-3的HSQC谱；

图9为9912-6-3的HMBC谱；

图10为anteiso-C15 surfactin的ESI-Q-TOF图谱([M+H]⁺)；

图11为anteiso-C15 surfactin的¹H NMR图谱；

图12为anteiso-C15 surfactin的¹³C NMR图谱；

图13为anteiso-C15 surfactin methyl ester的ESI-Q-TOF图谱([M+H]⁺及M+Na]⁺)；

图14为anteiso-C15surfactin methyl ester的¹H NMR图谱；

图15为anteiso-C15surfactin methyl ester的¹³C NMR图谱。

具体实施方式

1.本发明中Bacillus licheniformis9912的培养及抗菌活性测定

将菌株活化，挑取一环接种于产脂肽发酵培养基（蔗糖2%，KH₂PO₄0.3%,Na₂HPO₄1%,NH₄NO₃0.2%,MgSO₄·7H₂O0.02%,酵母粉0.02%,CaCl₂0.7μg/100ml,MnSO₄·H₂O1μg/100ml,初始pH7.0-7.2，余量为水）50ml中，300ml摇瓶，于摇床上28℃，180rpm振荡培养2d。培养结束后将发酵液于12000rpm离心10min，取上清液，备用。采用管碟法或含毒介质法测定发酵液对立枯丝核菌和白色念珠菌的抑制活性。管碟法的方法是在PDA平皿中央接种病原菌立枯丝核菌的菌丝块，待真菌长到菌丝直径约2.5cm左右时，放入4-6枚牛津杯；或者将白色念珠菌菌悬液涂布于沙氏培养基平板上，放入4-6枚牛津杯，在杯内加入200μl各活性菌株的发酵上清液，然后28℃恒温培养18-24h，测定抑菌圈的大小，记录实验结果。不同病原菌按照同样的做法，测定结果见表1。供试病原真菌培养基：PSA培养基：20%土豆浸出液，蔗糖2%，琼脂2%，pH7.0-7.2，115℃，0.08Mpa蒸汽灭菌30min。白色念珠菌的培养用沙氏培养基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，琼脂2%，pH5.6，115℃，0.08Mpa蒸汽灭菌30min；大肠杆菌用LB培养基；弧菌培养用TCBS培养基。

表1 Bacillus licheniformis9912发酵液抗菌活性（抑菌圈直径，单位mm）

检测菌	抑菌圈直径（mm）	检测菌	抑菌圈直径（mm）
				大肠杆菌	20.0	小麦根腐病	18.0
枯草杆菌	22.0	小麦赤霉病	17.0
				大豆紫青霉891	26.0	苹果腐烂病	38.0
大豆根腐菌（F6）	28.0	苹果纶纹病	36.0
				玉米小斑病（F33）	30.0	水蜜桃腐烂病	35.0
玉米大斑病	28.0	蔬菜根腐病	21.0
				水稻立枯病（幼苗）	30.0	棉花枯萎并（镰刀菌）	18.0
鱼病弧菌病（96X）	30.0	棉花黄萎病（轮枝菌）	17.0
				皱褶假丝酵母Y76	40.0	哈密瓜根腐病	18.0
白色念球菌	40.0	紫青霉961	25.0
				水母病原菌JF2	38.0	鲍鱼病菌（弧菌TB--1）	31.0
水母病原菌JF4	36.0	鲍鱼病菌（弧菌TB--2）	38.0
				烟草赤星病	18.0

*其中标准制霉菌素300ppm对皱褶假丝酵母Y76的抑菌圈直径为18.0mm

2.本发明中Bacillus licheniformis9912的发酵抗菌活性脂肽化合物的提取

（a）培养种子液：种子培养基为改良淀粉培养基，其组成为：可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，NaCl0.5%，余量为水，pH自然。采用300ml三角瓶，装50ml培养基，121℃灭菌15min，冷却后斜面接种于28℃摇床160rpm培养24h。

