CN101712941B - 一种多粘类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治植物青枯病的多粘类芽孢杆菌菌株，经鉴定命名为多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZJU0901，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2009年7月19日，保藏号为CCTCC M209157。本发明菌株可在离体条件下对青枯菌不同生化型菌株的生长产生抑制作用，可有效防治植物青枯病。

Description

一种多粘类芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种类芽孢杆菌，尤其涉及一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)及其应用。

背景技术

作物细菌性青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)(俗称青枯菌)引起的一种系统侵染的毁灭性土传病害，俗称“植物瘟病”。发病作物茎叶萎蔫下垂至全株枯死，一般田块的发病率为10％-15％，重病田的发病率高达80％-99％，导致作物产量的严重下降，甚至绝收。病原的寄主范围广泛，可侵染44个科的数百种植物，包括蕃茄、茄子、烟草、花生、马铃薯、香蕉等。

虽然不同植物在不同环境条件下的症状和危害程度表现若干差异，但共同特点是细菌从植株根部侵入，通过增殖和一系列生化活动损坏寄主维管束输导组织，导致植株失水枯萎，死亡。迄今为止，通过采用抗青枯的作物品种去防治青枯病的做法是很少的，因为已出现的品种不仅抗性低而且抗性容易丧失，其他的农业防治手段因受地域条件的限制，也难以大面积推广。化学防治上，虽然有农用链霉素、铜制剂等药物的出现，但均不是针对青枯病的防治农药，而且防效差，不稳定，病原菌极易产生抗药性，因此市场上尚无防治植物青枯病的有效药剂。

目前世界上普遍认为生物防治是解决土传病害最有希望的途径之一。所以，本领域技术人员迫切需要能够有效防治植物青枯病的新的微生物制剂和方法的出现。

发明内容

本发明提供了一种防治植物青枯病的多粘类芽孢杆菌，该菌株可在离体条件下对青枯菌不同生化型菌株的生长产生抑制作用。

一种防治植物青枯病的多粘类芽孢杆菌菌株，经鉴定命名为多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZJU0901，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2009年7月19日，保藏号为CCTCC NO：M 209157。

其主要形态及生物学特征如下：细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，以周生鞭毛运动。在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，在营养琼脂上无可溶性色素。兼性厌氧。在培养基上的菌落薄，呈星状扩展，菌量多而粘，表面无光泽。生长物会粘连到培养基上。生长最适温度28-30℃，生长温度范围为15-50℃。生长最适pH为7.0，生长pH范围为5.6-8.5。

本发明还提供了一种含有上述多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，制备该菌悬液可以选用任意细菌培养基，优选采用NB培养基，其有效菌(多粘类芽胞杆菌ZJU0901)含量优选为10⁷～10⁸CFU/ml，可以直接应用于防治植物青枯病。

本发明提供了一种无菌滤液，通过如下方法制备：

取含多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，离心后取上清液，上清液经微孔滤膜过滤即为无菌滤液。

本发明提供了一种抗菌蛋白粗提液，通过如下方法制备：

取含多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，离心后取上清液，上清液经微孔滤膜过滤得到无菌滤液，将乙醇加入无菌滤液中进行沉淀，将沉淀溶于缓冲溶液中即得抗菌蛋白粗提液。

优选地，所述无水乙醇与菌悬液体积比为1∶1，具有最大的抑菌活性。

优选地，所述缓冲溶液优选为Tris缓冲液，当然也可以选择其它缓冲溶液，只要不会使抗菌蛋白变性即可，pH在6.0～8.0之间。

本发明还提供了多粘类芽胞杆菌ZJU0901在防治植物青枯病中的应用。

优选地，所述的植物为蕃茄、茄子、烟草、花生、马铃薯或香蕉。因为这些植物的青枯病大多由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的。所述的植物最好是番茄。

本发明菌株可在离体条件下对青枯菌不同生化型菌株的生长产生抑制作用，可有效防治植物青枯病。

附图说明

图1为本发明菌株不同处理下番茄青枯病的病害发生情况；

图2为本发明菌株不同处理下番茄青枯病的病情严重度；

图3为本发明菌株不同处理下土壤中青枯病菌含量的变化情况。

具体实施方式

从浙江省杭州市一块青枯病严重发生的黄瓜地里采集黄瓜根际周围0-20cm的表层土壤，装入无菌聚乙烯塑料袋中，封口。称取土壤10g，加入装有90ml无菌水的三角瓶中制得悬液，180r/min震荡30min，然后从所得悬液中吸取5ml加入有45ml无菌水的三角瓶中，依次梯度稀释到第5个三角瓶为止，得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的稀释液。

