CN1570078A - 青枯病生防菌anti－8098a及其培养基、培养方法和生防应用 - Google Patents
青枯病生防菌anti－8098a及其培养基、培养方法和生防应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种微生物—青枯病生防菌ANTI－8098A及其培养基、培养方法和生防应用，具体提供青枯病生防菌菌株，该菌株为ANTI－8098A，于2001年12月11日保藏于“德国微生物保存中心(DSMZ)”，其保藏号为DSM ID 01－1000，其微生物分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；提供该青枯病生防菌的采集、筛选方法、发酵生产方法及其培养基；提供含有该青枯病生防菌、或含有其发酵液的上清液、或含有其代谢产物的生物农药和生物杀菌剂。该青枯病生防菌或由其制作的生物农药、生物杀菌剂对各种植物青枯病菌的田间防治实验的防治效果达80％以上，且经处理的果实的品质、产量提高了。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物及其筛选、培养方法、培养基，特别涉及一种青枯病生防菌及其培养基、培养方法和生防应用。
背景技术
细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一类毁灭性土传病害，此病菌可危害44个科300多种植物，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，该病害危害较重分布较广的寄主主要有马铃薯、番茄、烟草、茄子、辣椒、花生、姜、香蕉、甘茹、麻等。近年又陆续报道在油橄榄、桑、木麻黄、木薯、番荔枝、澳洲松、桉树等木本植物和蚕豆、大豆、豇豆、羽扇豆、南瓜、大白菜、萝卜、茴香、棉花、三叶草、聚合草、草莓等草本植物上发生的青枯病，可以说细菌性青枯病是危害最大，分布最广，损失最重的植物病害之一。单就福建省而言，就有近500万亩烟草、花生、番茄、甜辣等作物感染该病害，一般年份发病率在10-30％，严重田块达100％。近年来，随着全球性气候变化，气温上升，细菌性青枯病的危害逐年加重，成为一些地区农业生产主要障碍。
对于此病的防治，长期以来主要采用高抗品种和进行水旱轮作的方式，但防治效果不甚理想，其原因，一是细菌性青枯病没有真正高抗品种，二是水旱轮作在许多地区难以施行。而药剂防治一般说来成本高，害虫病菌容易产生抗药性而效果不稳定，并且会因药物的残留而破坏土壤，污染环境。
生物防治是近几年来国内外十分重视的防治措施，我国亦有利用从土壤中筛选出来的微生物菌株来防治细菌性青枯病的事例，例如荧光假单孢杆菌(何礼远等，1990)及芽孢杆菌的利用(杨合同等，1990)，但是利用蜡状芽孢杆菌来防治细菌性青枯病，有见报导只有Silveira等在1995年筛选所得的蜡状芽孢BA3(Bacillus cereus)，其温室防治效果为42.60％。上述这些微生物制剂在实际应用过程中，防治效果经常不稳定，或不显著，可治疗的植物种类也较单一，适用范围较窄，主要原因是所筛选的生防菌株品质不理想，专化性太高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，而提供
一种可用于防治细菌性青枯病的高效、广谱、性能稳定、可产业化生产的青枯病生防菌菌株；
该青枯病生防菌供筛选菌株的采集及对其进行进一步筛选的方法；
青枯病生防菌的发酵生产方法及所采用的培养基；
含有该青枯病生防菌的生物农药，即其生防应用。
本发明的目的之一：提供一种青枯病生防菌菌株可经如下方案来实现。
青枯病生防菌菌株，其要点在于，该菌株为ANTI-8098A，于2001年12月11日保藏于“德国微生物保存中心(DSMZ)”，其保藏号为DSMID 00-1000，其微生物分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
该青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 00-1000)具有如下的微生物学特征：
1、形态学特征：
观察在平板培养基上培养(培养温度30℃，时间72小时)的菌落形态特征为：菌落呈圆形，扩展速度快，表面呈乳白色，菌苔较厚，中间微凸起且光滑，边缘半光滑且整齐。在30℃下培养24小时单菌落直径可达1.5-2.0mm，培养48小时菌落直径增大到6.0-7.5mm，且颜色加深，菌苔加厚，培养72小时菌苔丰满有光泽。
在光学显微镜下观察细胞的个体形态特征为：呈杆状，宽0.6-10um，长2.0-4.5um(如图1所示)。
在光学显微镜下观察细菌的鞭毛特征为：细，只有0.02-0.03um。
芽孢及伴孢晶体在光学显微镜下所观察的形态特征为：呈长椭圆型，周边长有鞭毛且能够运动(如图2所示)。
2、生理生化特征：
①其检测方法如下：
碳源利用试验：在Ayer’s基本培养基(NH4H2PO4 1.0g，KCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000.0ml，水洗琼脂17g)中加入各碳素化合物，使最终浓度为0.2％，培养基倒成平板，用移菌环蘸细菌悬浮液(106cfu/ml)点种，在28℃下培养72-96小时，观察细菌生长情况。
卵磷脂酶试验：在无菌的条件下取出新鲜鸡蛋的蛋黄，加入等量的生理盐水，混合均匀，取10ml花生蛋黄溶液加入融化的55℃的200毫升金氏B培养基中混合均匀后移到平板上过夜，取24小时的细菌培养物点状接种，28℃培养，48小时后观察结果，如果菌落的周围和菌落下面有不透明区域出现，表示阳性反应。
明胶的液化试验：培养基为牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，明胶120.0g，蒸馏水1000.0ml，pH7.2。每只试管分装培养基7ml，在121℃灭菌15分钟，冷却，穿刺接种，放在25℃培养，于培养后的第3、7、14和21天取出试管，放在15℃冷水中，观察培养基是否被液化。
接触酶试验：挑取培养基上生长24-48小时的菌苔置于干净的载玻片上，滴加3％的过氧化氢，30秒内有大量气泡产生的为阳性反应，否则为阴性反应。
V-P试验(产生3-羟基丁酮试验)及pH变化：将细菌接种在以下培养基中：蛋白胨9g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。28℃培养4天，每毫升培养基加入0.1N氢氧化钠(含肌酸0.3％)溶液，在48-50℃水浴中处理2小时，充分摇动，4小时内出现红色为阳性反应。另外取培养基用酸度计测定pH变化。
吲哚试验：培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，蒸馏水1000ml灭菌冷却后接种细菌，于28℃培养5天，在5毫升培养基中加入2.5毫升Kovacs试剂，如果培养基呈现红色为阳性反应。Kovacs试剂的配制是溶解5g对二甲氨基甲醛于75毫升戊醇或者丁醇中，在50-55℃水浴中缓缓加热，冷却后加入25毫升浓盐酸，避光储存于4℃冰箱中备用。
水解酪蛋白和酪氨酸试验：在培养基中加入1％的酪蛋白或者酪氨酸，充分摇匀后制备平板，点接细菌于28℃条件下培养5天，逐日观察，如果在菌落周围或者菌落下面产生了透明的区域，表示酪蛋白或者酪氨酸被水解。
淀粉水解试验：细菌可以产生淀粉酶，将淀粉水解为糖类，测定用培养基为：牛肉浸膏2.0g，蛋白胨17.5g，淀粉1.5g，琼脂17.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0。细菌接种于以上培养基平板上，于28℃培养48小时，在平板上加入碘液(碘1.0g，碘化钾2.0g，蒸馏水300ml)，培养基呈现深蓝色，菌落周围为无色透明或者浅棕色为阳性反应。
苯丙氨酸脱氨酶试验：制备如下培养基：酵母膏3g，DL-苯丙氨酸2g，磷酸氢二钠1g，氯化钠5g，琼脂12g，pH7.2。分装培养基于试管中，灭菌后摆成斜面，接种细菌，28℃培养5天，向试管中加入10％的氯化铁溶液，如果在培养基表面或者试管中的冷凝水中有绿色出现，表示有苯丙氨酸酶存在。
糖类产酸和产气试验：采用Ayer’s基本培养基：酵母膏0.2g，NH4H2PO4 1.0g，KCl 0.2g，MgSO4·7H4O 0.2g，蒸馏水1000.0ml，溴百里酚蓝(1.6％酒精溶液)1.5ml，pH7.0。以上基本培养基分装在试管中，加入杜氏小玻璃管，于121℃20分钟灭菌后加入过滤灭菌的碳素化合物，使终浓度为1％，用移菌环蘸细菌悬浮液(106cfu/ml)接种，以不含有待测碳素化合物的培养基为对照。在28℃下培养5天，观察细菌是否生长，如果培养基变为黄色，表示产酸，如果变为蓝色，表示产碱，产气时在杜氏管中可以看到培养基的排空。
