CN109112067B - 一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法 - Google Patents

一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法，属于烟草发酵过程中优势微生物的筛选技术领域。本发明所提供的方法为首先采集烟叶样品，然后在对烟叶样品进行高通量测序分析其菌群结构的同时采用普通方法分离样品中的好氧微生物，之后根据高通量测序结构中群落组成与结构特点，采取特定的筛选培养基及筛选方法，对其余菌属微生物进行分离，反复多次后，采用划线纯化的方法得单一菌落。通过这种方法在避免盲目性，提高筛菌效率的同时也分离得到到发酵烟叶中的大多优势微生物，为微生物协助醇化提供研究基础。

Description

一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的 方法
技术领域
本发明涉及一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法，属于烟草发酵过程中优势微生物的筛选技术领域。
背景技术
烟叶醇化是卷烟生产加工过程中影响和改善烟叶品质的一个重要环节，即烟叶通过烘烤(或晾晒)和复烤后，在自然条件下使烟叶内含物发生一系列化学和生物化学变化的一个过程。其目的在于去掉烟叶的青杂味和改善烟叶香味，吃味等品质，故按要求对烟叶必须进行醇化。烟叶醇化工艺分为传统的人工醇化和自然醇化，传统的人工醇化虽然速度快，但醇化效果差，目前采用的很少；自然醇化还是采用最多的纯化方法，原因在于自然醇化效果好，但是其不足也随着对效率的追求增大而逐渐暴露，自然醇化的不足现在主要有：一是因烟叶富含营养物质以及长期与外部环境密切接触，烟叶很容易生虫；二是在春夏秋冬四季变化过程中，因为温度、湿度变化大，烟叶很容易产生霉变；三是因烟叶长期与过量空气接触，烟叶颜色很容易变褐、变深，所以自然醇化时间不能过长，一般不能超过3年。这些自然醇化过程中存在的不足不仅给烟厂造成严重的损失，而且还严重影响烟叶的内外在品质，影响烟叶深加工产品的质量。故解决烟叶醇化中这些不足，提高烟叶的品质及降低烟草的生产成本等已成为重点解决的问题。
微生物作用在烟叶醇化过程中不容忽视，微生物参与并制约醇化过程的进行和醇化质量的好坏，相比传统的人工醇化，在微生物协助醇化方面，前期李天丽等人虽获得了部分醇化相关的菌株，但缺乏对发酵微生物菌群结构的全面研究，调控效果较差。而且在醇化菌株的分离时，多采用传统的分离方法，忽略了常规条件下不可培养微生物在烟草醇化中起到的重要作用。故通过高通量测序对自然醇化过程的微生物群落结构进行研究，通过改善培养基及应用特定的方法分离获得自然醇化过程中的关键菌株，从而以自然醇化指导人工醇化，提高人工醇化的质量和效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种烟草发酵过程中微生物的筛选方法，即基于高通量测序技术提供的生物多样性信息制定针对不同菌株特定的筛选方法，并结合不可培养微生物的分离方法，可分离出大多数烟草发酵过程中微生物，具有一定的定向性，节约时间，对指导人工烟叶醇化具有重要的指导意义。
本发明是一种利用宏基因组测序辅助筛选微生物的方法，该方法是首先采集烟叶样品，然后在对烟叶样品进行高通量测序分析其菌群结构的同时采用普通方法分离样品中的好氧微生物，之后根据高通量测序结构中群落组成与结构特点，采取特定的筛选培养基及筛选方法，对其余菌属微生物进行分离，反复多次后，采用划线纯化的方法得单一菌落。通过这种方法在避免盲目性，提高筛菌效率的同时也分离得到到发酵烟叶中的大多优势微生物，为微生物协助醇化提供研究基础。
进一步地，所述方法是按照以下步骤进行的(图1)：
一、从烟叶醇化库中随机抽取烟叶样品；
二、采用高通量测序技术对烟叶样品中微生物群落多样性与丰度进行分析，获得微生物群落的菌群种类、丰度和空间生态分布信息；
三、进行高通量测序的同时，随机抽取步骤一中得到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于分离细菌的普通固体培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；
四、比较步骤二和步骤三的结果，确定步骤三中没有分离出来的微生物种类；
五、对步骤四中所确定的没有分离出来的好氧微生物进行分离，随机抽取步骤一中采集到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于设计的分离培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；
六、对步骤四中所确定的没有分离出来的兼性厌氧微生物进行分离，随机抽取步骤一中采集到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于兼性厌氧微生物分离用培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏。
进一步地，步骤一所述烟叶样品是在烟叶自然醇化过程中随机取得的烟叶样品。
进一步地，步骤三是随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL的无菌生理盐水中，在温度为28℃-38℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养30min-60min，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取100μL-200μL涂布于普通LB固体培养基上，于28℃-38℃倒置培养12h-36h，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏。