分别取100μl 10^-4和10^-5的稀释液涂布于营养琼脂培养基(即NA培养基，含：牛肉浸膏1g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，蔗糖10g，琼脂20g，水1000ml)中，每个稀释度重复3次，置于30℃恒温培养箱中培养48h后，挑取培养特征相异的单个菌落，经培养纯化后作为供试菌株。

将各型青枯病菌(见表1)接种到28℃营养琼脂液体培养基(即NB培养基，含：牛肉浸膏1g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，蔗糖10g，水1000ml)中，180r/min培养48h，将已灭菌融化后的NA培养基冷却到45℃左右倒入其中，摇匀后倒平板，4h后接入供试菌，平板在室温下培养48h，观察抑菌圈的大小。

挑选抑菌圈均大于10mm的供试菌，转接至NA培养基试管斜面上，连续接种，传代5次，挑取仍对青枯病菌有较强拮抗效力的菌株进行田间小区筛选实验。具体如下：

将番茄种子播种于花盆中，每盆10粒。植株出土后，用浓度为10⁸CFU/ml的供试菌菌悬液按每株2ml淋1次，待番茄长至约15cm高时，用浸根法接种青枯菌T91(浓度为10⁸CFU/ml)，于接种病原菌后第20d调查发病情况，选择对青枯病防效最好的一株菌株保存于NA斜面上。

表1来自不同寄主、不同生化型的的青枯菌(Ralstonia solanacearum)菌株

注：^a表示不同于所有已知的青枯菌生物型

实施例2菌株鉴定

上述分离得到的菌株主要形态及生物学特征如下：细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，以周生鞭毛运动。在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，在营养琼脂上无可溶性色素。兼性厌氧。在培养基上的菌落薄，呈星状扩展，菌量多而粘，表面无光泽。生长物会粘连到培养基上。生长最适温度28-30℃，生长温度范围为15-50℃。生长最适pH为7.0，生长pH范围5.6-8.5。

该菌株经FAME脂肪酸分析鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZJU0901。

实施例3菌株ZJU0901对青枯菌的拮抗活性

本实施例仍以实施例1中8株青枯菌为指示菌株。将指示菌株的菌悬液1ml加入到15ml已灭菌融化后冷却到45℃左右的的NA培养基中，摇匀后将该培养基倒入已灭菌的培养皿上。用灭过菌的牙签挑取多粘类芽孢杆菌ZJU0901的单菌落，在带有指示菌的培养基上进行点接，培养条件为30℃，48h，根据抑菌圈直径大小测定其拮抗能力。拮抗结果如下(表2)：

表2多粘类芽孢杆菌ZJU0901对来自不同寄主的青枯菌菌株的拮抗活性

上述结果表明：多粘类芽孢杆菌ZJU0901除了对从辣椒上的分离的II型青枯菌P75没有任何抑菌效果外，对其他不同寄主、不同生化型的指示病原菌具有明显的拮抗活性，最大抑菌圈直径达18.20mm(一般生防菌拮抗病原菌的抑菌圈≥10mm即可称为有较强抑菌能力)，因此该多粘类芽孢杆菌具有成为高效生防菌的巨大潜力。

实施例4多粘类芽孢杆菌ZJU0901不同处理的抑菌活性测定

通过牛津杯法分别测定多粘类芽孢杆菌ZJU0901的菌悬液、无菌滤液、蛋白酶K处理后的滤液以及高温热处理后的滤液的抑菌活性，每个处理设3个重复，各处理具体方法如下：