（b）将培养好的种子液按体积比5%的接种量接种于内装6L灭菌（于121℃灭菌30min，冷却）发酵培养基（蔗糖2%，KH₂PO₄0.3%,Na₂HPO₄1%,NH4NO₃0.2%,MgSO₄·7H₂O0.02%,酵母粉0.02%,CaCl₂0.7μg/100ml,MnSO₄·H₂O1μg/100ml,初始pH7.0-7.2，余量为水）的10L发酵生物应器中，在罐温28℃±1℃下，罐压0.05Mpa、通风量为6L/min、搅拌速度为200rpm，通气搅拌发酵48h即可放罐，此发酵液可用于提取粗脂肽。

（c）用质量浓度2%的NaOH溶液调发酵液的pH至8.0，然后在常温下于4000rpm离心30min，除去菌体及其它固形物；所得到的发酵上清液用6mol/L盐酸调pH至2.0，于4℃冰箱内放置过夜，次日于4000rpm离心30min，收集沉淀，并用pH2.0的稀盐酸反复洗涤沉淀三次，以除去表面残余上清。所得沉淀物用甲醇提取，反复提取三次后将提取液旋转蒸发除去甲醇，干燥后即得到粗脂肽。

（d）准确称取4g所得粗脂肽，上硅胶色谱柱（60mm×100mm），依次以0/100,1/99,2/98,5/95,10/90,20/80,30/70,50/50,100/0的甲醇/二氯甲烷洗脱液各400ml进行减压快速洗脱。然后收集各洗脱组分，旋转蒸发干燥后称重并用滤纸片法检测追踪抗真菌活性，保留其中含有抗真菌脂肽、即具有抗真菌活性的的组分（以玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani为检测靶菌）。

（e）应用RP-HPLC制备方法：将经过硅胶快速色谱洗脱后得到的抗真菌活性部分，用甲醇：质量浓度0.05%TFA水溶液=75：25（v/v）溶解，然后采用YMC ODS-A半制备柱（250mm×10mm）进行制备，色谱条件为：流动相为甲醇：质量浓度0.05%TFA水溶液=75：25（v/v），流速2.5ml/min，进样量250μl，检测波长210nm；分别收集流出的色谱峰，分别用滤纸片法检测抗真菌活性：取20μL滴于直径1cm的无菌滤纸圆片，挥干后贴在中央有直径约2cm病原真菌菌落的沙氏培养基（葡萄糖4%，蛋白胨1%，琼脂2%，pH5.6，115℃，0.08Mpa蒸汽灭菌30min）平板边缘，28℃恒温培养箱内培养48h观测产生抑菌圈；旋干溶剂后即得到抗真菌脂肽纯品。

3.Bacillus licheniformis9912脂肽化合物结构鉴定与分析

分离纯化得到的化合物9912-6-3（即：6-Abu C16fengycin）在全离子扫描中得到了的双电荷离子峰m/z739.42[M+2H]²⁺，选择该成分进行串联质谱测定。化合物9912-6-3的串联质谱结果，离子峰m/z1477.85、1459.85和1449.87可以分别归为单电荷分子离子[M+H]⁺、[M+H-H₂O]⁺和[M+H-CO]⁺，在质谱中发现了高丰度的双电荷离子m/z739.32[M+2H]²⁺及m/z721.29[M+2H-CO]²⁺(如图1)，表明化合物9912-6-3的肽链(而不是之前推测得脂肪酸链)部分多出一个亚甲基。来自脂肪酸侧链的明显的碎片离子m/z254.26(FA),384.29(FA-Glu)和m/z498.38(FA-Glu-Orn)进一步证实该结果。在fengycins家族中fengcin A在第二位氨基酸鸟氨酸(Orn)残基末端具有特征碎片离子：m/z1080和966，同样，m/z1108和994为fengycin B的特征离子峰。很明显，对于化合物9912-6-3，离子峰m/z1094和m/z980预示着其代表着fengycin家族的一类新型衍生物。

