CN116004466B - 防治向日葵菌核病的菌种、筛选方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物及其应用技术领域，具体涉及防治向日葵菌核病的菌种、筛选方法及应用;枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3，保藏编号为：CGMCC NO.23108,巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）TZ‑1，该菌保藏编号为CGMCC NO.22296;及两者形成的复合菌，本发明还公开了其应用方法；可以在向日葵进行生物防治应用，提升产量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及其应用技术领域，具体涉及防治向日葵菌核病的菌种、筛选方法及应用。
背景技术
向日葵，菊科向日葵属，一年生草本植物，向日葵菌核病，又称白腐病、烂盘病；作为一种积年发生的土传病害，这种病害在向日葵主产区里每年发病率在50%左右，严重时可达80%以上；向日葵菌核病是一种真菌性病害，病原为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum），主要由菌核萌发侵染引起。
核盘菌是一种兼性寄生真菌，子囊菌亚门，盘菌纲，核盘菌属，能在各种寄生中生存，对75科278属400余种植物均有较大的危害作用，使植物患菌核病，其中向日葵是最易感染的植物之一。向日葵从幼苗至成熟的整个生育期均可受核盘菌侵染发生菌核病。苗期发病以根腐为主，成株期各部位均可发病，茎、叶及花盘感病主要由子囊孢子侵染。
向日葵菌核病病原菌寄主广泛，抗逆性强，防治难度大；基于此，发明人筛选出防治向日葵菌核病的菌种。
发明内容
本发明的第一方面提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3分离自于2021年4月内蒙古农业大学植病实验室收集的JK601品种的向日葵种子，该菌命名为：KB3，并于2021年8月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京是朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名：Bacillus subtilis，保藏编号为：CGMCC NO.23108。
该菌株的生物学特征是：KB3呈乳白色，菌落偏干，边缘褶皱，菌株 KB3 能利用蔗糖、硫酸铵、丙二酸盐；能水解淀粉，过氧化酶反应阳性。
本发明的第二方面提供一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1；
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1分离自：于2020年5月从内蒙古农业大学新区试验地采集的紫花苜蓿：该菌命名为：TZ-1，并于2021年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京是朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名：Bacillus megaterium，保藏编号为：CGMCC NO.22296。
该菌株的生物学特征是：TZ-1呈乳白色，湿润，平滑；TZ-1对葡萄糖、甘露醇、麦芽糖和果糖这几种碳源利用较好，对硫酸铵、L-甲硫氨酸、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵和组氨酸这几种氮源利用较好；且能利用丙二酸盐，能水解淀粉，过氧化酶反应阳性。
依据《InterantionaLJournaLof Systematic and Evolutionary Microbiology》对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1做特性实验，两株菌株的生理生化测定结果如下表
表1 菌株KB3的生理生化测定结果
通过下述方法，可以分离的到具有能够抑制核盘菌的菌株；
首先进行菌株分离
S101获取待筛选菌株附着体并洗净；
S102用75%乙醇浸泡1min，3%次氯酸钠浸泡3min，进行表面消毒，浸泡过程中不停摇晃；
S103将上述处理过的待筛选菌株附着体使用无菌水冲洗3次后，获得表面无菌的待筛选菌株附着体；
S104将S3获得的待筛选菌株附着体与100mL灭菌后的无菌水，在无菌条件下置于灭菌后的破壁机内，研磨打碎成悬浮液；
S105用移液器吸取1mL悬浮液，进行101-104梯度稀释；
S106将梯度稀释的匀浆吸取100微升，均匀涂布LB固体培养基上；28℃培养7天；LB培养基的溶剂为无菌水，溶质为蛋白胨，酵母，NaCl
S107通过划线法纯化获得各个内生细菌的单克隆；
培养过程中，依据菌落大小、颜色及表面形态去除肉眼可见的重复，挑取单菌落后进一步采用四分划线法在相应的培养基上纯化并扩大培养，不断挑取新长出的菌株至新的培养基，通过多次划线纯化最终得多种附着的单独菌株的培养基；
S108将纯化菌株在相应的液体培养基活化24h后，用40%（体积分数）的甘油作为保护剂于-20℃作长期保存；
其次将上述获取的菌株的进行初筛，采用盆栽试验初步筛选生防菌株；
