CN105557347B - 辣椒灰霉病抗病性鉴定的苗期接种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种辣椒灰霉病苗期接种鉴定方法，属于植物保护技术领域。技术要点为：培养灰霉病菌（Botrytis cinerea），收集病菌孢子，配制成106/mL的灰霉菌孢子悬浮液，辣椒种子播种在灭菌的土壤中，置于20℃~25℃温室大棚内，待生长至四叶期后，在苗心生长点上滴加孢子液接种，小棚密闭保湿，21d后进行灰霉病调查。本发明的技术特点是：苗期鉴定，操作简便，高效快速，鉴定结果准确可靠。主要用于快速筛选辣椒资源品种中抗病性种质和品种的抗病性鉴定，为抗病新品种选育和抗病品种合理布局服务。
Description
技术领域
本发明涉及植物保护技术领域，具体是一种辣椒灰霉病的苗期接种鉴定方法，尤其是对辣椒抗灰霉病资源材料的筛选方法。
背景技术
近年来，随着农村产业结构调整，我国辣椒大棚栽培发展迅速。由于冬春季大棚内温度低、湿度大、结露持续时间长，非常适合辣椒灰霉病的发生。因此，该病已成为我国大棚辣椒生产中最主要病害之一，病害损失轻则减产15%～20%，重则减产30%以上。但是到目前为止，针对辣椒灰霉病的研究较少，对辣椒灰霉病抗性鉴定及其抗性遗传机制的研究进展更为缓慢，而这些研究的开展都需要一套科学的接种鉴定方法为基础。
国内外对灰霉病的防治主要以控制温、湿度，培育壮苗为主，配合喷药保护，防止病害蔓延。而实际上若遭遇连续阴雨天气，以我国现有的栽培条件，难以做到对大棚温、湿度的理想控制。若主要依赖化学药剂来控制病情，则一方面长期农药使用会导致抗药性菌株产生，以致防治效果逐年下降；另一方面，大量使用农药会对环境造成不良影响，也会带来食品安全的威胁。想要克服此类不利因素，最为直接且经济有效的措施就是选育和种植抗灰霉病的新品种。而大量筛选获得的抗源材料为育成具有抗病性的新品种提供了抗病亲本，是新品种选育工作的基础。
目前，有关灰霉病的抗性鉴定方法报道的仅有番茄、非洲菊和草莓这几种作物，辣椒尚属空白。前几种作物由灰霉病发生所带来的经济损失主要集中在花期和挂果期，故其鉴定方法或是通过离体接种，或是在挂果期直接进行田间调查统计来确定其抗感水平。辣椒灰霉病在苗期和成株期均能引起危害，而苗期灰霉病往往引起整株死亡，甚至成片死亡，造成更为严重的后果。离体接种方法虽然简单，但由于苗期辣椒植株幼嫩，灰霉菌虽属于兼性寄生菌，但其腐生能力极强，离体接种结果往往无法正确区分出抗感水平，也无法反映辣椒对灰霉菌活体侵染的抗性情况。因此，针对辣椒灰霉病的抗性鉴定需要建立一套快速简便、鉴定结果准确的活体接种鉴定方法。
发明内容
本发明的目的在于针对目前辣椒灰霉病抗病育种上没有一套抗性鉴定方法这一现状，提供一套简易、高效、鉴定结果准确的人工接种鉴定辣椒抗灰霉病能力的方法，为辣椒抗性种质的筛选鉴定提供技术支撑。
本发明“辣椒灰霉病抗病性鉴定的苗期接种方法”包括以下步骤。
1、接种体制备：保存于4℃条件下的辣椒灰霉病菌菌株（Botrytis cinerea）接种在平板PDA培养基上活化，取新鲜菌丝块接入新的平板PDA培养基上，20℃下黑暗培养14 d，收集灰霉菌孢子并配成106 /mL的孢子悬浮液待用。
2、培育接种用辣椒苗：育苗盘（穴深6cm，单穴口径6cm，单穴底径3cm）表面消毒，装入已灭菌的混合基质，播种鉴定材料，5粒每穴，每份材料种植30穴以上，置于20℃~25℃温室大棚内土层上生长，常规管理。待长出子叶后，间苗，每穴保留3株，生长至四叶期，进行接种鉴定。
3、接种方法：将孢子液滴加在苗心生长点上，接种菌液量30µL/株。接种前将水浇透，接种后在育苗盘上支起小棚密闭，每日于小棚四周浇水，以保持湿度。
4、调查方法：调查记录接种日期、病害症状始现期。21d后，调查各鉴定材料的病株数，计算发病株率。按以下标准进行抗性水平分类。
| 等级 | 抗病性 | 发病率（%） |
| 1 | 高抗（HR） | ≤1.0 |
| 2 | 抗病（R） | 1.1-10.0 |
| 3 | 中抗（MR） | 10.1-30.0 |
| 4 | 中感（MS） | 30.1-50.0 |
| 5 | 感病（S） | 50.1-70.0 |
| 6 | 高感（HS） | ＞70.0 |
本发明的技术优势与性能特点如下。
（1）首次在我国建立了辣椒灰霉病抗性鉴定方法。
（2）本发明的接种方法操作简便，鉴定结果准确可靠，病情判别灵敏度高，可显著区分不同品种对灰霉病的抗感差异。
（3）运用生长点滴加灰霉菌孢子液的接种方法，接种部位和接种量一致、接种后发病均匀、结果稳定性好，可操作性强。
（4）采用小棚密闭、棚外浇水的保湿方法，符合自然生产过程中大棚内的发病条件，因此鉴定结果更接近于田间自然感病结果。
（5）适合同时对大批量材料进行抗灰霉病鉴定和筛选，有利于提高抗病材料的筛选效率。
具体实施方式
实例一。
以11个辣椒品种材料为研究对象，采用生长点接种法鉴定其对辣椒灰霉病的抗性。