(1)菌悬液制备：挑取多粘类芽孢杆菌ZJU0901的单菌落，接种于NB液体培养基中，30℃，170r/min振荡培养24h；

(2)无菌滤液制备：菌悬液10000r/min离心20min，取上清液，用0.22μm微孔滤膜除菌得抑菌物质粗提液；

(3)蛋白酶K处理：取1ml无菌滤液，分装在1.5ml离心管中，向管内加入蛋白酶K使终浓度达到100μg/ml，37℃水浴1h；

(4)高温热处理：取1ml无菌滤液，分装在1.5ml离心管中，121℃(高压锅内进行)处理20min；

(5)各处理准备完毕之后，按实施例1的方法准备含有指示菌株的培养基。待培养基在培养皿里凝固之后，在每个皿上轻轻地垂直放置4个牛津杯。

(6)每个牛津杯中分别加入200μl菌悬液、无菌滤液、蛋白酶K处理滤液和高温热处理滤液。

(7)在30℃条件下，培养48h，观察抑菌圈有无及大小。

不同处理的拮抗物质拮抗效果如下(表3)：

表3不同处理多粘类芽孢杆菌ZJU0901菌液对各青枯菌菌株的拮抗活性

注：表中小写表示P＜0.05水平上的显著性差异分析，数据为Mean±SE，下同。

上述结果表明：菌悬液和无菌滤液的抑菌效果都非常显著，显示多粘类芽孢杆菌ZJU0901的抑菌物质主要是菌体的分泌物，而非菌体内部的物质；蛋白酶K处理后的无菌滤液对各指示菌也具有明显的抑菌效果，这表明蛋白酶K基本上不能分解抑菌物质，即非蛋白酶K所能分解的蛋白；而经高温热处理之后的无菌滤液的抑菌活性明显降低，这表明该抑菌物质不能耐高温，在高温条件下易失活。

实施例5多粘类芽孢杆菌ZJU0901抗菌蛋白的提取

蛋白质提取采用低温乙醇沉淀法：无水乙醇置于冰箱内进行预冷处理。在多粘类芽孢杆菌ZJU0901无菌滤液中缓慢加入乙醇使其在溶液中的终浓度分别达到40％、50％、60％、70％、80％，此反应在冰浴中进行。于4℃静置过夜，10000r/min，4℃下离心20min，将沉淀溶于20mmol/l Tris缓冲液(pH6.8)中，所得溶液即为多粘类芽孢杆菌ZJU0901蛋白粗提液。；按实施例3的方法准备含有指示菌株的培养基，待培养基在培养皿里凝固之后，在每个皿上轻轻地垂直放置4个牛津杯。每个牛津杯中分别加入200μl待测蛋白粗提液，48h后观察抑菌圈有无及大小，以此测定不同浓度沉淀出来的蛋白的抑菌活性(只以T91号病原菌作为指示菌)。结果显示，当无菌滤液∶乙醇＝1∶1，即乙醇浓度为50％时，提取的蛋白具有最大的抑菌活性(抑菌圈大小为16.43mm)。

实施例6降低番茄青枯病发生及病菌种群数量

用营养土和沙子1∶2的比例伴土，装盆。盆子直径为12cm，高为10cm。将已发芽的番茄种子放入盆子，每盆1粒。将菌悬液、无菌滤液、抗菌蛋白粗提液作为种子处理剂浇灌在种子表面：

处理1：在种子表面上浇灌1ml多粘类芽孢杆菌ZJU0901的菌悬液(10⁸CFU/ml)；

处理2：在种子表面上浇灌1ml多粘类芽孢杆菌ZJU0901的无菌滤液；

处理3：在种子表面上浇灌1ml多粘类芽孢杆菌ZJU0901的抗菌蛋白粗提液；

处理4：在种子表面上浇灌1ml无菌水，作发病对照；

处理5：在种子表面上浇灌1ml无菌水，作空白对照。

每个处理设8个重复。定期浇水。6周以后，用10⁸CFU/ml青枯菌T91菌悬液在处理1至处理4的番茄苗上伤根接种，各处理接种5ml，处理5用5ml无菌水伤根接种作为空白对照。番茄苗发病后统计番茄的病害发生率与病情严重度。病情严重度分级标准如下：

0级：无症状，植株健康；

1级：1％-15％的叶片萎蔫；

2级：16％-30％的叶片萎蔫；

3级：31％-60％的叶片萎蔫；

4级：61％以上的叶片萎蔫，但植株还没死亡或全株枯萎；

5级：植株萎蔫或死亡。

病害平均严重度＝(∑各级的植株数×级数)/总调查的植株数，同时为了更好的评估多粘类芽孢杆菌ZJU0901对土壤中青枯菌种群数量的影响，即其对番茄青枯病菌的抑制效果，对不同处理土壤中青枯病菌的含量进行了测定。方法如下：

从每组处理的重复中各称取1g土壤均匀混合成8g，从中称取1g作为样品加入10ml蒸馏水，进行30min的摇床处理。土壤样品悬浮液进行梯度稀释后，取0.1ml加入TZC半选择性培养基(蛋白胨10.0g；水解酪蛋白1.0g；葡萄糖5.0g；TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)0.05g；水1000ml；pH7.0-7.2)上进行涂布培养。28℃，3d后计数。

如图1所示，经多粘类芽孢杆菌ZJU0901菌悬液处理后的番茄植株，其病害发生率最低，而经无菌滤液和抗菌蛋白粗提液处理后，番茄植株的病害发生率也有不同程度的降低，但与对照不显著。由此可见，多粘类芽孢杆菌ZJU0901菌悬液处理能使番茄植株青枯病的发生率得到有效控制。