进一步地，步骤五是随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL中无菌生理盐水中，在温度为28℃-38℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养30min-60min，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL-200μL原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取100μL-200μL涂布于设计的分离培养基上，于28℃-38℃倒置培养12h-36h，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏。
进一步地，步骤五所述设计的分离培养基为烟叶样品沸水浸提液培养基；所述烟叶样品沸水浸提液培养基是将15g-25g烟叶样品加入300mL-500mL蒸馏水，煮沸提取25min-45min，冷却后，纱布过滤，收集滤液，即得烟叶沸水浸提液，将此浸提液按培养基量的5％-15％或25％-35％或45％-55％替换LB培养基的成分所获得的固体培养基，配方如下：
5％-15％烟叶水浸提液固体培养基：50mL-150mL烟叶水浸提液；950mL-850mL蒸馏水；胰化蛋白胨9.5g-8.5g；酵母提取物4.75g-4.25g；NaCl 9.5g-8.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；
25％-35％烟叶水浸提液固体培养基：250mL-350mL烟叶水浸提液；750mL-650mL蒸馏水；胰化蛋白胨7.5g-6.5g；酵母提取物3.75g-3.25g；NaCl 7.5g-6.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；
45％-55％烟叶水浸提液固体培养基：450mL-550mL烟叶水浸提液；550mL-450mL蒸馏水；胰化蛋白胨5.5g-4.5g；酵母提取物2.75g-2.25g；NaCl 5.5g-4.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌。
进一步地，步骤五中提到的设计的分离培养基为寡营养固体培养基，所述寡营养固体培养基是将LB培养基成分稀释成2倍或5倍或10倍所获得的固体培养基。
进一步地，步骤六是随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL中无菌生理盐水中，在温度为28℃-32℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养3h-4h，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，并分别吸取100μL-200μL涂布于兼性厌氧微生物分离用培养基，放置于含有厌氧产气袋的培养袋中，于25℃-32℃倒置培养36h-72h。
进一步地，步骤六所述兼性厌氧微生物分离用培养基为M17固体培养基，Eiller固体培养和MRS固体培养基。
本发明包含以下有益效果：
本发明将高通量测序技术与普通的分离方法相结合，并在高通量测序结果的指导下，结合菌株特定的培养基和培养方法，可分离出醇化烟叶中的多数优势菌株。为解决烟叶传统人工发酵中缺乏对发酵微生物菌群结构的全面研究，调控效果较差等问题，提供了研究基础。之前的醇化菌株的分离时，多采用传统的分离方法，不仅忽略了常规条件下不可培养微生物在烟草醇化中起到的重要作用，也具有很大的盲目性，传统技术筛选烟叶发酵过程中微生物时，需要一遍一遍的更换现有的培养基及培养方法，来确保尽可能多的微生物得到分离，所需要的时间周期至少为一年，而本发明应用高通量测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法则只需三到四个月即可分离出其中的多数微生物，可以大大节约时间和人力。。因此以高通量测序技术作为指导结合培养基优化来分离获得自然醇化过程中的关键菌株，从而以自然醇化指导人工醇化，可大大提高烟叶醇化的质量，也可减少微生物分离时的盲目性，提高效率。
附图说明
图1为实验流程图。
图2为普通LB固体培养基分离结果。
图3为不可培养好氧微生物的分离结果。
图4为不可培养好氧微生物的分离结果(续-1)。
图5为不可培养好氧微生物的分离结果(续-2)。
图6为兼性厌氧微生物的分离结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
具体实施方式一：
本实施方式的一种利用宏基因组测序辅助筛选微生物的方法，它是按照以下步骤进行的(图1)：
一、从烟叶醇化库中随机抽取烟叶样品；
二、采用高通量测序技术对烟叶样品中微生物群落多样性与丰度进行分析，获得微生物群落的菌群种类、丰度和空间生态分布信息；
三、进行高通量测序的同时，随机抽取步骤一中得到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于分离细菌的普通固体培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；
四、比较步骤二和步骤三的结果，确定步骤三中没有分离出来的微生物种属；
五、对步骤四中所确定的没有分离出来的好氧微生物进行分离，随机抽取步骤一中采集到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于设计的分离培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；