S201获取核盘菌病部组织，取样组织处理后经形态观察分离得到核盘菌；
S202核盘菌菌核经清洗简单消毒处理后用研磨机打碎至粉末；
S203田间取土筛土后重量比按4:1与蛭石混合拌匀；
S204容器内加土至距离杯口3cm处，将核盘菌菌核打碎后称量核盘菌粉末0.7g铺于120g土上，再覆上2cm的土，浇水浇透不漫过土表，后覆保鲜膜放置两天；
两天后，土表有菌丝出现，将向日葵种子种尖向下插入土中，每个容器内土壤120g并播种三粒向日葵种子；
S205将上述获得的单独菌株活化后的菌液稀释十倍分别加入容器内50mL，。
进行两轮实验，三次重复，观察记录实验结果。
S206筛选存活的植株,存活植株的对应喷淋的菌种可以抑制核盘菌发病。
将上述获取的菌株的进行复筛，采用向日葵离体叶片接菌方式对初步筛选得到的菌株进行复筛
S301挑取筛选出的菌株的单菌落分别接种于在30mLLB液体培养基中，28℃、180r/min恒温振荡培养3天；取培养液稀释十倍得到生防菌液11mL加入小喷壶内；
S302挑取叶龄一致、长势一致的向日葵真叶，用无菌水冲洗后喷壶内菌液喷湿叶片与滤纸，放于组培架上2天后待叶片晾干；
S303将生长旺盛的向日葵菌核病菌（核盘菌）和黄萎病病菌（大丽轮枝菌）的菌饼分别接种于叶片，每片叶片上接两个菌饼，每皿2片真叶，3次重复
S304筛选出兼具核盘菌、大丽轮枝菌抗性的菌株；
通过上述方法，筛选出兼具核盘菌、大丽轮枝菌抗性的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1。
同时，本申请还提出一种对向日葵菌核病和黄萎病具有防治效果的复合菌发酵液，具体制备方法如下
将筛选获得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1菌株进行纯化之后分别接种到体积为50mL的LB液体培养基中，放置在摇床中在28℃，180rpm条件下对菌液进行摇培24小时；
将上述单独菌液转接到体积为200mL的LB液体培养基放置在摇床中，在28℃，180rpm条件下对复合菌菌液进行摇培24小时；
将200mL复合菌菌液作为种子液混合接种到体积为10L的发酵罐中，进行发酵；
转速300rpm, 温度28℃，溶氧量10%，发酵24小时之后收集发酵液，获得对向日葵菌核病和黄萎病具有防治效果的复合菌发酵液。
本发明所达到的有益效果为：本发明通过核盘菌、大丽轮枝菌对植株品质的影响筛选出具有兼具核盘菌、大丽轮枝菌抗性的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1；将本发明菌种作为生物防治制剂用于向日葵播种，经检验，菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1形成的复合菌剂对向日葵菌核病和黄萎病具有防治效果。
附图说明
图1是本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1在培养基上的菌落形态图。
图2是本发明的含核盘菌的病土的制作示意图。
图3是本发明的初筛具有抑制核盘菌植株示意图。
图4是本发明的复筛枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3示意图。
图5是本发明的复筛巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1示意图。
图6是本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1的拮抗示意图。
图7是本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、对核盘菌的拮抗作用示意图。
图8是本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对大丽轮枝菌的拮抗作用示意图。
图9是本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3的挥发性物质对核盘菌的抑制示意图。
图10是本发明室内盆栽检测对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1及复合菌对向日葵黄萎病的防治效果示意图。
图11是本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3在田间应用图。
图12是本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3大田条件下对向日葵黄萎病防治效果表。
图13是本发明的本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3大田条件下对向日葵菌核病防治效果表。
具体实施方式
为便于本领域的技术人员理解本发明，下面结合附图说明本发明的具体实施方式。
下面实施例中的实验方法，如无特别说明，均为本领域常规试验方法方法。
实施例一、分离筛选本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3，具体方法如下：
首先进行菌株分离
S101于2021年4月取内蒙古农业大学植病实验室JK601品种的向日葵品种子30粒，将向日葵种子剥去皮壳分离后，将种仁冲洗干净；
