CN109251873A - 一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：备选芽胞杆菌分离培养准备,对土壤芽孢杆菌分离纯化培养，或已经获得了分离纯化芽孢杆菌菌株；桉树青枯病原菌的培养及菌培养液的制备；在桉树青枯病菌株培养液基础上加入刃天青盐指示剂，加入各种待测芽孢杆菌样品以建立桉树青枯病病菌混合培养体系；并进行培养12小时；对培养后的桉树青枯病混合培养体系的图像进行颜色特征R值提取；通过对照组和处理组的分析比较以确定测试菌株拮抗桉树青枯病的能力以筛选高效拮抗的芽孢杆菌生防菌。本方法操作简便，无需要进行营养平板上进行桉树青枯病病原菌进行对峙培养，可以快速、高效地筛选出具有拮抗的桉树青枯病的芽孢杆菌。

Description

一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法
技术领域
本发明涉及林业生物防治领域，具体涉及一种拮抗桉树青枯病的 芽孢杆菌的筛选方法。
背景技术
桉树是我国南方速生丰产商品林的重要树种，广东、广西及海南 三省是我国桉树人工商品林主产区，种植面积达440万hm2，占我国 桉树人工林总面积的76％。青枯病(Bacterialwilt)是由劳尔氏菌 (Ralstoniasolanacearum)引起的青枯病是一种土传病害，因具有 遗传多样性,其寄主、地理分布、致病性以及生物型均有差异，植株 一旦感病，很难防治。桉树青枯病是我国桉树人工林生产的重要病害， 随着桉树人工林的不断增加，青枯病的发生日趋严重，已成为当前发 展桉树生产的主要障碍之一。青枯病危害严重且控制难度较大，利用 有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物以达到控制植物病害的 目的，是一种绿色、环保的防治方法,因此应用高效拮抗微生物是预 防桉树青枯病发生的有效手段之一。
刃天青是氧化还原反应的指示剂,由于其的氧化态和还原态具有 不同的颜色。当溶液中滴定体系电对的点位改变时，指示剂电对的浓 度也发生改变，因而引起溶液颜色变化。当有溶液中有细菌等微生物 生长繁殖时,其代谢能使刃天青还原，并发生不可逆的颜色改变,从蓝 紫色→红紫色→淡红紫色→粉红色→淡粉红色→白色的颜色变化,很 容易监控或被监控到。根据刃天青的颜色变化判断是否有微生物代谢 活动。
常规拮抗菌的筛选过程比较繁杂，一般来说，拮抗菌的筛选首 先需要对采集来的样品系列稀释后在营养平板上涂布培养，然后把平 板上生长出来的所有细菌一一挑取后在另一个营养平板上纯化，纯化 后再把细菌一一接种到另一种营养平板上和病原菌进行对峙培养，通 过对所有细菌进行拮抗能力的测定最终筛选到拮抗微生物，由于土壤 和植株中微生物种类繁多，而拮抗菌所占的比例又非常少，而且平板 上的好多细菌是同一个菌株，但是依靠菌株形态很难判断是不是同一 个菌，所以在分离细菌、细菌纯化和对峙培养过程需要大量的培养基 和大量的分离、纯化和拮抗能力测定的工作。正是由于这种筛选方法 过程繁琐，效率低，造成没有更多的时间和精力进行广泛的样品采集， 以增加拮抗菌筛选的范围，从而提高筛选到高效拮抗菌的可能性。
传统的芽胞杆菌生防菌筛选方法多是以纯化好的菌株然后与筛 选的微生物进行平板共培养的对峙试验，以确定是否存在抑菌圈，通 过对所有细菌进行拮抗能力的测定最终筛选到拮抗微生物，由于土壤 中微生物种类繁多，而拮抗菌所占的比例又极少，所以在分离细菌、 细菌纯化和对峙培养过程需要作大量的培养基和大量的分离、纯化和 拮抗能力测定等工作。因此采用传统的的这种生防菌筛选方法工作量 大，费时费力，效率低。
发明内容
本发明的目的在于针对传统拮抗桉树青枯病芽孢杆菌筛选繁琐 且效率较低的难题，提供一种拮抗桉树青枯病病菌快速筛选方法，解 决了拮抗桉树青枯病病菌大规模筛选工作量大、时间长的问题。本发 明采用刃天青作为指示剂添加在芽孢杆菌与桉树青枯病病菌混合培 养体系，通过培养后，以常见的数码相机获得其反应体系的图像，通 过提取图像颜色特征和参数比较筛选拮抗菌株。该方法反应体系小、 节省材料时间，且筛选准确率高，为拮抗桉树青枯的芽孢杆菌大规模 筛选提供一条快捷有效的途径。
主要是通过土壤微生物芽孢杆菌与桉树青枯病病原菌相互作用 时的竞争作用及抗生作用等相结合，在较小的培养体系中通过指示剂 颜色反应出芽孢杆菌不同拮抗情况。
发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括 以下步骤：
(1)备选芽胞杆菌分离培养准备
称取土壤样品配成10-1浓度(g/mL)，作为土壤悬液原液；土壤悬 液稀释为10-4-10-5浓度梯度，置于100℃水浴中3～5分钟后,灭活营 养细胞,保留芽孢。配置好芽胞杆菌分离培养基，倒平板,凝固后静置 1h，采用稀释平板涂布法吸取土壤悬液涂布到芽孢杆菌培养平板，放 入恒温箱中培养24h；