1、接种体制备。
辣椒灰霉病菌菌株（Botrytis cinerea）是由江西省南昌辣椒种植大棚采集到的具有典型灰色霉层的灰霉病病苗上分离纯化得到。其纯化过程为：从采集的病苗上用灭菌的接种针挑取少量霉层（分生孢子及分生孢子梗）接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板（培养皿）中，于20℃培养2d，从菌落边缘挑取灰霉菌菌丝接入新的PDA培养基平板上，2d后再次将菌落边缘的菌丝转接，如此反复，直至培养基中长出的菌丝不含其它杂菌为止。将纯化后的灰霉菌菌丝接种至装有PDA培养基的无菌试管中，20℃培养至产生菌核后，保存于4℃条件下。使用前由保存试管中挑取菌核或菌丝块移至装有PDA培养基的无菌培养皿中央进行活化（20℃，3-5 d），于菌落边缘用打孔器取新鲜菌丝块接入新PDA培养基上，20℃下黑暗培养14d后，用少量无菌水将灰霉菌分生孢子洗下，配成106 /mL的孢子悬浮液待用。PDA培养基的配方为：200g土豆、20g蔗糖和15g琼脂粉，蒸馏水1L。
2、供试辣椒品种材料准备。
用0.5%的高锰酸钾浸泡育苗盘进行表面消毒。装入已灭菌的混合基质，播种鉴定材料，5粒每穴，每份材料种植32穴，置于20℃~25℃温室大棚内土层上生长，常规管理。待长出子叶后，间苗，每穴保留3株。待幼苗生长至四叶期（四叶一心），进行接种鉴定。
3、接种方法。
使用移液器将孢子液滴加在辣椒苗心的生长点上，使孢子液液滴悬挂于苗心，滴加菌液量30µL/株。接种前将育苗盘用水浇透，接种后在育苗盘上支起塑料膜小棚密闭，于小棚四周浇水，以保持湿度。
4、调查方法。
处理后的辣椒苗在接种14d左右开始出现症状，以后每隔2d观察1次，21d统计发病率（产生明显的灰色霉层）。按以下标准进行抗性水平分类。
| 等级 | 抗病性 | 发病率（%） |
| 1 | 高抗（HR） | ≤1.0 |
| 2 | 抗病（R） | 1.1-10.0 |
| 3 | 中抗（MR） | 10.1-30.0 |
| 4 | 中感（MS） | 30.1-50.0 |
| 5 | 感病（S） | 50.1-70.0 |
| 6 | 高感（HS） | ＞70.0 |
本实例结果如下表所示，在鉴定的11份材料中，2份材料发病率小于10%，属于抗病材料；7份材料发病率在10-30%之间，属于中抗材料；剩下两份材料的发病率都较高，其中1份属于中感材料，1份属于高感材料。该实例的鉴定结果与这些材料的田间实际发病情况一致，表明此套辣椒苗期灰霉病抗性接种鉴定法是一种环境条件可控、接种效率高、结果准确和反应灵敏的方法，可广泛用于辣椒种质资源筛选和品种抗病性鉴定。
| 材料 | 发病率（%） | 抗性评价 |
| 蛆椒 | 4.08 | R |
| 中101 | 21.88 | MR |
| 中102 | 14.89 | MR |
| 中98 | 13.33 | MR |
| 中97 | 14.71 | MR |
| 中96 | 22.92 | MR |
| 中91 | 10.87 | MR |
| 中92 | 14.89 | MR |
| B9431 | 42.55 | MS |
| V06C1720 | 72.92 | HS |
| V06C1825 | 6.12 | R |
Claims (3)
1.一种辣椒灰霉病抗病性鉴定的苗期接种方法，首先活化并培养灰霉病菌，配制分生孢子悬浮液；然后在灭菌基质中播种，培育接种用辣椒苗，滴加孢子悬浮液进行接种，辣椒苗的接种部位为苗心生长点，并使孢子悬浮液液滴悬挂于苗心；密闭保湿，21d后调查各鉴定材料的发病率，按以下标准进行抗性水平分类:
其中，活化并培养灰霉病菌，配制分生孢子悬浮液的具体过程为：
从采集的病苗上用灭菌的接种针挑取少量霉层接种于PDA培养基平板中，于20℃培养2d，从菌落边缘挑取灰霉菌菌丝接入新的PDA培养基平板上，2d后再次将菌落边缘的菌丝转接，如此反复，直至培养基中长出的菌丝不含其它杂菌为止；将纯化后的灰霉菌菌丝接种至装有PDA培养基的无菌试管中，20℃培养至产生菌核后，保存于4℃条件下；使用前由保存试管中挑取菌核或菌丝块移至装有PDA培养基的无菌培养皿中央于20℃进行活化3-5d，于菌落边缘用打孔器取新鲜菌丝块接入新PDA培养基上，20℃下黑暗培养14d后，用少量无菌水将灰霉菌分生孢子洗下，配成106/mL的孢子悬浮液待用；PDA培养基的配方为：200g土豆、20g蔗糖和15g琼脂粉，蒸馏水1L；其中，孢子悬浮液的接种量为30μL每株苗，辣椒苗的接种时期为四叶期。
2.根据权利要求1中所述的辣椒灰霉病抗病性鉴定的苗期接种方法，其特征在于，辣椒苗的生长温度及接种后放置的温室温度为20℃-25℃。
3.根据权利要求1中所述的辣椒灰霉病抗病性鉴定的苗期接种方法，其特征在于，接种后在育苗盘上支起塑料膜小棚密闭，于小棚四周浇水，以保持湿度。
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