S102用75%乙醇浸泡1min，3%次氯酸钠浸泡3min，进行表面消毒，浸泡过程中不停摇晃；
S103将上述处理过的种仁使用无菌水冲洗3次后，获得表面无菌的种仁；
S104后于无菌条件下内加入100mL灭菌后的无菌水与处理后的种仁，研磨打碎成悬浮液；
S105用移液器吸取1mL悬浮液，进行101-104梯度稀释；
S106将梯度稀释的匀浆吸取100微升，分别单独用刮筛涂布在LB固体培养基上，28℃培养7天；其中LB培养基的溶剂为无菌水，溶质为蛋白胨，酵母，NaCl；
S107通过划线法纯化获得各个内生细菌的单克隆；
培养过程中，依据菌落大小、颜色及表面形态去除肉眼可见的重复，挑取单菌落后进一步采用四分划线法在相应的培养基上纯化并扩大培养，不断挑取新长出的菌株至新的培养基，通过多次划线纯化最终得40株细菌、4株真菌的单独菌株的培养基；
S108将纯化菌株在相应的LB液体培养基活化24h后，用20%（体积分数）的甘油作为保护剂于-20℃作长期保存；
其次将上述获取的菌株的进行初筛，采用盆栽试验初步筛选生防菌株；
如图2所示，S201在发生菌核病的田间将具有典型症状的病部组织取样，取样组织处理后经形态观察分离得到核盘菌；
S202核盘菌菌核经清洗简单消毒处理后用研磨机打碎至粉末；
S203田间取土筛土后重量比按4:1与蛭石混合拌匀；
S204实验组的盆栽，纸杯内加土至距离杯口3cm处，将核盘菌菌核打碎后称量核盘菌粉末0.7g铺于120g土上，再覆上2cm的土，浇水浇透不漫过土表，后覆保鲜膜放置两天；
对照组CK纸杯内加土至距离杯口3cm处，将核盘菌菌核打碎后称量核盘菌粉末0.7g铺于120g土上，再覆上2cm的土，浇水浇透不漫过土表，后覆保鲜膜放置两天。
两天后，土表有菌丝出现，将向日葵种子种尖向下插入土中，每个纸杯内土壤120g并播种三粒向日葵种子；
S205实验组盆栽将LB活化后的菌液稀释十倍分别加入纸杯50mL，做好标记出菌株编号与播种时间；对照组CK盆栽加入与菌液同体积清水。
进行两轮盆栽实验，三次重复，观察记录实验结果。
S206筛选存活的植株,如图3所示，对照组CK植株发病，田间生防菌无效不能阻止核盘菌致病；KB3菌株及其余两株菌株可以对应的植株可以抑制核盘菌发病。
将上述获取的菌株的进行复筛，采用向日葵离体叶片接菌方式对初步筛选得到的菌株进行复筛
S301挑取筛选出的KB3菌株及其余两株菌株的单菌落分别接种于在30mLLB液体培养基中，28℃、180r/min恒温振荡培养3d。取培养液稀释十倍得到生防菌液11mL加入小喷壶内；
S302挑取叶龄一致、长势一致的向日葵真叶，用无菌水冲洗后喷壶内菌液喷湿叶片与滤纸，放于组培架上2d后待叶片晾干；
S303将生长旺盛的向日葵菌核病菌（核盘菌）和黄萎病病菌（大丽轮枝菌）的菌饼分别接种于叶片，每片叶片上接两个菌饼，每皿2片真叶，3次重复；以未喷菌液的叶片作空白对照CK1，在菌核病接种试验中以喷腐霉利药剂的叶片作药剂对照CK2；
S304筛选出兼具核盘菌、大丽轮枝菌抗性的菌株；
如图4所示，观察病斑扩展情况；空白对照CK1被侵染叶片枯黄，药剂对照CK2没有被侵染；KB1菌株、KB2菌株对应的植株叶片枯黄被侵染；KB3菌株的对应的植株没有被侵染；
通过上述方法，筛选出兼具核盘菌、大丽轮枝菌抗性的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3；图1右侧示出的为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3在培养基上的菌落形态图。
实施例二、分离筛选本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1，具体方法如下：
与实施例一不同的是，本实施例的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1分离筛选自2020年5月从内蒙古农业大学新区试验地采集的苜蓿,将材料剪成段；其余筛选步骤相同；划线法纯化获得最终得144株细菌、3株真菌的单独菌株的培养基；其次将144株细菌、3株真菌进行初筛，之后采用向日葵离体叶片接菌方式对初步筛选得到的菌株进行复筛，如图5所示，观察病斑扩展情况，空白对照CK1被侵染叶片枯黄、药剂对照CK2没有被侵染；菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对应的植株没有被侵染；
筛选出兼具核盘菌、大丽轮枝菌抗性的菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1；
图1左侧示出的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1在培养基上的菌落形态图。
实施例三、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1复合菌的构建
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1两个菌株划线在同一个LB固体培养基上，相互之间有交叉，放置在28℃条件下进行培养48小时，根据两个菌株在交叉处是否有相互抑制现象判断菌株之间是否有拮抗效果；如图6所示，试验发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1两个菌株之间能够较好的融合，无明显的拮抗现象；因此确定两个菌株可以进行复合使用。