(2)桉树青枯病原菌的培养及培养液的制备
以取样环取一环已纯化的桉树青枯病菌株，划线于CPG培养基 中，培养后取流动性强的菌株扩大培养36-48h后，无菌水洗下菌体， 离心，去除上清液，含有无菌水梯度稀释后平板计数，然后用稀释 100倍的无菌培养液配成配成108cfu·mL-1培养液保存备用；
(3)桉树青枯病病菌混合培养体系建立
所述的桉树青枯病病菌混合培养体系为108cfu·mL-1的青枯病病 原菌培养液，加入0.01％刃天青盐溶液，加入不同来源的测试的芽 孢杆菌菌液，所述青枯病病原菌培养液、刃天青盐溶液、芽孢杆菌菌 液的体积比为20:1:1；
(4)桉树青枯病病菌混合培养：充分摇匀各处理组混合培养体系， 至恒温培养12h；
(5)桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取
观察培养液的颜色：将不同的处理组培养管按照组平放至白色背 景下，使光照均匀，使用图像设备获取图像参数，利用是图像软件提 取每个处理组合的培养溶液中典型颜色的RGB特征的R值；
(6)拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选
筛选桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取颜色特征 的R值，通过对照比较统计分析确定处理组是否存在着差异。
进一步地，CPG培养基为水解酪蛋白1g/L，蛋白胨10g/L，葡萄 糖5g/L，琼脂17g/L，调节pH值6.5-7.0。
进一步地，所述无菌培养液为去琼脂的CPG培养液。
进一步地，所示图像设备获取图像参数可以使用用相机在体系中 心的拍照，当处理组量大时可以固定相机和拍照参数或专业图像设备 获取图像参数。
进一步地，所述步骤1和4中的恒温箱的温度为35℃。
本发明的拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其包括以下步 骤
(1)备选芽胞杆菌分离培养准备
称取10g土壤样品至装有90mL无菌水的三角瓶，振荡 20min,80℃水浴10min，水浴期间摇匀2-3次，使之水浴充分，即配 成10-1浓度，作为土壤悬液原液。土壤悬液稀释为10-4-10-5浓度梯度， 采用稀释平板涂布法吸取l00μL土壤悬液涂布到事先倒好芽孢杆菌 培养平板(培养基)。将涂好的平板下放静置1h，放入35℃恒温箱中 培养24h培养后可以观察到合适数量的芽孢杆菌菌落。
(2)桉树青枯病原菌的培养及培养液的制备
选择现有的桉树青枯病病原菌或采集来源于的桉树病株青枯病 典型症状的茎叶根并经形态学以及分子鉴定的的病原菌(确定为 Ralstoniasolanacearum)。对桉树青枯病原菌菌株进行活化培养。
超净工作台内取一环已纯化的桉树青枯病菌株，划线于CPG培养 基(水解酪蛋白1g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂17g/L，调 节pH值6.5-7.0)中，30℃培养24h后取流动性强的菌株扩大培养 36-48h后，无菌水洗下菌体，10000×g离心10min，去除上清液， 含有无菌水梯度稀释后平板计数，然后用稀释100倍的无菌培养液 (去琼脂的CPG培养液)配成配成108cfu·mL-1培养液保存备用。
(3)桉树青枯病病菌混合培养体系建立
称取适量刃天青盐加双蒸水(ddH2O),配置成0.01％的刃天青盐 溶液备用。
取培养好的芽孢杆菌菌落菌饼(6mm)，加10mL无菌水,混匀后配 成芽孢杆菌液，并将稀释成10-5-10-6芽孢杆菌菌液。
根据实际情况设置2个以上不同处理组合，至少含有一个对照组 和处理组，每个组至少5以上个重复(管)，反应体系为5mL的洁净、 有盖的菌种保存管/或透明的离心管(保障管内微生物能进行有氧代 谢)。具体为：
对照组：取5mL的菌种保存管/或透明的离心管，分别加入2mL 的108cfu·mL-1的青枯病病原菌培养液，然后每管分别加入0.1mL的刃 天青盐溶液，其后再加入0.1mL的双蒸水(ddH2O)。
处理组：取5mL的菌种保存管/或透明的离心管，分别加入2mL 的108cfu·mL-1的青枯病病原菌培养液，然后每管分别加入0.1mL的 0.01％刃天青盐溶液，其后再加入0.1mL的不同备选的芽孢杆菌菌 液。
(4)桉树青枯病病菌混合培养
充分摇匀各处理组混合培养体系，至35℃恒温培养培养12h。
(5)桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取