化合物9912-6-3的肽链的开环容易发生在第七位氨基酸脯氨酸(Pro)的N-端或第四位氨基酸苏氨酸(Thr)的N-端。前者的开环和随之肽链P-Q-Y-I上的氨基酸残基按顺序的逐一裂解形成了一系列y-型碎片离子m/z1252.76,1089.70和m/z661.45及b-型碎片离子m/z226.12和m/z389.19，如图2(B)。与此相似，我们也观察到了特殊的y-型内裂解离子峰m/z1094.58,869.48,706.41，如图2(B)。这些数据结果清楚的表明了在肽链P-Q-Y-I上(包括第三位酪氨酸(Tyr)和脂肪酸侧链)没有任何化学修饰。因此，化学修饰必然发生在肽链X-E-T的三个氨基酸中的一个。

上段提到的第二种开裂方式(发生在苏氨酸(Thr)的N-端)能够产生链状肽链酰基阳离子(acylium ion)，在该裂解方式中氨基酸残基从两端分别裂解掉，形成图2(A)所显示的两种系列的离子。结果中b-型碎片离子m/z1376.83,1247.64,1162.73和y-型碎片离子m/z231.10和m/z413.28清楚地显示出了该侧链的氨基酸顺序为Abu-Glu-Thr。因此，化合物9912-6-3可确定为第六位氨基酸由Abu取代的不同于传统fengycin A和B的新型fengycin，与我们先前发现并报道的一致（Lili Chen,Nan Wang,Xuemei Wang,Jiangchun Hu,ShujinWang.Characterization of two antifungal lipopeptides produced byBacillus amyloliquefaciens SH-B10[J].Bioresour Technol,20108822-8827），即为6-Abu C16fengycin。

图2化合物9912-6-3母离子峰m/z739.42[M+2H]²⁺形成的碎片类型A:肽环开裂起始于4位Thr的N-端B:肽环开裂起始于7位Pro的N-端，进而形成分支酰基阳离子，伴随之后肽链侧链P-Q-Y-I的进一步裂解C:Orn的N-端y-型裂解及7位Pro的N-端开环裂解形成从属于侧链P-Q-Y-I内裂解的分支酰基阳离子活性化合物对植物病原菌的抑制作用测定：纯化合物9912-6-3溶解在PBS(phosphacate butter saline)(pH=8.5)中配制成2mg/ml的溶液，梯度半数稀释至1mg/ml、500μg/ml、250μg/ml及125μg/ml。采用Raahave滤纸片法（Raahave，1974）进行不同浓度化合物溶液的抗真菌活性测试，用打孔器将活化好的待测真菌连培养基打成8mm菌块置于PSA平板中央，28℃恒温培养至菌块直径长至约2cm大小，此时将载有10μl待测化合物溶液的无菌滤纸片置于待测真菌周围，每个浓度设3个平行，以无菌PBS(pH=8.5)纯溶液作为对照，于28℃培养箱中培养48h，用游标卡尺测量滤纸片周围产生的抑菌圈直径，结果见表2。

表2 化合物9912-6-3（6-Abu C16fengycin）对5种植物病害真菌抑菌活性

其余二种，经ESI-Q-TOF-MS、GC-MS、ESI-MS结构解析，确定为anteiso-C15surfactin：和anteiso-C15 surfactin methyl ester（见图10～15）。ESI-Q-TOF-MS给出的分子量分别为1035.7和1049.7，差别为一个亚甲基单位(-CH₂)，二者均具备表面活性素类化合物(surfactins)母核的特征性分子量，由于后者的NMR图谱上较前者多出一个典型的甲氧基信号，因此，推测其为前者的单甲酯。利用脂肪链末端甲基的特征共振信号(δ11.0)，确定了它们的脂肪链末端均为anteiso型。