六、对步骤四中所确定的没有分离出来的兼性厌氧微生物进行分离，随机抽取-步骤一中采集到的烟叶样品，在无菌条件下在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于兼性厌氧微生物分离用培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的烟叶样品是在烟叶自然醇化过程中随机取得的烟叶样品。不但操作简便而且能保证样本的代表性。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中所提到随机抽取适量烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于分离细菌的普通固体培养基上培养，培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏，是指随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL的无菌生理盐水中，在温度为28℃-38℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养30min-60min，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取100μL-200μL涂布于普通LB固体培养基上，于28℃-38℃倒置培养12h-36h，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤五中所提到随机抽取烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于设计的分离培养基上培养，培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏，是指随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL中无菌生理盐水中，在温度为28℃-38℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养30min-60min，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL-200μL原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取100μL-200μL涂布于设计的分离培养基上，于28℃-38℃倒置培养12h-36h，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：
步骤五所述设计的分离培养基为烟叶样品沸水浸提液培养基；所述烟叶样品沸水浸提液培养基是将15g-25g烟叶样品加入300mL-500mL蒸馏水，煮沸提取25min-45min，冷却后，纱布过滤，收集滤液，即得烟叶沸水浸提液，将此浸提液分别按培养基量的5％-15％，25％-35％及45％-55％替换LB培养基的成分所获得的固体培养基，配方如下：
5％-15％烟叶水浸提液固体培养基：50mL-150mL烟叶水浸提液；950mL-850mL蒸馏水；胰化蛋白胨9.5g-8.5g；酵母提取物4.75g-4.25g；NaCl 9.5g-8.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；
25％-35％烟叶水浸提液固体培养基：250mL-350mL烟叶水浸提液；750mL-650mL蒸馏水；胰化蛋白胨7.5g-6.5g；酵母提取物3.75g-3.25g；NaCl 7.5g-6.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；
45％-55％烟叶水浸提液固体培养基：450mL-550mL烟叶水浸提液；550mL-450mL蒸馏水；胰化蛋白胨5.5g-4.5g；酵母提取物2.75g-2.25g；NaCl 5.5g-4.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌。
加入烟叶沸水浸提物可模拟菌株生长的环境，提高了微生物的可培养性。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤五中提到的设计的分离培养基为寡营养固体培养基，所述寡营养固体培养基是将LB培养基成分分别稀释成2倍，5倍及10倍所获得的固体培养基。寡营养培养基可培养出不适合生产在富营养环境下的一类微生物，属于不可培养微生物实现可培养的一种手段，实现了部分不可培养微生物的可培养。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤六中所提到随机抽取适量烟叶样品，在无菌条件下在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于兼性厌氧微生物分离用培养基上培养，培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；是指是随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL中无菌生理盐水中，在温度为28℃-32℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养3h-4h，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，并分别吸取100μL-200μL涂布于兼性厌氧微生物分离用培养基，放置于含有厌氧产气袋的培养袋中，于25℃-32℃倒置培养36h-72h。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤六所述兼性厌氧微生物分离用培养基包括M17固体培养基，Eiller固体培养，及MRS固体培养基，其配制如下：
M17固体培养基：1000mL蒸馏水；植质蛋白胨5g；酵母粉5g；聚蛋白胨5g；抗坏血酸0.5g；牛肉浸膏2.5g；1mol/L MgSO4·7H2O 1mL；β-甘油磷酸二钠19g；琼脂15g；pH 7.1，灭菌后补充终浓度为5g/L葡萄糖，115℃高压蒸汽灭菌30min；