观察培养液的颜色：将不同的处理组培养管按照组平放至白色背 景下，使光照均匀，用相机在体系中心的拍照，如果处理组量大时， 可以固定相机和拍照参数或专业图像设备获取图像参数，利用是图像 软件(如Photoshop、Sigmascan5.0pro)，提取每个处理组合的培养 溶液中典型颜色的RGB特征的R值。
(5)拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选
通过获得的对照组和处理组比较确定筛选桉树青枯病病菌混合 培养体系图像颜色特征提取颜色特征的R值，通过与对照比较统计分 析确定处理组是否存在着差异。
本发明一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，是在发明人 前期研究的基础上，利用的刃天青氧化代谢指示剂的优点，建立芽孢 杆菌生防菌混合系统以及筛选和优化参数，培养后，以数码相机获得 其混合培养的体系的后图像，通过获取培养体系中图像颜色特征和参 数比较筛选，确定存在着拮抗桉树青枯病病原菌的芽孢杆菌生防菌， 提高芽孢杆菌生防菌筛选效率，具有重要的实用价值。
说明书附图
图1土壤分离培养的芽孢杆菌菌落形态。
图2对照组CK的图像拍摄照片。
图3处理组T1的图像拍摄照片。
图4处理组T2的图像拍摄照片。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明 白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
本具体实施方式采用以下技术方案：一种拮抗桉树青枯病的芽孢 杆菌的筛选方法，
(1)备选芽胞杆菌分离培养准备
称取10g土壤样品至装有90mL无菌水的三角瓶，振荡20min,80℃ 水浴10min，水浴期间摇匀2-3次，使之水浴充分，即配成10-1浓度， 作为土壤悬液原液。土壤悬液稀释为10-4-10-5浓度梯度，采用稀释平 板涂布法吸取l00μL土壤悬液涂布到事先倒好芽孢杆菌培养平板 (培养基)。将涂好的平板下放静置1h，放入35℃恒温箱中培养24h 培养后可以观察到合适数量的芽孢杆菌菌落。
(2)桉树青枯病原菌的培养及培养液的制备
选择现有的桉树青枯病病原菌或采集来源于的桉树病株青枯病 典型症状的茎叶根并经形态学以及分子鉴定的的病原菌(确定为 Ralstoniasolanacearum)。对桉树青枯病原菌菌株进行活化培养。
超净工作台内取一环已纯化的桉树青枯病菌株，划线于CPG培养 基(水解酪蛋白1g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂17g/L，调 节pH值6.5-7.0)中，30℃培养24h后取流动性强的菌株扩大培养 36-48h后，无菌水洗下菌体，10000×g离心10min，去除上清液， 无菌水梯度稀释后平板计数，然后以稀释100倍的无菌培养液(去琼 脂的CPG培养基)配成108cfu·mL-1菌液含有保存备用。
(3)桉树青枯病病菌混合培养体系建立
称取适量刃天青盐加ddH2O,配置成0.01％的刃天青盐溶液备用。
取培养好的芽孢杆菌菌落菌饼(6mm)，加10mL无菌水,配成芽孢 杆菌液，并将稀释成10-5倍芽孢杆菌菌液。
根据实际情况设置选择2个不同拮抗强度的拮抗的芽孢杆菌1 (强拮抗)和芽孢杆菌2(弱拮抗)以及设置对照，每个组5个重复， 反应体系为5mL的洁净、有盖的透明的一致的菌种保存管。具体配置 为：
对照组CK：取5mL的菌种保存管/或透明的离心管，分别加入2mL 的108cfu·mL-1的青枯病病原菌培养液，然后每管分别加入0.1mL的刃 天青盐溶液，其后再加入0.1mL的双蒸水(ddH2O)。
处理组T1：取5mL的透明的菌种保存管/或透明的离心管，分别 加入2mL的108cfu·mL-1的青枯病病原菌菌悬液，然后每管分别加入 0.1mL的0.01％刃天青盐溶液，其后再加入稀释成10-5倍0.1mL的具 强拮抗的芽孢杆菌1菌液。
处理组T2：取5mL的透明的菌种保存管/或透明的离心管，分别加入 2mL的108cfu·mL-1的青枯病病原菌培养液，然后每管分别加入0.1mL 的0.01％刃天青盐溶液，其后再加入稀释成10-5倍的0.1mL弱拮抗的 芽孢杆菌2菌液。
表1.不同处理桉树青枯病病菌混合培养体系及其颜色
(4)桉树青枯病病菌混合培养
充分摇匀各处理组混合培养体系，至35℃恒温培养培养12h。
(5)桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取
得到观察培养液的颜色，将不同的处理组培养管按照组平放至白 色背景下，使光照均匀，用相机在体系中心的拍照，获取各处理组的 图像如表1，利用是图像软件(Sigmascan 5.0pro)提取每个处理组合 的培养溶液中典型颜色的RGB特征的R值，结果如表1，其中CK、处 理组T1和T2均呈现为不同程度的粉红色。