4.Bacillus licheniformis9912菌剂与活性化合物制剂的制造

应用于权利要求书中的细菌发酵培养基及培养条件无特别的限制，所述发酵液的菌体在实验室镜检菌体生长良好，每ml发酵液菌体细胞达到0.5亿个CFU以上，80%以上形成芽孢，可用以制造微生物制剂，本领域技术人员可以根据共知的技术来选择合适培养基成分，经过离心或板框过滤，得到菌体（芽孢），与可接受载体混合，干燥。

所述Bacillus licheniformis9912杆菌制剂的制造方法为：

（1）发酵培养：克氏瓶种子培养，采用500ml容积克氏瓶，装60ml培养基，121℃灭菌30min，冷却后放斜面，接种Bacillus licheniformis9912，而后将此克氏瓶放在25～28℃保温箱中保温培养48～72h，取出即可作为种子用。克氏瓶种子培养用的培养基为改良淀粉培养基，其组成为：可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，NaCl0.5%，其余为水pH自然。

（2）10L发酵生物反应器发酵，罐装培养基为6L，培养基组成为液体发酵培养基（潘华奇等，2010）：玉米粉:1.733%；麸皮:0.344%；黄豆饼粉:0.1%；磷酸二氢钾:0.05%；碳酸钙:0.072%；其余为水pH6.5、115℃蒸汽灭菌30min，冷却后，接种上述克氏瓶种子二瓶，种子用200ml无菌水洗下后，应用无菌技术接种至10L容积生物反应器中，发酵生产的培养条件为：罐压0.05Mpa，罐温28℃±1℃，通风量为6L/min，搅拌速度为200rpm。在此条件下培养20～48h，即可放罐，此发酵液可用于制造微生物菌剂。

（3）微生物制剂的制造，上述得到的Bacillus licheniformis9912杆菌的发酵液，每ml发酵液菌体细胞达到0.5亿个CFU以上，芽孢形成80%以上，可以制造微生物制剂：将草炭粉121℃灭菌30min，凉干后与发酵液混合拌匀，15～20％左右，含菌细胞数在0.5亿个CFU/ml～10亿个CFU/ml；或压滤离心获得菌体，与可接受载体混合制成1亿～100亿CFU/g固体制剂。

5.1KL～10KL发酵罐发酵培养放大。

为本专业技术人员熟练实施的范围，均在本发明内。

种子培养：克氏瓶种子培养，采用500ml容积克氏瓶，装60ml培养基，121℃灭菌30min，冷却后放斜面，接种Bacillus licheniformis9912，而后将此克氏瓶放在25～28℃保温箱中保温培养48～72h，取出即可作为种子用。克氏瓶种子培养用的培养基为改良淀粉培养基，其组成为：可溶性淀粉2％，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，NaCl0.5%，pH自然。

种子罐发酵培养：选用碳钢通用式100立升搅拌罐，装料70立升，消前ph7.0，120℃30min实消灭菌，冷却后接入茄瓶种子，28～30℃，通气量1：0.5～1.0，160～180r/min机械搅拌，20h种子成熟。按5%～10%接种量转入1吨发酵罐进行发酵。

1KL发酵罐发酵：为碳钢通用式，装料700立升，消前ph7.0，灭菌120℃30min，种子罐在20h左右按5%～10%接种量转入到1吨发酵罐进行发酵，28～30℃，通气量1：0.5～1.0，160～180r/min机械搅拌，20h发酵终点。

