CN108271776B - 芽孢杆菌脂肽类代谢产物用作微生物菌剂助剂的用途 - Google Patents

芽孢杆菌脂肽类代谢产物用作微生物菌剂助剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了芽孢杆菌脂肽类代谢产物用作微生物菌剂助剂的用途，所述芽孢杆菌脂肽类代谢产物用于提高微生物菌剂的润湿性、悬浮性以及在热和紫外条件下的存活率，具有环境相容性好，毒性低，对人畜、天敌安全，生产成本低等优点，具有广阔的应用前景。

Description

芽孢杆菌脂肽类代谢产物用作微生物菌剂助剂的用途
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌脂肽类代谢产物的新用途，尤其是用于微生物菌剂助剂的新用途，本发明还涉及一种微生物菌剂。
背景技术
微生物菌剂是生物农药的一种，主要由微生物或其代谢产物加工而成，具有防治病虫害、除草、杀鼠或调节植物生长等作用。微生物菌剂因具有降低病虫害抗逆性、无化学残留和对环境友好等优点一直备受重视。但是，大多数微生物菌剂在实际应用时的起效速度较慢，效果并不稳定。主要原因是一方面在加工和贮存时容易造成菌体的死亡和活性降低，另一方面是微生物的定殖和增殖易受田间环境的影响，如温度、湿度和紫外线等。所以，微生物菌剂中一般需要加入一些助剂，以起到保护和增效的作用。目前微生物菌剂的剂型加工仍然是以模仿化学农药为主，助剂一般也都是使用人工合成的化学助剂。但是化学物质与微生物的相容性较差，而且化学助剂对生态环境的安全性较差。近些年，人们开始关注微生物自身代谢产物作为助剂，例如有些微生物可代谢产生胞外多糖，这些胞外多糖能够提高微生物的存活率和贮存期，利于微生物在植物周围及植物上的定殖，促进生物膜的形成。但尚未见有关微生物脂肽类代谢产物在制剂中的应用报道。
发明内容
本发明的目的在于提供芽孢杆菌脂肽类代谢产物用作微生物菌剂助剂的用途。本发明的另一目的是提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂的助剂是芽孢杆菌脂肽类代谢产物。
申请人从地衣芽孢杆菌的发酵液中分离得到一种提取物，经TLC和红外图谱鉴定，证明所分离的物质为脂肽，通过向枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌中加入该脂肽，结果表明能显著提高微生物菌剂的润湿性、悬浮性以及在热和紫外条件下的存活率，从而证明该脂肽类物质是一种优良的微生物菌剂的助剂。
一种微生物菌剂，所述微生物菌剂的助剂是芽孢杆菌脂肽类代谢产物。
优选地，所述微生物菌剂是微生物粉剂、可湿性粉剂或悬浮剂。
优选地，所述助剂占微生物菌剂质量的5-15％，当所述助剂占微生物菌剂质量的8％时，综合效果最佳。
本发明的有益效果是：
采用芽孢杆菌脂肽类代谢产物作为微生物菌剂的助剂，能够提高微生物菌剂的润湿性和悬浮率，从而在农业应用时能更高效、更稳定的发挥防效，同时还有利于延长产品的贮存期。
本发明还能提高微生物在高温和紫外线条件下的稳定性，减少菌体在运输、贮存过程中的死亡或活性降低，提高菌体的存活率，从而使菌体更好地在田间定殖、增殖和发挥防效。
芽孢杆菌脂肽类代谢产物用作微生物菌剂的助剂还具有环境相容性好，毒性低，对人畜、天敌安全，生产成本低等优点，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。这些实施例仅是示范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
实施例1芽孢杆菌脂肽类代谢产物的分离与鉴定
1.脂肽的提取
将地衣芽孢杆菌发酵液离心，取上清，用6M HCl调节pH值至4.0，4℃静置4h后离心，取上清，继续调节pH值至2.0，4℃静置4h后离心，取沉淀，将沉淀用少量蒸馏水溶解后，加入1倍体积的乙酸乙酯，充分振荡混匀，离心，取水相，再加入4倍体积的正丁醇，充分振荡混匀，离心，取有机相，50-55℃蒸干，少量蒸馏水溶解后，真空冷冻干燥得到粉末。
2.薄层层析(TLC)鉴定
取冻干的粉末，用少量蒸馏水溶解后进行薄层层析，展开剂为氯仿/乙酸(V:V＝8:2)，显色剂为0.15％的茚三酮丙酮溶液。挥发掉溶剂后将层析板放入盛有浓盐酸的耐高温的密封瓶中，100℃熏蒸1h进行原位酸水解，冷却吹去盐酸后，用显色剂显色斑点呈红色，说明是脂肽。
3.红外图谱鉴定
将冻干的粉末用少量生理盐水溶解，用交联葡聚糖凝胶柱层析Sephadex G-15对脂肽粗提物进一步分离纯化，以10M的磷酸缓冲液进行洗脱，通过HD电脑紫外检测仪检测到的数据，收集第2个洗脱峰。将收集到的洗脱峰于-20℃冰箱中冷冻结冰后再放置于台式冷冻离心机中，真空冷冻(-50℃)干燥浓缩成粉末后备用。
