CN103125527A - 一种玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以硅藻土为基质的玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂，其组分及含量为：玫瑰黄链霉菌菌株0116繁殖体≥108个；润湿分散剂4％。确定了硅藻土作载体和木质素磺酸钠作润湿分散剂。而且，采用定期检测活菌数测定菌株可湿性粉剂储存稳定性，结果表明菌株可湿性粉剂贮存24个月活菌率＞80％。本发明申请具有开发周期短、成本低、工艺简单且可开发为多种剂型的特点，能够进行规模化生产。由于用玫瑰黄链霉菌菌株0116繁殖体作为可湿性粉剂的主要成分，能够进行规模化生产，而且相较于菌株的发酵液来说大大缩小了田间用量，降低了包装和运输成本。
Description
技术领域：
本发明涉及一种防治植物病害的以硅藻土为基质的玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂可湿性粉剂。
背景技术
目前，植物病害的防治主要以化学农药为主，其长期使用造成对病原菌的选择压力大，易产生抗药性。而且化学农药的高残留、高污染对环境和人、畜的安全造成严重的影响。因此低毒、低残留的生物农药已成为农药研制和生产需求的一大趋势。河北农业大学生防室分别于2005年11月2日和2009年6月9日申请了两个生防制剂的专利，即“一种生物杀菌剂及其制备方法，申请号/专利号：200510117421”和“一种生物杀菌剂可湿性粉剂，申请号/专利号：200910074685.3”。前者组份及含量为：玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)的诱变菌株0116菌株发酵液93---96％；苯乙基酚聚氧乙烯醚3---5％；醋酸钠(CH3COONa).5---1％；醋酸(CH3COOH)0.3---1％；后者组分及含量为：菌株0116繁殖体30---80％；载体40---70％；润湿分散剂2---10％。所述的菌株0116繁殖体为菌株0116的菌丝和孢子；所述的载体为白炭黑、高岭土、硅藻土、滑石粉、碳酸钙中的任何一种；所述润湿分散剂为木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠中的一种或几种的混合物。该生防菌株已委托“中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心”进行保藏，菌株名称：玫瑰黄链霉菌0116，保藏编号：CGMCC N0.1471，保藏日期：2005年9月30日。玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)的诱变菌株0116菌株(以下简称菌株0116)，是一株经玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)诱变得到的菌株，其活菌和发酵液对多种重要植物病原菌有抑制作用，例如黄瓜白粉病病原菌、棉花黄萎病病原菌、马铃薯疮痂病病原菌、小麦根腐病病原菌、番茄灰霉病病原菌等。温室及大田试验均表明，0116菌株发酵液对棉花黄萎病有较好的防治效果。近年来，河北省农作物病虫害生防工程技术研究中心又将该菌株的发酵液应用到对黄瓜白粉病、小麦白粉病的防治上，均表现出良好的防治效果。但上述两个专利申请存在的缺陷是：前一个专利中，将微生物次生代谢产物作为农药或者其先导化合物使用，需要明确该次生代谢产物的准确结构。0116菌株发酵液中起主要作用的是该菌株的次生代谢产物，而对发酵液的组分进行分离、纯化和结构鉴定的成本较大、周期较长，因此还不能进行化学合成，也不能规模化生产。同时由于发酵液的主要成分是水，因此发酵液直接应用于田间的单位用量大，造成包装和运输成本大。前一个专利的缺陷在“一种生物杀菌剂可湿性粉剂”专利中得到了改进，但是后一个专利在具体实施过程中程序较复杂，包括先进行液体种子培养，然后转接到玉米秸秆中进行固体发酵，经过冷冻干燥、收集纯孢子粉，再混合一定的载体及润湿分散剂，最终制成可湿性粉剂。这样整个过程需要的时间长，步骤繁琐，而且冷冻干燥、收集纯孢子粉的过程在规模化生产中工艺复杂，成本较高，尤其是收集纯孢子粉，大批量生产具有较大 难度。所以有必要在后一专利的基础上进一步改进可湿性粉剂的制备过程，使之更适合于规模化生产并降低生产成本。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种操作方便、能够进行规模化生产、且应用于田间的单位用量小，包装和运输成本较小的玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂。
本发明的目的是以如下技术方案实现的：首先进行液体发酵，然后以硅藻土为基质进行固体发酵，干燥后，添加木质素磺酸钠制成玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂可湿性粉剂，其组份及含量为：玫瑰黄链霉菌菌株繁殖体≥108个；润湿分散剂4％。
所述的玫瑰黄链霉菌菌株繁殖体为菌株0116的菌丝和孢子。
所述的载体为硅藻土。
所述润湿分散剂为木质素磺酸钠。
本发明申请具有生产成本低、工艺简单的特点，能够进行规模化生产。研究工作表明，玫瑰黄链霉菌菌株0116的活体对植物病原物的抑制作用十分明显，而且菌株对环境的抗逆能力较强，生长繁殖所需的营养条件较低。活菌制剂开发的关键在于活菌的储存周期要达到1至2年，且选择不影响菌体活性和储存稳定性的载体和助剂。通过平板测定法对各种载体和助剂进行了筛选，最终明确了硅藻土作载体、木质素磺酸钠作润湿分散剂与菌株相容性较好。采用定期检测活菌数的方法，测定了菌株可湿性粉剂储存稳定性，结果发现该菌株可湿性粉剂常温及4℃贮存24个月后活菌率分别在80％、85％以上。 由于用菌株繁殖体作为可湿性粉剂的主要有效成分，故相较于菌株发酵液来说，大大缩小了田间的单位用量，因此降低了包装和运输成本。