生物制剂制造：制造过程主要工艺流程图3所示。

6.Bacillus licheniformis9912发酵液液体制剂（宁康制剂）防治黄瓜灰霉病条件试验

不同剂量试验：试验药剂为Bacillus licheniformis9912液体制剂（宁康制剂：制法如附图3所示，发酵液上清经过浓缩为母液，加入质量分数比为10%乳化剂JP101B及0.5%苯甲酸钠制得），以及对照药剂65％万霉灵可湿性粉剂、40％施佳乐悬浮剂、50％速克灵可湿性粉剂的处理剂量分别为100ml/亩、100g/亩、100g/亩、100g/亩，另设不喷药的空白对照，4次重复。试验地为塑料棚日光加温温室，小区面积60平方米，随机排列，施肥水平、播种密度、移苗时间等农业措施按照当地常规习惯进行。施药4次，间隔7天，喷施稀释药液量每亩40kg。在每次施药后7天进行防治效果调查，最后一次调查在第4次施药后7天进行。调查时每小区取中间2行，调查100个果实，按发病程度分级记载，以病情指数计算防治效果，并应用新复极差法对所得结果进行显著性分析。

试验药剂宁康制剂的处理剂量分别为200ml/亩、150ml/亩、100ml/亩、50ml/亩，另设不喷药的空白对照，4次重复。其他试验设计同上。

不同地区示范试验：试验设置每点宁康制剂示范面积2～6亩，剂量200ml/亩；分别以65%万霉灵可湿性粉剂、40%施佳乐可湿性粉剂、50%速克灵可湿性粉剂2～6亩，剂量100g/亩；以及不喷药的空白对照空白对照0.2亩，施药4次。试验地点：沈阳市苏家屯区共设5个点，分布在城郊乡、八一镇、红菱乡等村镇，在铁岭县设2个点，在横道河子乡横道河子村和新台子乡小北地村及大连市旅顺口区铁山镇铁山村，在每次施药后15天进行防治效果调查，调查时每处理5点取样，每点调查100个果实，分6级记载，以病指计算防效。宁康制剂与化学药剂防治黄瓜灰霉病对比试验，结果如表3所示：

表3 宁康制剂与化学药剂防治黄瓜灰霉病对比试验结果

试验药剂	剂量	防治效果（%）	显著性测定
					（g/hm2）	I II III IV X	0.050.01
宁康制剂	100	84.25 81.15 78.82 91.72 83.99	b B
				65%万霉灵WP	100	94.20 89.98 88.95 89.70 90.71	a A
40％施佳乐SC	100	91.24 97.16 95.22 93.38 94.25	a A
				50%速克灵	100	73.07 74.70 71.78 73.73 73.33	c C
空白对照	（病指）	(9.91)(14.40)(12.43)(9.32)(11.44)	——

宁康制剂与化学药剂对比对黄瓜产量的影响，结果如表4所示：

表4 宁康制剂与化学药剂对比防治黄瓜灰霉病对黄瓜产量的影响

试验药剂	剂量	产量（千克/小区）	显著性测定
					（g/hm2）	I II III IV X	0.050.01
宁康制剂	100	60.10 54.70 56.25 58.00 57.26	a A
				65%万霉灵WP	100	62.45 57.85 55.30 60.15 58.94	a A
40%施佳乐SC	100	59.45 56.15 61.25 60.50 59.34	a A
				50%速克灵	100	45.00 43.65 50.45 42.80 45.48	b B
空白对照	清水	35.55 39.00 41.85 38.75 38.79	c C

从表4可以看出，在保护地栽培中，宁康制剂和其他化学药剂防治黄瓜灰霉病，均可减少灰霉病对黄瓜产量造成的损失。多点试验示范调查结果宁康制剂最高防效90.3%，最低防效63.1%，8个示范点平均防治效果81.7%，对照速克灵的防效为73.1%。多点试验示范结果同小区试验结果基本一致。

7.Bacillus licheniformis9912发酵液液体制剂防治苹果腐烂病

4月初开始，最迟至5底，应用宁康制剂对苹果腐烂病进行防治效果试验。宁康制剂使用浓度100-200倍液，5天喷施一次，连续使用三次。5月份时已是苹果腐烂病发病高峰期，所以在防治前，对试验果树的树体病斑组织进行刮除处理（即对较为严重的病斑组织，用利刃消除，对较轻的病斑组织，用利刃纵割数刀至木质部），涂抹宁康制剂100倍液，以便加强其防治效果。