好气性测定试验：采用没有琼脂的金氏B培养液，分装试管，每只试管7毫升，于121℃灭菌20分钟，快速冷却后立即接种106cfu/ml的细菌悬浮液0.1ml，其中5个接种试管于接种后立即用灭菌的石蜡油封闭，另外5只试管不封管，于28℃培养72小时，观察细菌是否生长。如果在封闭管中细菌可以大量生长，表示细菌可以进行厌氧生长。
温度适应性试验：采用没有琼脂的金氏B培养液，分装试管，每只试管7毫升，于121℃灭菌20分钟，接种106cfu/ml的细菌悬浮液0.1ml，于5，30和40℃水浴中培养72小时，观察细菌是否生长。
未列出的试验方法采用《伯杰细菌鉴定手册》推荐生理生化测定方法对该青枯病生防菌进行生理生化特征测定。
②检测结果：
试验结果见表1，该青枯病生防菌菌株V-P反应(Ph＝4.9)呈阳性，V-P反应(pH4.9)不产生吲哚，甲基红反应、卵黄反应、明胶液化、石蕊牛奶胨化、淀粉水解、接触酶、精氨酸双水解酶、硝酸盐还原反应均呈阳性，氧化酶呈阴性，不产生H2S；
生长特性表现为：2％NaCl、5％NaCl、pH5.7、45℃条件下能生长，7％NaCl、10％NaCl、50℃条件下不能生长，好氧和兼性厌氧；
产酸反应表现为：D-葡萄糖、D-果糖阳性，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-乳糖、D-甘露醇呈阴性；
分解特性上的特征表现为：酪蛋白、赖氨酸、柠檬酸钠、吐温80呈阳性，酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸钠、醋酸钠、水杨苷呈阴性；
对7种碳源的利用速度为：葡萄糖＞果糖＞麦芽糖＞蔗糖＞纤维糖，而甘露醇和乳糖则不能被分解利用；
对3种氮源的利用的速度不一，硫酸铵＞氨水＞硝酸钾，不能利用尿素。
表1：青枯病生防菌(Bacillus cereus strain ANTI-8098A)
的生理生化特征
| 项目 | 生理生化特征 | 项目 | 生理生化特征 |
| 1反应 | 4分解 | ||
| V-P反应(pH4.9) | + | 酪蛋白 | + |
| 吲哚反应 | - | 酪氨酸 | - |
| 甲基红反应 | + | 赖氨酸 | + |
| 卵黄反应 | + | 苯丙氨酸 | - |
| 明胶液化 | + | 柠檬酸钠 | + |
| 石蕊牛奶胨化 | + | 丙二酸钠 | - |
| 淀粉水解 | + | 醋酸钠 | - |
| 接触酶 | + | 水杨苷 | - |
| 氧化酶 | - | 吐温80 | + |
| 精氨酸双水解酶 | + | 5碳源 | |
| 硝酸盐还原 | + | 葡萄糖 | ++++ |
| H2S产生 | - | 果糖 | +++ |
| 2生长 | 蔗糖 | + | |
| 2％NaCl | - | 麦芽糖 | ++ |
| 5％NaCl | + | 纤维糖 | + |
| 7％NaCl | + | 乳糖 | - |
| 10％NaCl | - | 甘露醇 | - |
| pH5.7 | + | 6氮源 | |
| 45℃ | + | 硫酸铵 | ++ |
| 50℃ | - | 氨水 | + |
| 好氧和兼性厌氧 | + | 硝酸钾 | + |
| 3产酸 | 尿素 | - | |
| D-葡萄糖 | + | ||
| D-木糖 | - | ||
| L-阿拉伯糖 | - | ||
| D-乳糖 | - | ||
| D-甘露醇 | - | ||
| D-果糖 | + |
而经如下的保藏机构：
保藏单位名称：德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
保藏单位地址：德国波恩大学植物病理研究所(Institut furPflanzenkrankheiten Nussallee 953115 Bonn)
联系电话：0531/26 16-231
保藏时间：2001年12月11日
保藏号：DSM ID 01-1000
该青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A)的保藏检测报告见表2
表2：
| 项目 | 鉴定特征 | 项目 | 鉴定特征 |
| 细菌形态 | 杆状 | 酸来源检测 | |
| 宽度(μm) | 0.6-1.0 | D-葡萄糖 | + |
| 长度(μm) | 2.0-4.5 | L-阿拉伯糖 | - |
| 孢子形成 | + | D-木糖 | - |
| 孢子形态 | 椭圆形 | D-甘露糖 | - |
| 革兰氏反应 | + | D-果糖 | + |
| 催化酶 | + | 来自葡萄糖的气体 | - |
| 氧化酶 | - | 卵磷脂酶 | + |
| 厌氧型生长 | + | 水解来自 | |
| VP反应 | + | 淀粉 | + |
| VP介质的pH值 | 4.9 | 甘丙氨菌素 | + |
| 最大正生长温度 | 45℃ | 酪蛋白 | + |
| 最大负生长温度 | 50℃ | 吐温80 | W |
| 不同生长条件 | 七叶茸水解 | + | |
| PH5.7 | + | 柠檬酸评估 | + |
| 2％NaCl | + | 丙酸菌(脂) | + |
| 5％NaCl | + | 吲哚反应 | - |
| 7％NaCl | - | 精氨酸水解 | + |
| 10％NaCl | - | 氮还原反应 | + |
| 溶菌酶培养剂 | + |
同时该保藏中心提供的本青枯病生防菌的检测报告也表明该菌株为一种新的用于防治青枯病的蜡状芽孢杆菌。
青枯病生防菌ANTI-8098A对番茄、茄子、辣椒、烟草、生姜的青枯病有较好的防治效果，经农业部药检所指定的田间药效测定表明，对茄子青枯病的防效在75-85％(试验许可编号：NF010097)。发明人所作的大量的田间试验的结果为：对各种经济作物的田间防治实验的防治效果达80％以上，例如对番茄、辣椒青枯病具有较高的防效，采用沾根、毒土、灌根法对辣椒青枯病防治效果分别可达83.8％、82.1％、85.1％等；采用沾根、毒土、灌根法对番茄青枯病防治效果分别可达87.7％、86.36％、81.0％等。而现有技术筛选而得的青枯病防治菌的防治效果一般小于50％，且本发明提供的蜡状芽状杆菌的实施其环境要求不高，任何田间均可实施，防治效果稳定，可治疗的植物种类多样化，适用范围广。
本发明还具有两个出乎意料的效果：被该青枯病生防菌ANTI-8098A处理过的果实果身匀称光滑、长短适中、果形更好看，因而提高了果实的品质；同时经处理的果实的产量提高了。
本发明提供的保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌对青枯病菌的防治作用体现为对普通青枯病菌的抑制作用和对强青枯病菌的弱化作用。
发明人在观察保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌对青枯菌的致病性变化的影响(即抑菌机理)过程中发现经过保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌处理后的青枯菌的强菌株(弱化指数＜75％)再次培养全部变为青枯菌弱菌株(弱化指数＞75％)，并将这一现象定义为致弱现象(Attenuation)。
为了减少本发明的篇幅，至于致弱现象的研究试验的步骤及详细的结果的比对详见具体实施方式中的实施例4的描述。
本发明所述的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A)供筛选菌株的采集方法的基本步骤：
1、提供一种土壤，
2、将一份土壤与九份无菌水(重量比)于玻璃器皿中混匀，
3、将混合物振荡20min后静置20～30s，即得10-1稀释液，
4、将一份10-1稀释液与九份无菌水(重量比)混匀而得10-2稀释液，以此类推，连续稀释而制得10-4稀释液、10-5稀释液、10-6稀释液，
5、将10-4稀释液、10-5稀释液、10-6稀释液分别均匀涂抹于不同编号的培养基上，并于培养箱内培养，
6、挑取乳白色、边缘光滑、表面微隆起的杆状单菌落供筛选使用。
本发明为获得对青枯病菌最佳的生物防治菌株，总共采集了近百种的土壤样本，分离而得供筛选的菌株一万多种。
所提供的土壤一般为易患细菌性青枯病的经济作物的根系土壤，特别是茄科作物的根系土壤更为适用。
对稀释液进行稀释时需采用不同的移液管，这样可以保证得到准确浓度的溶液。
培养基为一般固体培养基即可，本发明人提供一种NA培养基用于对稀释后的菌液进行培养，其配方为：牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、琼脂1.8％。
NA培养基的pH为7.2。
该培养基同样可供青枯病生防菌筛选时使用。
将10-4稀释液、10-5稀释液、10-6稀释液分别均匀涂抹于不同的培养基后在常温下平放20～30min，这样便于稀释液渗透进培养基内。
培养温度为30℃、培养时间为48h。