为了说明本发明专利申请的实用性，现将本发明专利申请样品的检验、测定方法及数据公开如下：
悬浮率的测定方法
称取适量样品m1，精确至0.0001g。置于盛有50mL(30±1℃)的200mL烧杯中，用手摇荡作圆周运动，约每分钟120次，进行2min，将该悬浮液在同一温度的水浴中放置13min，然后用30±1℃的标准硬水将其全部洗入250mL量筒中，并稀释至刻度，盖上塞子，颠倒混匀。再放入无振动的恒温水浴锅中，放置30min，用吸管在10～15s内将内容物的9/10悬浮液移出，不要摇动或搅起量筒内的沉降物，确保吸管的顶端总在液面下几毫米处。将沉降物全部洗出后冷冻干燥称重m2。
总悬浮率＝10/9x[(m1-m2)/m1]x100％。
称取样品和沉降物各10mg，检测其活菌数n1和n2。
孢子悬浮率＝10/9x[(m1n1-m2n2)/m1n1]x100％。
本发明专利申请样品的总悬浮率＞60％，孢子悬浮率＞90％。
润湿时间的测定方法
取标准硬水100±1ml，注入250ml烧杯中，将此烧杯置于25±1℃的恒温水浴中，使其液面与水浴的水平面平齐。待硬水至25±1℃时用表面皿称取5±0.1g试样，将全部试样从与烧杯口齐平位置一次均匀地倾倒在该烧杯的液面上，但不要过分地扰动液面。加样品时立 即用秒表记时，直至试样全部润湿为止。记下润湿时间。如此重复五次，取其平均值，作为该样品的润湿时间。本发明专利申请样品的湿润时间＜60s。
细度的测定方法
称取20g试样(精确至0.1g)，置于250mL烧杯中，加入约80mL自来水，用玻璃棒搅动，使其完全润湿。将试验筛浸入水中，使金属丝布完全润湿。用自来水将烧杯中润湿的试样稀释至约150mL，搅拌均匀，然后全部倒入润湿的标准筛中，用自来水洗涤烧杯，洗涤水也倒入筛中，直至烧杯中粗颗粒完全移至筛中为止。用直径为9～10mm的橡皮管导出的平缓自来水流冲洗筛上试样，水流速度控制4～5L/min，橡皮管末端出水口保持与筛缘平齐为度。在筛洗过程中，保持水流对准筛上的试样，使其充分洗涤，一直洗到通过试验筛的水清亮透明为止。再将试验筛移至盛有自来水的盆中，上下移动洗涤筛缘始终保持在水面之上，重复至2min内无物料过筛为止。弃去过筛物，将筛中残余物，先冲至一角再转移至已恒重的100mL烧杯中。静置，待烧杯中颗粒沉降至底部后，倾去大部分水，加热，将残余物蒸发近干，于100℃烘箱中烘至恒重，取出烧杯置于干燥器中冷却至室温，称重。本发明专利申请样品的细度＞99.7％通过74μm筛。
X(％)＝(m1-m2)×100/m1
式中：m1-试样的质量；m2-玻璃皿(或烧杯)中残余物的质量。
贮存稳定性试验
采用定期涂平板测定cfu值的方法，本发明专利申请样品在24 个月内单位含孢量均稳定在107/g以上。
在活体条件下测定了0116活菌可湿性粉剂对大田温室黄瓜白粉病的防治效果，具体方法和结果如下：
1试验方法：
将制得的玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂可湿性粉剂分别稀释至200×、400×、600×和800×；每个处理重复4次，每小区4点取样，每点查2株，每株调查全部叶片，每片叶病斑占叶面积的百分率分级纪录。
分级标准：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占整个叶面积5％以下；
3级：病斑面积占整个叶面积6％-10％；
5级：病斑面积占整个叶面积11％-20％；
7级：病斑面积占整个叶面积21％-40％；
9级：病斑面积占整个叶面积40％以上。
2.试验结果：
玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂可湿性粉剂对黄瓜白粉病有较好的防治效果，试验结果见下表。
玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂可湿性粉剂对黄瓜白粉病的防治效果
具体实施方式
步骤一：将0116菌株于PDA培养基上28℃培养4-5天后，以1％的比例接种到种子培养基中。培养条件为：28℃/200r，培养3天。
种子培养基为：3％花生饼粉，4.5％淀粉，1.5％葡萄糖，0.75％氯化钠，0.3％醇母膏，0.9％硫酸铵，0.03％磷酸二氢钾，0.375％碳酸钙，0.105％硫酸亚铁，0.105％硫酸锌，3％蔗糖，0.3％果糖，pH自然；
步骤二：将种子培养液与硅藻土以1.5∶1的比例混匀，放于18×24cm的磁盘中28℃固体发酵三天，每天翻盘一次，三天后干燥；
步骤三：将上述固体发酵产物于鼓风干燥箱中进行干燥，条件为：35℃，72～120h。
步骤四：将干燥后的发酵产物中加入4％木质素磺酸钠，充分混匀后过AO型气流粉碎机进行混匀，粉碎，即可得到0116活菌可湿性粉剂。
Claims (4)
1.一种玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂，其特征在于，其组分及含量为：菌株0116繁殖体≥108个；润湿分散剂4％。
2.根据权利要求1所述的一种玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂，其特征在于，菌株0116繁殖体为菌株0116的菌丝和孢子。
3.根据权利要求1所述的一种玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂，其特征在于，所述的载体为硅藻土。
4.根据权利要求1所述的一种玫瑰黄链霉菌生物杀菌剂的可湿性粉剂，其特征在于，所述润湿分散剂为木质素磺酸钠。
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