发病率=发病株数/调查株数×100%

防效=空白对照的发病率-药剂处理的发病率

试验结果表明：宁康制剂100-200倍稀释液对苹果腐烂病较轻的病斑组织有良好的作用效果，被消除的病斑组织病灶停止扩大，有些较小的病斑组织已经开始钙化，树体生长发育正常，树的生长势恢复理想，防效达80%。宁康制剂对苹果腐烂病的发生和蔓延，有抑制作用和治疗作用。

8.Bacillus licheniformis9912发酵液液体制剂防治葡萄毛毡病

对葡萄毛毡病的防治时间为4月下旬，即葡萄刚刚出土，便进行了宁康制剂的喷施工作，用宁康制剂200倍液15天喷施一次，连续使用三次。5月24日防治效果试验，用宁康制剂200倍液对葡萄植株喷施，喷施的重点部位是叶片背面，从叶片开始向下滴药为度。由于此时是毛毡病的发病初期，仅在个别品种的极少数的葡萄叶片上始见初侵染病斑。

发病率=发病株数/调查株数×100%

防效=空白对照的发病率-药剂处理的发病率

试验结果表明：调查发现喷施宁康制剂稀释液的葡萄植株，叶片光亮，而且能保持十天以上，叶片在半月之内没有任何新的毛毡病灶发生，防效达到100%。5月24日喷药后的葡萄叶片完整，颜色深绿，不再感染毛毡病，改变了往年葡萄叶片的残败现象，葡萄植株生长旺盛，果实累累。

9.Bacillus licheniformis9912芽孢制剂防治梨树枯萎病

对梨树枯萎病的防治时间为4月下旬，对明显叶黄的梨树，在其植株周围开约15cm深的环形浅沟，用Bacillus licheniformis9912芽孢制剂500倍液500ml灌根。9月24日防治效果观察。

发病率=发病株数/调查株数×100%

防效=空白对照的发病率-药剂处理的发病率

试验结果表明：调查发现宁康芽孢制剂稀释液灌根的梨树植株，叶片恢复深绿色，无病枯叶，防效达到90%，生长旺盛，果实累累。

Claims (10)

1.一种产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物，其特征在于：所用微生物为分离自辽宁省渤海海域海泥样品的Bacillus licheniformis9912菌株，已于2010年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No.M2010343。

2.一种农药制剂，其特征在于：

所述农药制剂是以培养Bacillus licheniformis9912得到的发酵液或发酵液的上清液为活性成份制备得到的用于防治植物真菌病害的生物农药制剂；

或，所述农药制剂是以Bacillus licheniformis9912或培养Bacilluslicheniformis9912得到的内生芽孢为活性成份制备得到的用于防治植物真菌病害的微生物农药制剂。

3.按照权利要求2所述的农药制剂，其特征在于：

一、所述培养Bacillus licheniformis9912得到发酵液的过程为：

发酵培养基121℃灭菌15～25min，冷却后接种一环新鲜的活化好的Bacillus licheniformis9912，置于27～35℃摇床内，振荡培养24～72h，培养结束取出镜检无杂菌即可作为种子液；

其中，所述发酵培养基的组成为：蔗糖0.5～3%，KH₂PO₄0.1～0.5%,Na₂HPO₄0.5～2%,NH₄NO₃0.1～0.3%,MgSO₄·7H₂O0.01～0.03%,酵母粉0.01～0.03%,CaCl₂0.1～1.5μg/100ml,MnSO₄·H₂O0.5-1.5μg/100ml,初始pH7.0-7.2，余量为水；

将培养好的种子液按体积比3～10%的接种量接种于内装6L灭菌发酵培养基的10L发酵生物反应器中，在罐温27～40℃下，罐压0.03～0.08Mpa，通风量为3～9L/min，通气搅拌发酵24～72h即可放罐，得发酵液；