48h后，培基内会有菌落长出，其菌落特征为乳白色、边缘光滑、表面微隆起，若将菌落制成涂片，经碱性品红染色后在显微镜下观察，具有芽孢、杆状菌体的单菌落即为青枯病生防菌。
本发明从复数份的土壤样本中采集分离出成千上万株供筛选使用的菌株，根据择优入用的原则，本发明人采用提供青枯病菌作为病害指示菌对这些采集而得的芽孢杆菌进行筛选，该青枯病生防菌的筛选步骤依序如下：
1、提供一株供筛选菌株，
2、将供筛选菌株点接于培养基上，
3、将培养基置于30℃培养箱内培养48小时而成第一菌群，
4、提供一种青枯病菌指示菌，
5、将该指示菌配成浓度为107cfu/ml的悬液，
6、将悬液喷布于第一菌群中，并于培养箱中培养48小时，
7、观察菌落，抑菌圈大于2mm者为对青枯病菌具有拮抗作用的菌株。
本发明首先以烟草青枯病菌作为指示菌对供筛选的芽孢杆菌进行初筛而得第一批具有一定拮抗作用的芽孢杆菌，接着再从蕃茄、甜菜、烟草、茄子等受害作物中分离青枯病菌作为指示菌，而将对青枯病菌具有拮抗作用的菌株进行复数次的筛选。最后得出对全部指示菌都有抑菌作用的菌株为青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID01-1000)。
本发明将最后筛选而得的青枯病生防菌(Bacillus cereusANTI-8098A DSM ID 01-1000)配制成浓度为109cfu/ml的菌液，将分离而得的蕃茄青枯病假单孢杆菌菌株(F4)配制成1×107cfu/ml的菌液，同时提供多个圆形实验盆，直径20cm，高度20cm，并装满消毒的土壤，接着将3-4片真叶的番茄幼苗根部洗尽后，直接栽于消毒土壤中。处理1浇灌蕃茄青枯病假单孢杆菌菌株菌液20ml，处理2浇灌青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)菌液和蕃茄青枯病假单孢杆菌菌株菌液各20ml，处理3浇灌清水20ml为对照。每个处理30株苗，置于28-30℃温度、90-100％湿度的光波温室内。
试验结果为接青枯病菌的30株番茄7天后开始发病，发病株达27株，第九天发病番茄全株萎蔫，发病率达90.0％。接青枯病菌和生防菌ANTI-8098的30株番茄苗发病2株，发病率仅为6.6％。对照组皆未发病。试验结果表明，青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID01-1000)组比直接使用番茄青枯病菌的发病率下降92.6％，说明青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)对番茄青枯病有很好的防效。
表3 青枯病生防菌ANTI-8098A对番茄青枯病的控制效果
| 处理 | 试验株数 发病株数 发病率(％)(N) (n) |
| 处理1(青枯病菌)处理2[青枯病菌+青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSMID 01-1000)]处理3(清水对照) | 30 27 90.030 2 6.630 0 0.0 |
分离筛选出青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID01-1000)后则需对其进行工业化生产。
本发明进一步还在于提供一种
青枯病生防菌的发酵生产方法，所用菌株为分离筛选而得的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)，具体步骤如下：
1、提供一种青枯病生防菌菌种及装有第一培养基的若干玻璃器皿，
2、将菌种接种到第一培养基上，经温度30℃、时间18h的活化培养而得菌种A，
3、将菌种A与无菌水混匀制得悬液，
4、提供一种种子罐及第二培养基，
5、按5％的接种量将菌种A接种至装有第二培养基的种子瓶，并发酵12h而得种子液，
6、提供一种发酵罐及第三培养基，
7、将种子液移入装有第三培养基的发酵罐培养，温度28℃～31℃，时间24～48h，转速180r/m～220r/m，通气量15～40ml瓶装量。
8、每隔8h提取菌液一次，观察菌液中的菌体数超过30×108个/ml即可放罐。
为了实现青枯病生防菌的大批量工业化生产，需对该菌株进行大规模扩大培养，以便使该菌株能对各地出现的青枯病菌灾害进行防治，这样才能真正达到本发明的最终目的。
一般菌株的大批量发酵生产的过程为：小批量活化培养→种子瓶(种子罐)培养→大批量发酵罐培养，所不同的是发酵生产过程中各种条件参数的设定，它们关系生产的效率、成本及产品的抑菌效果等诸多因素，如不同通气量、pH值、温度对青枯病生防菌(Bacillus cereusANTI-8098A DSM ID 01-1000)发酵液的孢子数和抑菌圈值有极显著的影响(P＜0.01)。
采用常规的技术方案亦可对本发明所提供的青枯病生防菌进行大批量扩大生产，但是本发明是通过多次重复的正交试验才优化选择而得出所提供的青枯病生防菌发酵生产方法的各种条件参数。结果表明：经此发酵生产方法对青枯病生防菌进行发酵生产时，发酵液的孢子数量较多，一般能达30×108cfu/ml以上，抑菌圈值达10mm以上。发酵液的孢子数多说明生产的效率高，进而成本就低。
本发明所提供的第一培养基为固体培养基，因而只需含有琼脂或其类似物用作培养基材料的物质即可，例如本技术领域技术人员共知的普通试管斜面培养基，本发明提供一种
第一培养基的配方为：牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、NaCl 0.5％、琼脂2％、pH7.0。
而第二培养基、第三培养基为液体培养基，它们的配方可相同亦可不同，本发明提供一种
第二培养基、第三培养基的配方为：豆饼粉3.0～5.0％、玉米浆0.8～1.2％、玉米淀粉0.2～0.4％、蛋白胨0.2～0.4％、KH2PO4 0.06～0.07％、MgSO4 0.02～0.04％、CaCO3 0.2～0.3％。
其中的蛋白胨提供氮源，玉米淀粉提供碳源，豆饼粉既提供氮源又提供碳源。
尤以豆饼粉4.0％、玉米浆1.0％、玉米淀粉0.3％、蛋白胨0.3％、KH2PO4 0.07％、MgSO4 0.03％、CaCO3 0.1％为最佳。
而第二培养基、第三培养基的pH值为7.0～8.0。
尤以第二培养基、第三培养基的pH值为7.5最佳。
以下部分主要涉及含有青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098ADSM ID 01-1000)的生物制剂、生物杀虫剂，即其对青枯病菌的生物防治。
一种纯生物菌株培养物，其要点在于，其具有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌的菌株。
这样，基于前文所述的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098ADSM ID 01-1000)对青枯病菌的有效抑制作用，该生物菌株培养物亦可对青枯病菌本身进行抑制，且可以用于进行青枯病生防菌(Bacillus cereusANTI-8098A DSM ID 01-1000)的扩大再生产。
一种纯生物菌株培养物，其要点在于，其具有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的突变体的所有鉴定特征。
该处突变体的定义为其在高度严格的条件下鉴定具有可与青枯病生防菌ANTI-8098A DSM ID 01-1000的基因组杂交(指一个或多个核苷酸反应而形成的核苷酸碱基间的氢键稳定的化合物的反应)的基因组。该两种基因组的相同性(或同源性)以85％以上序列相同为基准，它们的比对方法可采用本领域所熟知的软件程序进行，而此处鉴定特征以保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的保藏报告为准。
本发明还在于提供一种
纯生物菌株培养物，其要点在于，其包含有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌的菌株和具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
本发明进一步还在于提供一种
含有纯生物菌株培养物的生物农药，其要点在于，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
生物农药是指作为农药使用的由生物体直接产生的具有生物活性的物质或具有拮抗作用的生物体，以及人工合成的与天然化合物结构相同的活性物质，也称生物源农药。
本发明人经过长期的研究试验，目的也就是要找出一种高效、广谱、性能稳定的抑制细菌性青枯病的菌种，并将这种菌种制成生物杀虫剂。基于前文所述的纯生物菌株培养物对青枯病菌的有效抑制作用，该生物农药亦可对青枯病菌本身进行抑制。而其制备方法可以采用本领域熟知的技术方案进行。例如可将发酵生产的纯生物菌株培养物的发酵液干燥成可湿性粉剂，或浓缩成浓缩液等。