复合菌的发酵
将筛选获得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1菌株进行纯化之后分别接种到体积为50mL的LB液体培养基中，放置在摇床中在28℃，180rpm条件下对菌液进行摇培24小时；
将上述单独菌液转接到体积为200mL的LB液体培养基放置在摇床中，在28℃，180rpm条件下对复合菌菌液进行摇培24小时；
将200mL复合菌菌液作为种子液混合接种到体积为10L的发酵罐中，进行发酵；
转速300rpm, 温度28℃，溶氧量10%，发酵24小时之后收集发酵液，获得对向日葵菌核病和黄萎病具有防治效果的复合菌发酵液。
试验一、研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对核盘菌和大丽轮枝菌是否有拮抗作用
具体一：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对核盘菌的拮抗作用试验
在PDA培养基中对核盘菌单独培养，将核盘菌活化之后打直径大小为5mm的菌饼，转移至PDA培养基的中央，然后在它们的周围等距离放置KB3三个细菌菌株的菌饼作为第一实验组，核盘菌置于PDA培养基的中央，然后在它们的周围等距离放置TZ-1三个细菌菌株的菌饼作为第二实验组；核盘菌置于PDA培养基的中央作为对照组CK；
将实验组和对照组培养基放置在28℃温箱中进行培养一周，实验结果如图7所示，对照组被核盘菌侵染；实验组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3对核盘菌有直接拮抗效果，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对核盘菌没有直接拮抗效果。
具体二：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对大丽轮枝菌的拮抗作用试验
在PDA培养基中对大丽轮枝菌单独培养，将大丽轮枝菌活化之后打直径大小为5mm的菌饼，转移至PDA培养基的中央，然后在它们的周围等距离放置枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3细菌菌饼、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1细菌菌饼和GF-46细菌菌饼作（对大丽轮枝菌具有拮抗作用的菌饼）为实验组，大丽轮枝菌置于PDA培养基的中央作为对照组CK；
将实验组和对照组培养基放置在28℃温箱中进行培养一周。实验结果如图8所示，对照组被核盘菌侵染；实验组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对大丽轮枝菌没有直接拮抗效果。
结论：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对核盘菌、大丽轮枝菌没有直接拮抗作用但是，它在盆栽中对核盘菌、大丽轮枝菌有很好的防效，是通过诱导抗病的方式来实现抗病；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3对核盘菌通过直接拮抗的方式来抗病，对大丽轮枝菌没有直接拮抗作用；它在盆栽中对大丽轮枝菌有很好的防效，是通过诱导抗病的方式来实现抗病。
试验二、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3的挥发性物质对核盘菌的抑制作用试验
在有隔培养皿中倒入液体PDA培养基，在其中一个隔室中接种核盘菌的菌饼，在另外一个隔室中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3菌株作为实验组；另外一个隔室中不做任何处理作为对照组CK；将培养皿防治在28℃恒温进行培养一周，观察隔室中菌核的形成数量、颜色和硬度；如图9所示，经过分析发现KB3菌株能够减少核盘菌菌核的数量，使菌核的颜色变浅，硬度降低，分皿试验证明KB3的挥发性物质抑制菌核的形成。
试验三、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1菌株两个单独菌株和复合菌在温室条件盆栽条件下对菌核病和黄萎病的防效验证试验
S1获取核盘菌菌株、大丽轮枝菌菌株；
S2核盘菌菌核、大丽轮枝菌菌核分别经清洗简单消毒处理后用研磨机打碎至粉末；
S3田间取土筛土后重量比按4:1与蛭石混合拌匀；
S4实验组的盆栽，将核盘菌菌核、大丽轮枝菌菌核打碎后，分别称量核盘菌粉末0.7g铺于120g土上，再覆上2cm的土，浇水浇透不漫过土表，后覆保鲜膜放置两天，分别制成核盘菌与大丽轮枝菌的菌土；
两天后，土表有菌丝出现，将向日葵种子种尖向下插入土中，每个盆栽内土壤120g并播种三粒向日葵种子；
S5实验组盆栽将LB活化后的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1和复合菌菌液，稀释十倍分别加入含大丽轮枝菌的菌土盆栽；将上述各菌液分别加入含核盘菌的菌土盆栽，对照组CK盆栽加入与菌液同体积清水。