或所述培养Bacillus licheniformis9912得到发酵液的上清液过程为：

在获得了上述发酵液后，将发酵液用质量浓度1～3%的NaOH溶液调pH至7.5～8.5，然后常温下离心或板框压滤除去菌体及其它固形物，得上清液；

或，二、所述培养Bacillus licheniformis9912得到的内生芽胞的过程为：

（1）发酵培养：克氏瓶种子培养，121℃灭菌15～25min，冷却后放斜面，接种Bacillus licheniformis9912，而后将接种后的克氏瓶放在25～28℃保温箱中保温培养48～72h，取出即可作为种子用；

其中，所述克氏瓶种子培养用的培养基为改良淀粉培养基，其组成为：可溶性淀粉1～3％，牛肉膏0.3～0.8%，酵母膏0.3～0.8%，NaCl0.3～0.8%，pH自然；

（2）10L发酵生物反应器发酵，罐装培养基为6L，115℃蒸汽灭菌30min，冷却后，接种步骤（1）中所述的种子，种子用200ml无菌水洗下后，应用无菌技术接种至10L容积生物反应器中，在此条件下培养20～48h，即可放罐；

其中，发酵生产的培养条件为：罐压0.03～0.08Mpa，罐温28℃±1℃，通风量为4～8L/min；

其中，所述培养基为液体发酵培养基，其组成为：玉米粉1～2%，麸皮0.2～0.5%，黄豆饼粉0.05～0.2%，磷酸二氢钾0.02～0.08%，碳酸钙0.05～0.10%，其余为水，pH6.5；

上述得到的Bacillus licheniformis9912的发酵液，每ml发酵液菌体细胞达到0.5亿个CFU以上，芽孢形成80%以上，可以作为制造微生物液体制剂或制造微生物固体制剂的原料；

所述微生物固体制剂的制造：将草炭粉121℃灭菌15～25min，晾干后将与发酵液混合拌匀，其中草炭粉占总质量比的15～20％，含菌细胞数在0.3亿个CFU/ml～10亿个CFU/ml；或压滤离心获得菌体，与可接受载体混合制成1亿～100亿CFU/g固体制剂。

4.按照权利要求2或3所述的农药制剂，其特征在于：所述生物农药制剂或微生物农药制剂分别包含所述活性组分，以及农药学上可以接受的载体。

5.按照权利要求2或3所述的农药制剂，其特征在于：利用培养如权利要求1所述的Bacillus licheniformis9912得到的内生芽孢为活性成分的发酵菌液，混合可接受的载体制成应用剂型，芽孢含量10⁵～10¹⁰cfu/g。

6.按照权利要求2-5任一项所述的农药制剂，其特征在于：所述生物农药制剂或微生物农药制剂作为用于防治植物真菌病害的农药。

7.按照权利要求6所述的农药制剂，其特征在于：所述的农药制剂用于抑制植物病原菌包括：黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）,苹果干腐病菌(Botryosphaeria berengriana)，苹果轮纹病菌(B.berengriana f.sp.Piricola)，黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum.sp.Cucumerinum)，玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)，玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)，禾谷镰刀菌(F.grammcarum)，小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)，大豆根腐病菌(F.solani)，棉花枯萎病菌(F.oxysporum.sp.Vasinfectum)，棉花黄枯病菌(Verticilliu dahliae)等病原菌中的一种或二种以上。

8.按照权利要求6所述的农药制剂，其特征在于：所述的农药制剂用于抑制植物病包括：黄瓜灰霉病（Botrytis cinerea）,苹果干腐病(Botryosphaeriaberengriana)，苹果轮纹病(B.berengriana f.sp.Piricola)，黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum.sp.Cucumerinum)，玉米纹枯病(Rhizoctonia solani)，玉米小斑病(Bipolaris maydis)，禾谷镰刀(F.grammcarum)，小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)，大豆根腐病(F.solani)，棉花枯萎病(F.oxysporum.sp.Vasinfectum)，棉花黄枯病(Verticilliu dahliae)等植物病中的一种或二种以上，实验表明施用于农作物及果树，可以有效地防止植物真菌病害的发生，且对作物生长无不良影响。