该生物农药还包含有载体。
这种生物农药可以根据不同载体的介入而成各种剂型，例如，但不局限于，粉剂，颗粒剂，悬液，浓缩液等。而载体的选择可以本领域所熟知的技术方案进行，如悬液，则载体为无菌水；粉剂，则载体可为豆饼粉。
该生物农药还包含有助剂。
助剂的功能是可以提高青枯病生防菌在土壤中的存活能力，从而提高生物农药的防治效果及稳定性。例如助溶剂、悬浮剂、展着剂等，助剂的选择可以根据本领域所熟知的技术方案进行。
该生物农药还包含有除保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或其突变体之外的至少一种化学或生物学杀虫剂。
所增加的化学或生物学杀虫剂可以加强本生物农药抑制青枯病菌的能力，还可以通过此结合实现对经济作物所发生的其它病虫害的防治。
针对保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的生防应用，本发明还涉及一种
从纯生物菌株培养物中分离而得的代谢物，其要点在于，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
代谢物是指任何具有杀虫(菌)活性的化合物、物质或微生物发酵的副产品。由于许多微生物在其生命活动过程能产生某种特殊的代谢产物，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用，本文所指代谢物更具体是指保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或其具有抑制青枯病菌的生物活性突变体的发酵的副产品，它具有抗青枯病菌特异活性的特性，该产品基于前文所述保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的抑制青枯病菌的特性而同样具有抑制青枯病菌的特性。
进一步还在于提供一种
第一生物杀菌剂，其要点在于，其含有从纯生物菌株培养物中分离而得的代谢物，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
与上述提供的生物农药特性相同，该生物杀菌剂还可以具有如下特性：
该生物杀菌剂还包含有载体。
该生物杀菌剂还包含有助剂。
该生物杀菌剂还包含有除此代谢物之外的至少一种化学或生物学杀虫剂。
再提供一种
从纯生物菌株培养物中分离而得的上清液，其要点在于，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
“上清”定义为指为了获取培养物中的细胞而将液体培养物通过离心、过滤、沉淀等本领域技术人员所熟知的方法去除剩余液体而得的清液。
涉及本发明则是指含有青枯病生防菌生物活性的生物细胞的液体，更具体是指含有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或其具有抑制青枯病菌的生物活性突变体的细胞液。
至于采用从纯生物菌株培养物中分离而得的上清液对青枯病菌的抑制作用及效果详见本发明具体实施方式中的实施例7的描述。
第二生物杀菌剂，其要点在于，其含有从纯生物菌株培养物中分离而得的上清液，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
与上述提供的生物农药特性相同，该生物杀菌剂还可以具有如下特性：
该生物杀菌剂还包含有载体。
该生物杀菌剂还包含有助剂。
该生物杀菌剂还包含有除此上清液之外的至少一种化学或生物学杀虫剂。
进而再提供一种
预防或治疗植物青枯病菌的方法，其要点在于，其或应用有效剂量的生物农药，或应用有效剂量的第一生物杀菌剂，或应用有效剂量的第二生物杀菌剂。
此处的有效剂量是指足以达到预防或治疗植物青枯病菌的有益技术效果的结果的量。
综上所述，本发明较之现有技术具有如下优点：所提供的保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或由其制作的生物农药、生物杀菌剂对植物青枯病菌具有很好的防治效果，经农业部药检所指定的田间药效测定表明，对茄子青枯病的防效在75-85％(试验许可编号：NF010097)。发明人所作的大量的田间试验的结果为：对各种茄科经济作物的田间防治实验的防治效果达80％以上，且被该青枯病生防菌ANTI-8098A处理过的果实果身匀称光滑、长短适中、果形更好看，因而提高了果实的品质；同时经处理的果实的产量提高了，而且该菌株的繁殖培养方法简便易行，适于工业化大批量生产。
附图说明
图1为青枯病生防菌的细胞形态特征示意图。
图2为青枯病生防菌的芽孢及伴孢晶体的形态特征示意图。
图3青枯病强菌株经青枯病生防菌ANTI-8098A处理后的弱致病性示意图。
图4为青枯病强菌株的强致病性特征示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例1：
实验开始于青枯病生防菌供筛菌株的采集，土壤样品采自福建省福州、莆田、三明、龙岩、宁德、南平、厦门、漳州、泉州等九个地市番茄、辣椒、烟草、生姜、花生等茄科作物根系土壤，样本个数87个。
采集方法如下(分别令87个土壤样品进行如下操作)：
1、提供上述87种土壤样品的一种，
2、将该种土壤与九份无菌水(重量比)于玻璃器皿中混匀，
3、将混合物振荡20min后静置20～30s，即得10-1稀释液，
4、将一份10-1稀释液与九份无菌水(重量比)混匀而得10-2稀释液，以此类推，连续稀释而制得10-4稀释液、10-5稀释液、10-6稀释液，
5、将10-4稀释液、10-5稀释液、10-6稀释液分别均匀涂抹于不同编号的培养基上，并于培养箱内培养，
6、挑取乳白色、边缘光滑、表面微隆起的杆状单菌落，制片在显微镜下观察，可见杆状细菌和芽孢，收集之并供后续筛选使用。
本实验从所采集的87种土壤样品中分离菌株12100多株。
本实施例所采用的实验设备均为本领域常规设备。
而培养基配方为：牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、琼脂1.8％；pH为7.2；培养温度为30℃、培养时间为48h。
实施例2：
对实施例1分离而得的12100多株菌株分别进行如下的筛选。
(1)提供一株供筛选菌株，
(2)将供筛选菌株点接于培养皿中的培养基上，
(3)将培养皿置于30℃培养箱内培养48小时而成第一菌群，
(4)提供一种青枯病菌指示菌，
(5)将该指示菌配成浓度为107cfu/ml的悬液，
(6)将107cfu/ml悬液喷布于第一菌群中，并于培养箱中培养48小时，
(7)观察菌落周围抑菌圈大小，抑菌圈大于2mm者为对青枯病菌具有拮抗作用的菌株，并进行菌株的命名。
将采集而得12100多株菌株，分别选择10株青枯病假单孢杆菌菌株作为指示菌株(这些菌株分别从蕃茄、甜椒、烟草、茄子等受害作物病部分离获得)，重复对供筛选的菌株进行上述筛选步骤。
初筛试验结果见表4，初步筛选出一组对烟草青枯病假单孢杆菌(P.solanacearum G7)指示菌株有拮抗作用的菌株，占分离总数的1.48％。这些来自不同作物上的菌株为芽孢杆菌。不同作物，青枯病生防菌获得率不同，茄科作物稍高，在番茄、甜椒、烟草获取生防菌比率分别为1.42％、1.29％、1.22％，而花生、生姜上为0.82％和0.96％，获取率相差在30％以上，这种差异与指示菌有关。本研究供筛选出181株生防菌，初筛率达14.87％。
表4 不同作物根土区系菌株的分离结果
| 作物根土 | 观察菌数 有效菌数 有效菌比例(％) |
| 番茄烟草花生甜椒生姜总数 | 4217 60 1.421573 19 1.222701 22 0.824905 63 1.291771 17 0.9612167 181 14.87 |
对181株初筛菌株进一步在培养基上连续9次转移，结果只有143株保持拮抗力，37株丧失拮抗力，占初筛菌株20％。143株芽孢杆菌再通过10个来源不同的青枯病菌作为指示菌，在培养基上进行交互测试，最后对全部指示菌具有抑菌作用的生防菌仅有2株，定名为ANTI-8098和ANTI-8093菌株，其余99％都有不同程度的专化性。ANTI-8098、ANTI-8093菌株在10株青枯病菌指示菌上，抑菌率分别为100％、80％，抑菌圈范围0-13mm。详见表5。
表5 青枯病生防菌对青枯病原菌小种的抑制作用
| 青枯致病菌株 | 作物 | 抑制圈直径(mm) |
| ANTI-8098 ANTI-8093 | ||
| F4F9F17P1P4P6G7G14L6L11 | 番茄番茄番茄甜辣甜辣甜辣烟草烟草茄子茄子 | 11 712 98 97 136 78 97 010 86 912 0 |
| 平均(mm) | 8.7 7.1 | |
| 拮抗率(％) | 100 80 | |