Elliker固体培养基：1000mL蒸馏水；蛋白胨20g；酵母粉5g；明胶2.5g；乳糖5g；葡萄糖5g；蔗糖5g；氯化钠4g；乙酸钠5g；抗坏血酸0.5g；琼脂15g；pH 6.8，115℃高压蒸汽灭菌30min；
MRS固体培养基：1000mL蒸馏水；蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母粉5g；柠檬酸氢二铵2g；葡萄糖20g；吐温80mL；乙酸钠5g；三水磷酸氢二钾2g；七水硫酸镁0.58g；一水硫酸锰0.25g；琼脂18g，pH 6.2～6.6，115℃高压蒸汽灭菌30min。
其它与具体实施方式一相同。
下面通过实施例对本发明进行进一步详细的说明。
实施例一
本实施例按照如下程序进行筛选醇化烟叶样品中的微生物：
1.采样
本次筛菌所用的烟叶样品全部来自烟叶醇化库中醇化一年的烟叶，采取随机取样的方法，从醇化库中取得样品，并将其混合均匀。
2.好氧微生物的筛选条件
将烟叶样品送去测序公司进行高通量测序分析，与此同时采用传统方法对烟叶中的好氧微生物进行分离。本发明设计了的方法为：
LB固体培养基的成分及配制为：胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min
LB液体培养基的成分及配制为：胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min
3.细菌分离过程
(1)从烟叶醇化库中取得的醇化烟叶样品，随机抽取2g，在无菌条件下剪碎，浸泡于150mL中无菌生理盐水中，在温度为37℃，转速为200r/min的条件下，振荡培养30min。
(2)用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用5mL无菌水重悬，得原始菌悬液。
(3)取100μL原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取150μL涂布于设计的固体培养基上，于37℃倒置培养36h。
(4)培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌。
4.分子生物学鉴定及保藏
(1)将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落。
(2)将分离得到的单菌落转入相应的液体培养基中培养，得到相应菌株的菌悬液。
(3)分别吸取700μL上述菌悬液和40％甘油加入灭菌的冷冻离心管中，于-20℃预冻12h后，放入-80℃超低温冰箱中保藏。
(4)取菌悬液2mL，12000rmp离心后弃上清，将菌体重悬于100μL的无菌水中，采用冻融法进行破壁处理，具体操作为将重悬于100μL无菌水的菌液，用液氮冷冻30s，迅速于沸水中煮1min，反复20次后，8000rmp离心取上清作为模板。之后，进行聚合酶链式反应(PCR)反应体系以及程序如下：
PCR扩增体系(25μL)：
PCR扩增程序：
(5)分别取5μLPCR反应液和DNAmaker2000，应用凝胶电泳进行PCR产物验证。
(6)将在1600bp左右有荧光带出现的PCR产物，送去测序公司测序，测序结果进行拼接后，输入NCBI的BLSAT(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对，得到鉴定结果。
(7)对未鉴定出的菌株，采用DNA提取试剂盒，提取其基因组DNA直接作为模板，其余如上述步骤(4)-(7)。经鉴定所分离的菌株分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)及微球菌属(Micrococcus)等。(如附图2)
5.根据目标菌株的特性确定特定的筛选条件
本发明为醇化烟叶中优势微生物的筛选方法，根据醇化烟叶样品的高通量测序结果得知，醇化烟叶中的微生物群落的分布主要分为两类：好氧微生物和兼性厌氧菌微生物。因此针对在初次分离中未能筛选出的好氧微生物和兼性厌氧菌微生物的菌属特征，本发明设计了两类筛选方法：
(1)不可培养好氧菌
①寡营养培养基
稀释两倍的LB固体培养基成分及配制为：胰化蛋白胨5g/L，酵母提取物2.5g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
稀释两倍的LB液体培养基成分及配制为：胰化蛋白胨5g/L，酵母提取物2.5g/L，NaCl5g/L，pH自然,121℃高压蒸汽灭菌20min
稀释五倍的LB固体培养基成分及配制为：胰化蛋白胨2g/L，酵母提取物1g/L，NaCl2g/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
稀释五倍的LB液体培养基成分及配制为：胰化蛋白胨2g/L，酵母提取物1g/L，NaCl2g/L，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
稀释十倍的LB固体培养基成分及配制为：胰化蛋白胨1g/L,酵母提取物0.5g/L，NaCl1g/L，琼脂20g/L，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
稀释十倍的LB液体培养基成分及配制为：胰化蛋白胨1g/L，酵母提取物0.5g/L,，NaCl1g/L，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
②烟叶水浸提物培养基
15g烟叶样品加入350mL蒸馏水煮沸提取30min，冷却后，纱布过滤，得烟叶水浸提液。以分别添加10％，30％和50％的水浸提液代替LB培养基成分，制备烟叶浸提物培养基。
10％烟叶水浸提液固体培养基成分及配制为：100mL烟叶水浸提液，900mL蒸馏水，胰化蛋白胨9g，酵母提取物4.5g，NaCl9g，琼脂20g，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