9.一种如权利要求1所述产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物的应用，其特征在于：采用Bacillus licheniformis9912经发酵分离纯化产生三种抗菌活性脂肽化合物中的一种或二种或三种，所述化合物的结构如下所示：

10.按照权利要求9所述产生抗植物病原真菌脂肽生防微生物的应用，其特征在于，制备所述的抗菌活性脂肽化合物的方法包括以下步骤：

（1）培养Bacillus licheniformis9912得到发酵液；

具体为：采用三角瓶装发酵培养基，121℃灭菌15～25min，冷却后分别接种一环新鲜的活化好的抗真菌脂肽产生菌Bacillus licheniformis9912，置于27-35℃摇床内振荡培养，培养结束取出镜检无杂菌即可作为种子液；

其中，所述发酵培养基的组成为：蔗糖0.5～3%，KH₂PO₄0.1～0.5%,Na₂HPO₄0.5～2%,NH₄NO₃0.1～0.3%,MgSO₄·7H₂O0.01～0.03%,酵母粉0.01～0.03%,CaCl₂0.1～1.5μg/100ml,MnSO₄·H₂O0.5-1.5μg/100ml,初始pH7.0-7.2，余量为水；

将培养好的种子液按体积比3～10%的接种量接种于内装6L灭菌发酵培养基的10L发酵生物应器中，在罐温27～35℃下，罐压0.03～0.08Mpa、通风量为4～8L/min，通气搅拌发酵24～72h即可放罐，此发酵液可用于提取粗脂肽；

（2）在获得了上述发酵液后，通过离心或板框压滤除去菌体：于能够产生抗真菌脂肽的Bacillus licheniformis9912菌株发酵培养结束后，将发酵培养液用质量浓度1～3%的NaOH溶液调pH至7.5～8.5，然后常温下离心或板框压滤除去菌体及其它固形物；

用酸沉淀、有机溶剂提取、层析方法从所述发酵液中分离纯化获得下述多种抗真菌环脂肽类化合物；

A.酸沉淀：将上一步骤所得上清液用5～7mol/L盐酸调pH至1～3，于4℃冰箱内放置过夜，次日离心，收集沉淀，并用pH1～3的稀盐酸反复洗涤三次，以除去表面残余上清；

B.甲醇提取：将上一步骤所得沉淀物用甲醇提取，反复提取三次，然后将甲醇提取液在35℃旋转蒸发仪上旋转蒸发除去甲醇，即得到粗脂肽；

C.硅胶色谱柱快速洗脱过程为：将硅胶填充于色谱柱内，然后称取粗脂肽样品上样，依次以0/100,1/99,2/98,5/95,10/90,20/80,30/70,50/50,100/0的甲醇/二氯甲烷洗脱液减压快速洗脱；然后收集各洗脱组分，旋干后称重并检测抗真菌活性，保留具有活性组分；

检测抗真菌活性：分别用滤纸片法检测所得的环脂肽类化合物纯品抗真菌活性：过程为：取环脂肽类化合物纯品滴于无菌滤纸圆片，挥干后贴在中央有病原真菌菌落的沙氏培养基平板边缘，25-30℃恒温培养箱内培养24-72h观测产生抑菌圈以检测环脂肽类化合物的抗真菌活性；

D.应用RP-HPLC制备方法：将经过硅胶快速色谱洗脱后得到的抗真菌活性部分，用甲醇：0.05%TFA水溶液=75：25（v/v）溶解，然后采用YMC ODS-A半制备柱进行制备，色谱条件为：流动相为甲醇：0.05%TFA水溶液=75：25（v/v），流速2～3ml/min，进样量250μl，检测波长210nm；分别收集流出的色谱峰，旋干溶剂后即得到脂肽纯品。