研究结果表明，绝大部份菌株都有其固有的拮抗范围(专化型)，每个有效菌对不同的病原菌抑菌圈值大小不同，不同的有效菌株对同种病原菌，抑菌圈值也不同，本研究最终筛选出的ANTI-8098青枯病生防菌的菌株命名为ANTI-8098A，于2001年12月11日保藏于“德国微生物保存中心(DSMZ)”，其保藏号为DSM ID 01-1000，其微生物分类命名为青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A)。
其菌落形态特征为：菌落呈圆形，表面呈乳白色，中间微凸起且光滑，边缘半光滑且整齐；其细胞个体形态特征为：呈杆状，宽0.6-10um，长2.0-4.5um；其细菌的鞭毛特征为：直径0.02-0.03um；其芽孢及伴孢晶体的形态特征为：呈长椭圆型，周边长有鞭毛。
该青枯病生防菌菌株：
V-P反应(Ph4.9)呈阳性，不产生吲哚；
甲基红反应、卵黄反应、明胶液化、石蕊牛奶胨化、淀粉水解、接触酶、精氨酸双水解酶、硝酸盐还原反应均呈阳性；
氧化酶呈阴性，不产生H2S；
产酸反应表现为：D-葡萄糖和D-果糖阳性，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-乳糖、D-甘露醇阴性；
分解特性上的特征表现为：酪蛋白、赖氨酸、柠檬酸钠、吐温80呈阳性，酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸钠、醋酸钠、水杨苷呈阴性。
实施例3：
青枯病生防菌的发酵生产方法，所用菌株为分离筛选而得的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)，具体步骤如下：
(1)提供一种青枯病生防菌菌种及装有第一培养基的若干玻璃器皿，
(2)将菌种接种到第一培养基上，经温度30℃、时间18h的活化培养而得菌种A，
(3)将菌种A与无菌水混匀制得悬液，
(4)提供一种种子罐及第二培养基，
(5)按5％的接种量将含有菌种A的悬液接种至装有第二培养基的种子瓶，并发酵12h而得种子液，
(6)提供一种发酵罐及第三培养基，
(7)将种子液移入装有第三培养基的发酵罐培养，温度28℃～31℃，时间24～48h，转速180r/m～220r/m，通气量15～40ml瓶装量。
(8)每隔8h提取菌液一次，观察菌液中的菌体数超过30×108个/ml即可放罐而得大量的青枯病生防菌ANTI-8098A。
其中，第一培养基的配方为：牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、NaCl 0.5％、琼脂2％、pH7.0。
第二培养基、第三培养基的配方为：豆饼粉4.0％、玉米浆1.0％、玉米淀粉0.3％、蛋白胨0.3％、KH2PO4 0.07％、MgSO4 0.03％、CaCO3 0.1％，pH值为7.5。
下面对所得青枯病生防菌ANTI-8098A菌株的发酵液对青枯病菌的抑制作用进行测定。
将发酵的青枯病生防菌ANTI-8098A原液(孢子数为3.5×109个/ml)，用灭菌水配制成原液含量分别为10、20、30...90％的稀释液各20ml备用。而后配制SPA培养基10瓶，每瓶25ml，用接种环从番茄青枯菌强菌株平板上挑取菌落，悬浮在9ml无菌水试管中，充分振荡后，用吸管各吸0.9ml菌液，分别接种到10瓶SPA培养基中，发酵培养青枯菌，48h后用TTC培养基活菌体计数法，计算致病性活菌体数量为30.1×108/ml，非致病性活菌体数量为13.0×108/ml，等量分别与各浓度的青枯病生防菌ANTI-8098A菌液混合，放置在28℃培养箱培养48h，以等量灭菌水与青枯菌混合作对照。用TTC培养基活菌体计数法计算被青枯病生防菌ANTI-8098A抑制后致病性菌和非致病性菌的数量。
试验结果见表6。青枯病生防菌ANTI-8098A对番茄青枯病致病菌和非致病菌的抑制作用显著。随着青枯病生防菌ANIT-8098A浓度的增加，对致病性和非致病性菌的抑制作用加强，35％的青枯病生防菌ANIT-8098A发酵液对致病性菌的抑制作用达95.5％，对非致病性菌的抑制作用达70.8％。青枯病生防菌ANIT-8098A对番茄青枯病致病性菌的抑制作用高于非致病性菌，在低浓度下，5％的青枯病生防菌ANIT-8098A对致病性菌的抑制作用为22.9％，较非致病性菌高1.4倍，在中等浓度下，25％的青枯病生防菌ANIT-8098A对致病性菌的抑制作用为83.4％，较非致病性菌高1.5倍，在高浓度下，45％的生防菌ANTI-8098A对致病性菌的抑制作用为95.7％，较非致病性菌高1.5倍。
表6 不同浓度的青枯病生防菌ANIT-8098A发酵液对番茄青枯病致
病菌和非致病菌的抑制作用
| 生防菌发酵液含量(％) | 处理前的菌浓度(cfu/ml) | 处理后的菌浓度(cfu/ml) | 效正死亡率(％) | |||
| 致病菌 | 非致病菌 | 致病菌 | 非致病菌 | 致病菌 | 非致病菌 | |
| 5 | 30.1×108 | 13.0×108 | 23.2×108 | 10.9×108 | 22.9 | 16.2 |
| 10 | 20.4×108 | 9.8×108 | 32.2 | 24.6 | ||
| 15 | 15.7×108 | 8.5×108 | 47.8 | 34.6 | ||
| 20 | 10.2×108 | 7.0×108 | 66.1 | 46.2 | ||
| 25 | 5.0×108 | 5.8×108 | 83.4 | 55.3 | ||
| 30 | 4.7×108 | 4.2×108 | 84.4 | 67.7 | ||
| 35 | 1.4×108 | 3.8×108 | 95.3 | 70.8 | ||
| 40 | 1.8×108 | 2.1×108 | 94.0 | 83.8 | ||
| 45 | 1.3×108 | 1.7×108 | 95.7 | 86.9 | ||
| 50 | 0.4×108 | 1.5×108 | 98.7 | 88.5 |
实施例4：
一种纯生物菌株培养物，其具有实施例3发酵所得的保藏号为DSMID 01-1000的青枯病生防菌的菌株。
效果实验如下：
提供实施例3所得的青枯病生防菌ANTI-8098A的发酵液；
提供青枯菌强菌株F.1.3.010702-12-V，并在摇床200r/min、28℃培养48h而得青枯菌发酵液。
将青枯病生防菌ANTI-8098A的发酵液及青枯菌发酵液各取5mL混合在一起静置24h，以5mL青枯菌发酵液加5mL无菌水为对照。采用平板计数法在TTC培养基的平板上分离和计数青枯菌的数量，测定弱化指数，分析青枯菌的致病性变化，处理后的菌株编码F.1.3.010702-12-V-ANTI。
试验结果列表7。青枯菌强菌株F.1.3.010702-12-V发酵液与青枯病生防菌ANTI-8098A发酵液混合静置24h后，用TTC培养基分离得到的青枯菌F.1.3.010702-12-V-ANTI有80％以上为弱致病性(中间红点大，白边窄，红点直径与菌落直径比例平均为85.7％。详见图3)，而对照(与无菌水混合)中分离得到的青枯菌95％为强菌株(中间红点小，白边宽，红点直径与菌落直径比例平均为40％。详见图4)。可见，青枯菌强菌株经过青枯病生防菌ANTI-8098A处理后，致病性明显减弱，说明ANTI-8098A对青枯菌的生长具有致弱作用。同时，经ANTI-8098A处理后，青枯菌数比对照减少了90％，说明生防菌ANTI-8098A对青枯菌的生长具有抑制作用。
表7 青枯病生防菌ANTI-8098A对青枯菌强菌株F.1.3.010702-12-V的
致弱作用
| 处理 | 青枯菌+无菌水(对照) | 青枯菌+ANTI-8098A |
| 青枯菌菌落数(个/皿) | 10 | 1 |
| 青枯菌孢子数(亿/mL) | 50 | 5 |
| 青枯菌致病性变化 | 95％为强致病性菌株 | 80％为弱致病性菌株 |
| 弱化指数(％) | 40.0 | 85.7 |
实施例5：
含有纯生物菌株培养物的生物农药，其为含有青枯病生防菌ANTI-8098A(为实施例3提供的具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株)20亿个孢子数/克的生物菌株培养物制剂。
下面使用不同浓度的上述生物农药，处理接种青枯菌后的盆栽苗，并设清水对照和强菌株接菌对照，观察盆栽苗的发病情况，分析的生防菌的使用浓度。
试验使用青枯菌F.1.3-010702-01菌株，用SPA培养基摇床培养，配置成1×106cfu/ml青枯菌液备用。供试盆栽苗使用茄子盆栽苗和番茄盆栽苗。青枯菌接菌处理方法为，将4-5叶的番茄小苗和4-5叶的茄子小苗栽入装有无病菜园土的小试验盆内，试验盆圆形，直径20cm，高度20cm，每盆浇灌50ml供试青枯菌液，而后，将生物农药配置成100、200、300、400、500倍液，每盆浇灌50ml，设清水对照，每处理30株苗，盆栽苗放入光波温室，温度控制在30±1.5℃，湿度控制在90±10％RH，逐日观察小苗发病率。