如图2所示，经ZJU0901菌悬液处理后的青枯病病情严重度最低，与其它处理间存在显著性差异，而经无菌滤液和抗菌蛋白粗提液处理后，番茄青枯病的病情严重度也显著低于发病对照，由此可以看出，多粘类芽孢杆菌ZJU0901不同处理下，番茄青枯病的病情严重度明显降低。

如图3所示，经多粘类芽孢杆菌ZJU0901菌悬液以及无菌滤液处理后，土壤中青枯菌含量明显低于发病对照，而经抗菌蛋白粗提液处理后，土壤中青枯菌含量没有明显的降低。

由此可见，多粘类芽孢杆菌ZJU0901的菌悬液和无菌滤液能有效抑制土壤中青枯病菌的生长，从而印证了其能有效控制番茄青枯病的发生。

总结：从青枯病发生的病情严重度、病害发生率及青枯菌在土壤中含量的变化这三方面可以看出，经多粘类芽孢杆菌ZJU0901菌悬液、无菌滤液和抗菌蛋白粗提液处理之后，能不同程度地控制番茄青枯病的发生，尤其是ZJU0901菌悬液处理的防治效果非常明显。

实施例7多粘类芽孢杆菌ZJU0901增加感病番茄植株的生物量

在实施例6的基础上，待记录完番茄苗的病害发生率与病情严重度后，带根收获番茄苗。带回室内将根上的土壤洗净，吸干，分别称其根和茎的鲜重。将同一株番茄苗的根茎装入信封，放置于烘箱内，60℃烘干3d后，分别称根茎的干重。实验结果如下(表4)：

表4多粘类芽孢杆菌ZJU0901对接种青枯菌后番茄植株生物量的影响

实验结果显示：与发病对照相比，经ZJU0901菌悬液处理之后，番茄植株的鲜重和干重根茎比值有明显提高。鲜重时，发病对照的根茎比为0.11，而经ZJU0901菌悬液处理之后的根茎比提高至0.14；干重时，发病对照的根茎比为0.09，而经ZJU0901菌悬液处理之后的根茎比提高至0.12。由此可以看出，多粘类芽孢杆菌ZJU0901能增加感病番茄植株的生物量。

实施例8多粘类芽孢杆菌ZJU0901对青枯病防效的田间小区实验

番茄种子用10⁸CFU/ml浓度的ZJU0901菌悬液处理2小时后在温室育苗，操作方法参考实施例6。大约1个月后，移栽番茄苗在浙江温州青枯病高发地块栽培，在移栽时每穴加100ml ZJU0901菌悬液(10⁷CFU/ml)，对照处理加100ml无菌水，每处理50棵番茄苗，肥水管理同正常年份，同时不使用任何化学农药处理。2个月后，调查并计算ZJU0901菌悬液的防效。

实验结果显示，对照处理的青枯病病害发生率和病害严重度分别为76.0％和2.56级，而ZJU0901菌悬液处理的青枯病病害发生率和病害严重度分别为32.0％和1.04级，由此可见，ZJU0901菌悬液对番茄青枯病发生率和病害严重度的防治效果分别达到57.8％和59.3％以上。

Claims (9)

1.一种多粘类芽胞杆菌菌株，其特征在于：命名为多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)ZJU0901，保藏号为CCTCC NO：M 209157。

2.一种含有权利要求1所述的多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液。

3.根据权利要求2所述的菌悬液，其特征在于：所述的菌悬液中多粘类芽胞杆菌ZJU0901含量为10⁷～10⁸CFU/ml。

4.根据权利要求2所述的菌悬液，其特征在于：制备菌悬液所用的培养基为NB培养基，所述的NB培养基含：牛肉浸膏1g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，蔗糖10g，水1000ml。

5.一种无菌滤液，其特征在于，通过如下方法制备：

取用经细菌培养基培养的含多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，离心后取上清液，上清液经微孔滤膜过滤即为无菌滤液。

6.一种抗菌蛋白粗提液，其特征在于，通过如下方法制备：

取用经细菌培养基培养的含多粘类芽胞杆菌ZJU0901的菌悬液，离心后取上清液，上清液经微孔滤膜过滤得到无菌滤液，将无水乙醇加入无菌滤液中进行沉淀，将沉淀溶于pH在6.0～8.0之间的Tris缓冲液中即得抗菌蛋白粗提液。

7.根据权利要求6所述的抗菌蛋白粗提液，其特征在于：所述无水乙醇与无菌滤液体积比为1∶1。

8.权利要求1所述的多粘类芽胞杆菌ZJU0901在防治植物青枯病中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的植物为蕃茄、茄子、烟草、花生、马铃薯或香蕉。

Images