图10示出的是对向日葵黄萎病的防治效果图，对照组CK盆栽中的向日葵幼苗发生黄萎病的症状，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1和复合菌后，没有向日葵黄萎病没有出现症状；盆栽试验结果统计如下表2所示；
表2生防菌对盆栽苗向日葵菌核病和黄萎病的防治效果表
| 处理 | 接入病原菌 | 病情指数 | 防治效果/ % |
| TZ-1 | 核盘菌 | 12.62±0.42b | 77.85 |
| KB3 | 核盘菌 | 11.69±0.11bc | 79.47 |
| 复合菌 | 核盘菌 | 9.84±0.23d | 82.72 |
| CK | 核盘菌 | 56.94±1.40a | - |
| TZ-1 | 大丽轮枝菌 | 23.96±1.30b | 54.46 |
| KB3 | 大丽轮枝菌 | 17.19±1.80c | 67.47 |
| 复合菌 | 大丽轮枝菌 | 14.58±0.52d | 72.28 |
| CK | 大丽轮枝菌 | 52.60±2.08a | - |
试验四、复合菌菌剂处理向日葵室外大田试验
如图11所示，将实施例三得到的复合菌发酵液7L倒入5kg麸皮中进行混拌；
将带有菌液的麸皮与田间土按照体积1:2的比例进行混合拌匀；
将混合物在向日葵种子播种后覆盖种穴。
采用两年多地多品种试验验证复合菌菌剂在大田条件下对菌核病和黄萎病的防效；在巴彦淖尔市乌拉特前旗2021年5月28日播种向日葵，向日葵品种：LD5009，2021年9月19日收获，亩株数1900株，行距70cm柱距50cm；在乌兰察布市玫瑰营镇2021年6月7日播种向日葵，向日葵品种：同辉15号，收获日期2021年9月30日，亩株数1200株；
收获前分别调查菌核病和黄萎病的病情指数，收获后进行向日葵测产比较，分析复合菌菌剂的防病和增产效果；
如图12所示，使用复合菌菌剂对向日葵黄萎病的防效为51.05%，而且增产效果为33.46%。
如图13所示，使用复合菌菌剂的向日葵根腐型菌核病的发病率为2.3%，对照处理的发病率为14.9%防效84.5%。（证明对向日葵根腐型菌核病的防效好）
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (7)
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：Bacillussubtilis，保藏编号为：CGMCC NO.23108。
2.权利要求1所述的一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3对向日葵进行生物防治中的应用，该菌株能够防治向日葵菌核病，或该菌株能够防治向日葵黄萎病。
3.一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：Bacillus megaterium，保藏编号为CGMCCNO.22296；该菌株能够应用于向日葵进行生物防治中。
4.权利要求3所述的一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1对向日葵进行生物防治中的应用，该菌株能够防治向日葵菌核病，或该菌株能够防治向日葵黄萎病。
5.一种复合菌，其特征在于：通过权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KB3，及
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1复合形成，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)TZ-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：Bacillus megaterium，保藏编号为CGMCC NO.22296。
6.一种权利要求5所述复合菌制备生物防治制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将筛选获得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)TZ-1菌株进行纯化之后分别接种到体积为50mL的LB液体培养基中，放置在摇床中在28℃，180rpm条件下对菌液进行摇培24小时；
将上述单独菌液转接到体积为200mL的LB液体培养基放置在摇床中，在28℃，180rpm条件下对复合菌菌液进行摇培24小时；
将200mL复合菌菌液作为种子液混合接种到体积为10L的发酵罐中，进行发酵；
转速300rpm,温度28℃，溶氧量10％，发酵24小时之后收集发酵液，获得对向日葵菌核病和黄萎病具有防治效果的复合菌发酵液。
7.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KB3或包括巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)TZ-1，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名：Bacillus megaterium，保藏编号为CGMCC NO.22296或包括权利要求5所述的复合菌。
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