试验结果表8，试验结果表明，生物农药ANTI-8098A制剂不同浓度防治番茄和茄子青枯病的效果差异显著(P＜0.01)。其中使用100-400倍的生防菌制剂防治番茄和茄子青枯病的效果与清水对照处理7差异不显著(P＜0.01)，平均发病率小于7.5％.，而在100-300倍液生物农药制剂处理下的番茄和茄子不发病。500倍液生防菌制剂对番茄和茄子青枯病的防效与对照接菌处理5差异显著(P＜0.01)，处理后第10天番茄发病率为73.3％，茄子的发病率为63.3％，显著地低于接菌对照，高于100-400倍生防菌制剂处理。
表8 生物农药ANTI-8098A制剂不同浓度处理对番茄和茄子青枯病的
防治效果
| 生防菌浓度(倍) | 青枯菌浓度 | 番茄苗不同天数(d)发病率(％) | 茄子苗不同天数(d)发病率(％) | |||||||
| 3 | 5 | 7 | 10 | 3 | 5 | 7 | 10 | |||
| 处理1 | 100 | 1×106cfu/ml | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 处理2 | 200 | 1×106cfu/ml | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 处理3 | 300 | 1×106cfu/ml | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 处理4 | 400 | 1×106cfu/ml | 0 | 0 | 6.7 | 20.0 | 0 | 3.3 | 13.3 | 16.6 |
| 处理5 | 500 | 1×106cfu/ml | 0 | 0 | 50.0 | 73.3 | 0 | 43.4 | 53.3 | 63.3 |
| 处理6 | 清水对照 | 1×106cfu/ml | 0 | 56.7 | 100 | 100 | 0 | 66.7 | 100 | 100 |
| 处理7 | 清水对照 | 清水对照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
实施例6：
本实验所用还是实施例3所得的青枯病生防菌ANIT-8098A发酵液制作而得的生物农药(含量20×108cfu/g)，为测该生物农药采用不同施用方法对田间茄子、番茄、辣椒青枯病的防治效果，于2001年9-11月在福州市新店试验地试验。试验作物茄子、番茄、辣椒，病害茄科青枯病。方法为300倍上述生物农药沾根，每穴1g生物农药的毒土，300倍上述生物农药灌根，设大剂量链霉素(1000倍施用3次)药剂对照和清水对照，供试作物移栽20天后，用300倍灌根法，间隔20天施用二次药。小区面积30M2，每个处理重复4次，最后一次施药后30天，调查茄子、番茄、辣椒青枯病发病株数，统计发病率和防治效果。
试验结果见表9。试验结果表明：生物农药各种使用方法对茄子、番茄、辣椒青枯病具有较高的防效。沾根、毒土、灌根对茄子青枯病的防治效果分别为92.0％、95.6％、95.2％。沾根、毒土、灌根对番茄青枯病防治效果分别为87.7％、86.36％、 81.0％。沾根、毒土、灌根对辣椒青枯病防治效果分别为83.8％、82.1％、85.1％。三个作物的链霉素对照防效在73-76％之间，清水对照三个作物发病率在23.5-32.3之间。
表9 生物农药ANIT-8098A制剂对三种茄科作物青枯病的防治效果
| 作物 | 处理方法 | 调查株数 | 发病株数 | 发病率(％) | 防治效果(％) |
| 茄子 | 300倍沾根 | 78 | 2 | 2.5 | 92.0 |
| 300倍灌根 | 85 | 2 | 2.3 | 92.6 | |
| 1g毒土 | 69 | 1 | 1.5 | 95.2 | |
| 链霉素 | 54 | 5 | 9.3 | 70.3 | |
| 清水 | 67 | 21 | 31.3 | - | |
| 番茄 | 300倍沾根 | 81 | 3 | 3.7 | 87.7 |
| 300倍灌根 | 74 | 3 | 4.1 | 86.3 | |
| 1g毒土 | 53 | 3 | 5.7 | 81.0 | |
| 链霉素 | 62 | 5 | 8.1 | 73.0 | |
| 清水 | 40 | 12 | 30.0 | - | |
| 辣椒 | 300倍沾根 | 52 | 2 | 3.8 | 83.8 |
| 300倍灌根 | 48 | 2 | 4.2 | 82.1 | |
| 1g毒土 | 57 | 2 | 3.5 | 85.1 | |
| 链霉素 | 66 | 5 | 5.6 | 76.1 | |
| 清水 | 50 | 12 | 23.5 | - |
实施例7：
从纯生物菌株培养物中分离而得的上清液，将实施例3中种子罐中培养所得的培养液取出，取液次数分别为16小时、24小时、32小时、40小时各一次，分别用离心机6000r/min离心10分钟后得到上清液。
测定从纯生物菌株培养物中分离而得的上清液对青枯病菌的防效：
将普通细胞琼脂(2.0％)培养基熔化后，倒入平板底层作为平板下层培养基，凝固后，再将普通琼脂(0.7％)培养基熔化后冷却到45℃左右，然后加入茄子青枯病原菌菌株作为指示菌，并分别滴加上述所得的ANTI-8098A培养液，然后放置在培养箱中28℃培养24小时后测量抑菌圈大小。结果见表10。
表10 青枯病生防菌ANTI-8098A发酵液的上清液对青枯病菌的抑制
作用
| 培养时间(h) | 孢子数(×108/ml) | 离心上清液抑菌圈直径 |
| 16 | 12.0 | 0 |
| 24 | 20.8 | 8 |
| 32 | 25.2 | 10 |
| 40 | 39.2 | 11 |
实验结果表明：ANTI-8098A的不同培养时间的培养液经离心取得的上清液有抑菌圈现象出现，说明该上清液对青枯病原菌有抑制作用，同样上清液中的ANTI-8098A菌株分泌的代谢产物中存在抗青枯病菌物质。
实施例8：
为了提高青枯病生防菌在生物制剂中的存活率，减缓其在土壤中的死亡率，提高其在土壤中定殖水平，本试验对青枯病生防菌ANTI-8098A的存活基质进行了研究，筛选所得的存活基质(Survival Material)，提高了青枯病生防菌在基质保存中的存活率，延缓了其在土壤中的衰亡时间。
一、为进行青枯病生防菌ANIT-8098A保存、防效和土壤定殖能力的研究，下面配制不同配方的存活基质。
存活基质(其中即有合成生物农药或生物杀菌剂所需的载体或助剂)，主要原料来源为豆饼粉、泥炭土、木屑、吸水剂SAP-20、助剂(助溶剂、悬浮剂、展着剂等)、少量KCl和尿素(总和不超过5％)。豆饼粉和泥炭土作为营养基质，为生防菌保存期间和释放期间提供营养；木屑作为结构基质，提供通风透气的功能；吸水剂SAP-20是高吸水性树脂，为一种新型功能的高分子材料，其吸水倍数可达数百倍甚至上千倍，吸水速度可在数秒内生成凝胶，提供产品保存期间和使用释放时的保湿功能；少量KCl和尿素用于产品保存期间基质防腐和隔氧，减少生防菌在基质中的死亡率。由以上原料配制加工成5个基础组分，即组分I、组分II、组分III、组分IV、组分V，将基础组分按表11配方进行配制加工，加入最终含量为20×108cfu/g青枯病生防菌ANIT-8098A，用搅拌器均匀混合后，用造粒机制成4种制剂，编号为ANIT-1号、ANIT-2号、ANIT-3号和ANIT-4号。通过试验比较青枯病生防菌ANTI-8098A在基质中的存活率、在土壤中的定殖率、以及对青枯病的防效的影响。供试茄子品种为“梅茄一号”。
表11 青枯病生防菌ANIT-8098A存活基质配方
| 配方编号 | 组分I(％) | 组分II(％) | 组分III(％) | 组分IV(％) | 组分V(％) |
| ANIT-1号 | 8 | 47 | 40 | 5 | 0 |
| ANIT-2号 | 8 | 52 | 40 | 0 | 1 |
| ANIT-3号 | 8 | 46 | 40 | 5 | 1 |
| ANIT-4号 | 8 | 41 | 40 | 10 | 1 |
二、不同配方的存活基质对青枯病生防菌ANIT-8098A保存存活率的影响
取4种配方制剂(表11)各1000g，初始青枯病生防菌ANIT-8098A的含菌量为18～20×108cfu/g，在室温(25-27℃)密封条件下保存24个月后，各取1克，用无菌水稀释成105倍后，用移液管吸取0.2ml稀释液，置于牛肉膏蛋白胨的平板培养基上涂抹均匀，重复3次，在30℃培养箱中培养48小时后，计算活菌数，比较其存活率。试验结果见表12。经24个月的保存，在用4种不同配方存活基质制成的生物杀菌剂制剂ANIT-1号、ANIT-2号、ANIT-3号、ANIT-4号的保存效果差异极显著(P＜0.01)。其中ANIT-3号中生防菌的保存效果最好，24个月保存后活菌数最多，存活率达82.90％；ANIT-3号较好，存活率为74.63％；ANIT-1号较差，存活率为16.83％；ANIT-2号的效果最差，存活率下降到6.52％，比ANIT-3号下降了76.38％。