(6)拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选
通过获得的对照组和处理组比较确定筛选桉树青枯病病菌混合 培养体系图像颜色特征提取颜色特征RGB值，其中R值，CK组R值 平均为136，而具强拮抗的芽孢杆菌1处理组T1的R值平均为为152 和具弱拮抗的T2呈现为142。分别对各处理组进行方差分析，发现3处理组的R值在组间在0.05水平上差异显著。
表2.不同处理桉树青枯病病菌混合培养体系及其颜色
项目 变异源 SS df MS F值 P值
R值 处理间 104.1312 2 52.06559 4.116261 0.0435
残差 151.7851 12 12.64876
G值 处理间 63.5147 2 31.75735 1.529192 0.2561
残差 249.2089 12 20.7674
B值 处理间 67.00118 2 33.50059 2.094066 0.1659
残差 191.9744 12 15.99787
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本 行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施 例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和 范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落 入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (5)

1.一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)备选芽胞杆菌分离培养准备
称取土壤样品配成10-1g/mL浓度，作为土壤悬液原液；土壤悬液稀释为10-4-10-5g/mL浓度梯度，置于100℃水浴中3～5分钟后,灭活营养细胞,保留芽孢，配置好芽胞杆菌分离培养基，倒平板,凝固后静置1h，采用稀释平板涂布法吸取土壤悬液涂布到芽孢杆菌培养平板，放入恒温箱中培养24h；
(2)桉树青枯病原菌的培养及培养液的制备
以取样环取一环已纯化的桉树青枯病菌株，划线于CPG培养基中，培养后取流动性强的菌株扩大培养36-48h后，无菌水洗下菌体，离心，去除上清液，含有无菌水梯度稀释后平板计数，然后用稀释100倍的无菌培养液配成配成108cfu·mL-1培养液保存备用；
(3)桉树青枯病病菌混合培养体系建立
所述的桉树青枯病病菌混合培养体系为108cfu·mL-1的青枯病病原菌培养液，加入0.01％刃天青盐溶液，加入不同测试来源的芽孢杆菌菌液制备得到；所述青枯病病原菌培养液、刃天青盐溶液、芽孢杆菌菌液的体积比为20:1:1；
(4)桉树青枯病病菌混合培养：充分摇匀桉树青枯病病菌混合培养体系，恒温培养12h；
(5)桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取
观察培养液的颜色：将不同的处理组培养管按照组平放至白色背景下，使光照均匀，使用图像设备获取图像参数，利用是图像软件提取每个处理组合的培养溶液中典型颜色的RGB特征的R值；
(6)拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选
筛选桉树青枯病病菌混合培养体系图像颜色特征提取颜色特征的R值，通过对照比较统计分析确定处理组是否存在着差异。
2.如权利要求1所述的一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，CPG培养基为水解酪蛋白1g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，琼脂17g/L，调节pH值6.5-7.0。
3.如权利要求1所述的一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述无菌培养液为去琼脂的CPG培养基。
4.如权利要求1所述的一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所示图像设备获取图像参数可以使用用相机在体系中心的拍照，当处理组量大时可以固定相机和拍照参数或专业图像设备获取图像参数。
5.如权利要求1所述的一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤1和4中的恒温箱的温度为35℃。
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