KBr压片法进行红外图谱分析，结果表明样品中含有碳氧键、酰胺键、氨基、甲基等功能键，与脂肽的功能基团和功能键相一致，因此进一步证明所分离的物质为一种脂肽。
实施例2脂肽类代谢产物用作微生物菌剂助剂的应用
1.样品的制备
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原粉20kg、高岭土80kg，配成1000亿活芽孢CFU/克的枯草芽孢杆菌母粉100kg；
多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymycosis)原粉3.6kg、高岭土96.4kg，配成10亿活芽孢CFU/克的多粘类芽孢杆菌母粉100kg；
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)原粉20kg、高岭土80kg，配成10000亿活芽孢CFU/克的枯草芽孢杆菌母粉100kg；
向以上三种母粉中添加实施例1制备的脂肽类代谢产物，使芽孢杆菌脂肽类代谢产物占菌剂总质量的8％，混合均匀，气流粉碎后过60目筛，得到的混粉即为实验样品。
2.润湿时间的测定
按照《农药可湿性粉剂湿润性测定方法GB/T 5451-2001》，取标准硬水100mL，注入置于25℃的恒温水浴中的250mL的烧杯中，待硬水至25℃时，分别称取实验样品5g，置于表面皿上，将全部样品从与烧杯口齐平的位置一次性均匀地倾倒在该烧杯的液面上，加样时立即开始计时直至样品全部润湿为止。记下润湿时间，重复5次，取平均值，即为该样品的润湿时间。
3.悬浮率的测定
按照《农药悬浮率测定方法GB/T 14825-2006》，分别取实验样品1g,置于盛有50mL30℃标准硬水的200mL烧杯中，用手振荡作圆周运动，约120次/min，振荡2min，将该悬浮液在同一温度的水浴中静置13min，再用30℃的标准硬水将其全部洗入250mL量筒中，稀释至刻度后，盖上塞子，以量筒底部为轴心1min内上下颠倒30次。打开塞子，再垂直放入恒温水浴中，静置30min，用吸管小心快速移出225mL悬浮液。按公式1测定有效成分悬浮率ω1(％)。
Figure BDA0001522426000000041
式中：
m1——配制悬浮液所取试样中有效成分质量，单位为克(g)；
m2——留在量筒底部25mL悬浮液中有效成分质量，单位为克(g)；
4.热贮稳定性实验
按照《农药热贮稳定性测定方法GB/T 19136-2003》，分别取20g实验样品放入干净的玻璃瓶中，平铺成平滑均匀层后放置在54℃的恒温培养箱中14d，取出测定各样品的活芽孢数。
5.对芽孢的紫外线保护作用
取实验样品1g，分别用99mL无菌水溶解后，制成芽孢悬浮液，取25mL倒入直径为9cm的无菌培养皿中，不加盖，置于距离紫外灯管12.5cm处照射12h，UV-B(290-320nm)。计算各处理中芽孢的存活率。
表1脂肽对三种实验样品的润湿性影响
Figure BDA0001522426000000042
表2脂肽对三种实验样品的悬浮率影响
Figure BDA0001522426000000051
表3脂肽对三种实验样品的热稳定性影响
Figure BDA0001522426000000052
表4脂肽对三种实验样品的UV保护作用
Figure BDA0001522426000000053

Claims (2)

1.芽孢杆菌脂肽类代谢产物用作微生物菌剂助剂的用途，其特征在于：所述芽孢杆菌脂肽类代谢产物用于提高微生物菌剂的润湿性、悬浮性以及在热和紫外条件下的存活率，所述助剂占微生物菌剂质量的5-15％，
所述芽孢杆菌脂肽类代谢产物是按以下方法制备的：将地衣芽孢杆菌发酵液离心，取上清，用6M HCl调节pH值至4.0，4℃静置4h后离心，取上清，继续调节pH值至2.0，4℃静置4h后离心，取沉淀，将沉淀用少量蒸馏水溶解后，加入1倍体积的乙酸乙酯，充分振荡混匀，离心，取水相，再加入4倍体积的正丁醇，充分振荡混匀，离心，取有机相，50-55℃蒸干，少量蒸馏水溶解后，真空冷冻干燥得到粉末，
所述微生物菌剂是枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的微生物粉剂、可湿性粉剂或悬浮剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述助剂占微生物菌剂质量的8％。
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