表12 4种存活基质对青枯病生防菌ANIT-8098A存活的影响
| 处理 | 保存初始活菌数(×108cfu/ml) | 保存终结活菌数(×108cfu/ml) | 存活率(％) |
| ANIT-1号 | 20.2 | 3.4 | 16.83 |
| ANIT-2号 | 18.4 | 1.2 | 6.52 |
| ANIT-3号 | 19.3 | 16.0 | 82.90 |
| ANIT-4号 | 20.5 | 15.3 | 74.63 |
三、不同配方的存活基质对青枯病生防菌ANIT-8098A防效的影响
试验在福建省福州市宦溪农场进行，选择往年青枯病严重的田块，于2000年9月7日在茄子4-5片真叶苗期开始用药，方法为药液浇灌根部。试验设4个处理，即4种配方生物杀菌剂(表11)，分别稀释至药液含菌量106cfu/ml，小区面积50m2，随机排列，各处理重复3次，以清水为对照。药后40天调查小区发病率，同时每小区取样10株，测量株高、叶片数、叶长、叶宽，调查植株生长情况。采用DPS数据处理系统进行Q型系统聚类分析，比较田间防治效果。
试验结果见表13。经4种不同配方存活基质的青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂处理小区的茄子发病率都与对照的差异显著(P＜0.05)，清水对照处理区的发病率为16.6％，生物杀菌剂处理区的发病率控制在4.3％以下，防效都可高达74％以上，其中以ANIT-3号的防治效果最好，校正防效达100％，次之为ANIT-1号和ANIT-2号，第三为ANIT-4号。
不同配方存活基质的青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂处理对植株生长有促进作用。茄子植株生长情况调查结果表明，4种ANIT制剂处理的茄子在叶宽、叶长、叶片数和株高上与清水对照相比都有不同程度的增长。另外田间观察还表明ANIT-3号处理小区的茄子植株健壮挺拔，生长一致，生长状况优于其它处理，可见ANIT-3号制剂的存活基质优于其它3种制剂。
表13 不同存活基质的生物杀菌剂ANIT-8098A制剂对茄子青枯病
的防治效果
| 处理 | 株高(cm) | 叶片数(片/株) | 叶长(cm) | 叶宽(cm) | 发病率(％) | 校正防效(％) |
| CK | 55.0a | 10.0a | 17.9a | 11.0a | 16.6a | 0.0 |
| ANIT-1号 | 60.0b | 10.6b | 18.7b | 11.4b | 2.0c | 88.0 |
| ANIT-2号 | 62.6b | 11.6c | 20.6c | 11.5b | 2.0c | 88.0 |
| ANIT-3号 | 64.2c | 10.7b | 20.2c | 11.2a | 0.0d | 100.0 |
| ANIT-4号 | 64.8c | 10.3a | 19.8b | 11.2a | 4.3b | 74.1 |
实施例9：
此实验为农业部农药登记田间药效试验。试验单位福建省农药检定所。
药物：用青枯病生防菌ANIT-8098A菌株经上述已知的工艺发酵，并经常规浓缩加工生产而得的生物杀菌剂。
1、试验条件
(1)试验地点、作物
试验在福州市晋安区新店战峰村的蔬菜地进行，试验地海拔33米，土层厚。土壤肥沃。茄子品种为农户自留种，5月18日移栽。每亩约2500株。在试验期内有用10％吡虫淋可湿性粉剂防治蚜虫和美洲斑潜蝇。
(2)防治对象
茄子青枯病。
(3)气象条件
试验期间以晴雨天为主，日平均温度23.0-32.4℃，最高温35.2-37.0℃，最低温21.5-29.1，相对湿度61-93％第一次施药当天无雨，第二次、第三次及第四次施药当天施药后3个小时后有小雨，雨量不大，持续时间短。无影响试验结果的恶劣气候条件。
2、试验设计与安排
(1)供试药剂
青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂
(2)试验设计(表14)
| 药剂 | 稀释倍数 |
| 青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂 | 100倍 |
| 青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂 | 300倍 |
| 青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂 | 500倍 |
| CK | 清水对照 |
共设5个处理，每处理4次重复，随机区组排列，每小区面积23平方米。
(3)施药时间、方法
6月5在茄子苗期，茄子处于7-8叶期，按设计剂量灌根，每次每株苗浇灌药液1公斤，隔20天灌根一次，一共四次。
3、结果调查
(1)调查时间、方法
最后一次药后14天、28天各调一次，调查每小区茄子的总株数、病株数和死株数。计算病死率和防效。
(2)试验结果
青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂100倍、300倍、500倍防治茄子青枯病第四次用药后14天的防效分别为86.42％、84.16％、62.33％，药后28天的防效分别为85.19％、85.14％、65.35％。
表15 青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂防治茄子青枯病药效调
查表(2001年6月福建福州)
| 处理 | 重复 | 第四次药后14天 | 第四次药后28天 | ||||||
| 总株数 | 病死株数 | 病死率(％) | 防效(％) | 总株数 | 病死株数 | 病死率(％) | 防效(％) | ||
| 青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂100倍 | 1 | 83 | 2 | 2.41 | 84.62 | 83 | 2 | 2.41 | 86.67 |
| 2 | 84 | 2 | 2.38 | 81.82 | 84 | 2 | 2.38 | 85.71 | |
| 3 | 81 | 2 | 2.47 | 81.59 | 81 | 3 | 3.70 | 78.31 | |
| 4 | 80 | 0 | 0.00 | 100.00 | 80 | 1 | 1.25 | 91.15 | |
| 青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂300倍 | 1 | 82 | 3 | 3.66 | 76.64 | 82 | 3 | 3.66 | 79.76 |
| 2 | 84 | 2 | 2.38 | 81.82 | 80 | 2 | 2.50 | 85.00 | |
| 3 | 80 | 0 | 0.00 | 100.00 | 82 | 0 | 0.00 | 100.00 | |
| 4 | 82 | 2 | 2.44 | 79.27 | 83 | 3 | 3.61 | 74.40 | |
| 青枯病生防菌ANIT-8098A生物杀菌剂500倍 | 1 | 83 | 3 | 3.61 | 76.92 | 83 | 5 | 6.02 | 66.67 |
| 2 | 83 | 5 | 6.02 | 54.00 | 84 | 5 | 5.95 | 64.29 | |
| 3 | 84 | 6 | 7.14 | 46.75 | 85 | 6 | 7.06 | 58.66 | |
| 4 | 85 | 3 | 3.53 | 70.00 | 81 | 3 | 3.70 | 73.77 | |
| 空白对照CK | 1 | 83 | 13 | 15.66 | 83 | 15 | 18.07 | ||
| 2 | 84 | 11 | 13.10 | 84 | 14 | 16.67 | |||
| 3 | 82 | 11 | 13.41 | 82 | 14 | 17.07 | |||
| 4 | 85 | 10 | 11.76 | 85 | 85 | 12 | 14.12 | ||
Claims (28)
1、青枯病生防菌菌株，其特征在于，该菌株为ANTI-8098A，于2001年12月11日保藏于“德国微生物保存中心(DSMZ)”，其保藏号为DSMID 01-1000，其微生物分类命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
2、根据权利要求1所述的青枯病生防菌菌株，其特征在于，其菌落形态特征为：菌落呈圆形，表面呈乳白色，中间微凸起且光滑，边缘半光滑且整齐；其细胞个体形态特征为：呈杆状，宽0.6-10um，长2.0-4.5um；其细菌的鞭毛特征为：直径0.02-0.03um；其芽孢及伴孢晶体的形态特征为：呈长椭圆型，周边长有鞭毛。
3、根据权利要求1所述的青枯病生防菌菌株，其特征在于，该青枯病生防菌菌株
V-P反应(Ph4.9)呈阳性，不产生吲哚；
甲基红反应、卵黄反应、明胶液化、石蕊牛奶胨化、淀粉水解、接触酶、精氨酸双水解酶、硝酸盐还原反应均呈阳性；
氧化酶呈阴性，不产生H2S；
产酸反应表现为：D-葡萄糖和D-果糖阳性，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-乳糖、D-甘露醇阴性；
分解特性上的特征表现为：酪蛋白、赖氨酸、柠檬酸钠、吐温80呈阳性，酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸钠、醋酸钠、水杨苷呈阴性。
4、青枯病生防菌供筛选菌株的采集方法，其特征在于，具有如下步骤：
(1)提供一种土壤，
(2)将一份土壤与九份无菌水(重量比)于玻璃器皿中混匀，
(3)将混合物振荡20min后静置20～30s，即得10-1稀释液，
(4)将一份10-1稀释液与九份无菌水(重量比)混匀而得10-2稀释液，以此类推，连续稀释而制得10-4稀释液、10-5稀释液、10-6稀释液，
(5)将10-4稀释液、10-5稀释液、10-6稀释液分别均匀涂抹于不同编号的培养基上，并于培养箱内培养，
(6)挑取乳白色、边缘光滑、表面微隆起的杆状单菌落供筛选使用。
5、根据权利要求4所述的青枯病生防菌供筛选菌株的采集方法，其特征在于，培养基配方为：牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、琼脂1.8％；pH为7.2；培养温度为30℃、培养时间为48h。
6、青枯病生防菌的筛选方法，其特征在于，步骤依序如下：
(1)提供一株供筛选菌株，
(2)将供筛选菌株点接于培养基上，
(3)将培养基置于30℃培养箱内培养48小时而成第一菌群，
(4)提供一种青枯病菌指示菌，
(5)将该指示菌配成浓度为107cfu/ml的悬液，
(6)将悬液喷布于第一菌群中，并于培养箱中培养48小时，
(7)观察菌落，抑菌圈大于2mm者为对青枯病菌具有拮抗作用的菌株。
7、青枯病生防菌的发酵生产方法，所用菌株为分离筛选而得的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)，具体步骤如下：
(1)提供一种青枯病生防菌菌种及装有第一培养基的若干玻璃器皿，
(2)将菌种接种到第一培养基上，经温度30℃、时间18h的活化培养而得菌种A，
(3)将菌种A与无菌水混匀制得悬液，
(4)提供一种种子罐及第二培养基，
(5)按5％的接种量将菌种A接种至装有第二培养基的种子瓶，并发酵12h而得种子液，
(6)提供一种发酵罐及第三培养基，
(7)将种子液移入装有第三培养基的发酵罐培养，温度28℃～31℃，时间24～48h，转速180r/m～220r/m，通气量15～40ml瓶装量。
(8)每隔8h提取菌液一次，观察菌液中的菌体数超过30×108个/ml即可放罐。
8、根据权利要求7所述的青枯病生防菌的发酵生产方法，其特征在于，第一培养基的配方为：牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、NaCl0.5％、琼脂2％、pH7.0。
9、根据权利要求7所述的青枯病生防菌的发酵生产方法，其特征在于，第二培养基、第三培养基的配方为：豆饼粉3.0～5.0％、玉米浆0.8～1.2％、玉米淀粉0.2～0.4％、蛋白胨0.2～0.4％、KH2PO40.06～0.07％、MgSO40.02～0.04％、CaCO30.2～0.3％；pH值为7.0～8.0。
10、根据权利要求9所述的青枯病生防菌的发酵生产方法，其特征在于，豆饼粉4.0％、玉米浆1.0％、玉米淀粉0.3％、蛋白胨0.3％、KH2PO40.07％、MgSO40.03％、CaCO30.1％。
11、一种纯生物菌株培养物，其特征在于，其具有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌的菌株。
12、一种纯生物菌株培养物，其要点在于，其具有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的突变体的所有鉴定特征。
13、纯生物菌株培养物，其要点在于，其包含有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌的菌株和具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
14、含有纯生物菌株培养物的生物农药，其要点在于，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
15、根据权利要求14所述的含有纯生物菌株培养物的生物农药，其特征在于，该生物农药还包含有载体。
16、根据权利要求14所述的含有纯生物菌株培养物的生物农药，其特征在于，该生物农药还包含有助剂。
17、根据权利要求14所述的含有纯生物菌株培养物的生物农药，其特征在于，该生物农药还包含有除保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或其突变体之外的至少一种化学或生物学杀虫剂。
18、从纯生物菌株培养物中分离而得的代谢物，其特征在于，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
19、第一生物杀菌剂，其特征在于，其含有从纯生物菌株培养物中分离而得的代谢物，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
20、根据权利要求19所述的第一生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂还包含有载体。
21、根据权利要求19所述的第一生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂还包含有助剂。
22、根据权利要求19所述的第一生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂还包含有除此代谢物之外的至少一种化学或生物学杀虫剂。
23、从纯生物菌株培养物中分离而得的上清液，其特征在于，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
24、第二生物杀菌剂，其特征在于，其含有从纯生物菌株培养物中分离而得的上清液，该生物菌株培养物或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鉴定特征的突变体，或同时具有保藏号为DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏号为DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鉴定特征的突变体。
25、根据权利要求24所述的第二生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂还包含有载体。
26、根据权利要求24所述的第二生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂还包含有助剂。
27、根据权利要求24所述的第二生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂还包含有除此上清液之外的至少一种化学或生物学杀虫剂。
28、预防或治疗植物青枯病菌的方法，其特征在于，其或应用有效剂量的生物农药，或应用有效剂量的第一生物杀菌剂，或应用有效剂量的第二生物杀菌剂。
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| CN 03132036 CN1570078A (zh) | 2003-07-11 | 2003-07-11 | 青枯病生防菌anti－8098a及其培养基、培养方法和生防应用 |
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2003
- 2003-07-11 CN CN 03132036 patent/CN1570078A/zh active Pending
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