10％烟叶水浸提液液体培养基成分及配制为：100mL烟叶水浸提液，900mL蒸馏水，胰化蛋白胨9g，酵母提取物4.5g，NaCl9g，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
30％烟叶水浸提液固体培养基成分及配制为：300mL烟叶水浸提液，700mL蒸馏水，胰化蛋白胨7g，酵母提取物3.5g，NaCl7g，琼脂20g，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
30％烟叶水浸提液液体培养基成分及配制为：300mL烟叶水浸提液，700mL蒸馏水，胰化蛋白胨7g，酵母提取物3.5g，NaCl7g，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
50％烟叶水浸提液固体培养基成分及配制为：500mL烟叶水浸提液，500mL蒸馏水，胰化蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCl5g，琼脂20g，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
50％烟叶水浸提液液体培养基成分及配制为：500mL烟叶水浸提液，500mL蒸馏水，胰化蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCl5g，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min
(2)兼性厌氧菌
筛选的培养基配制如下：
Elliker固体培养基：蛋白胨20g/L；酵母粉5g/L；明胶2.5g/L；乳糖5g/L；葡萄糖5g/L；蔗糖5g/L；氯化钠4g/L；乙酸钠5g/L；抗坏血酸0.5g/L；琼脂15g/L，pH6.8，115℃高压蒸汽灭菌30min；相应的液体培养基仅为不加琼脂。
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L；牛肉膏10g/L；酵母粉5g/L；柠檬酸氢二铵2g/L；葡萄糖20g/L；吐温80mL/L；乙酸钠5g/L；三水磷酸氢二钾2g/L；七水硫酸镁0.58g/L；一水硫酸锰0.25g/L；琼脂18g/L，pH6.2～6.6，115℃高压蒸汽灭菌30min；相应的液体培养基仅为不加琼脂。
M17固体培养基：1000mL蒸馏水；植质蛋白胨5g；酵母粉5g；聚蛋白胨5g；抗坏血酸0.5g；牛肉浸膏2.5g；1mol/L MgSO4·7H2O 1mL；β-甘油磷酸二钠19g；琼脂15g；pH 7.1，灭菌后补充终浓度为5g/L葡萄糖，115℃高压蒸汽灭菌30min；相应的液体培养基仅为不加琼脂。
6.目标菌株的分离纯化及鉴定过程
(1)不可培养好氧菌
从烟叶醇化库中取得的醇化烟叶样品，随机抽取2g，在无菌条件下剪碎，浸泡于150mL中无菌生理盐水中，在温度为37℃，转速为200r/min的条件下，振荡培养30min，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用5mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取150μL涂布于所设计的固体培养基上，于37℃倒置培养36h。
培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏，鉴定及保藏与普通好氧细菌相同；
经鉴定，分离得到的菌株为：芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、考克氏菌属(Kocuria)等。(附图3-5)
(2)兼性厌氧菌
从烟叶醇化库中取得的醇化烟叶样品，随机抽取2g，在无菌条件下剪碎，浸泡于150mL中无菌生理盐水中，在温度为30℃，转速为200r/min的条件下，振荡培养4h，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用5mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，并分别吸取150μL涂布于乳球菌分离用培养基，放置于含有厌氧产气袋的培养袋中，于30℃倒置培养72h。
培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏，鉴定及保藏与普通好氧细菌相同；
经鉴定，分离得到兼性厌氧菌为：芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)等。(附图6)
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种利用宏基因组测序辅助筛选烟草发酵过程中微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：从烟叶醇化库中随机抽取烟叶样品；
步骤二：采用高通量测序技术对烟叶样品中微生物群落多样性与丰度进行分析，获得微生物群落的菌群种类、丰度和空间生态分布信息；
步骤三：进行高通量测序的同时，随机抽取步骤一中得到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于分离细菌的普通固体培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；
步骤四：比较步骤二和步骤三的结果，确定步骤三中没有分离出来的微生物种属；
步骤五：对步骤四中所确定的没有分离出来的好氧微生物进行分离，随机抽取步骤一中采集到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于设计的分离培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；其中：所述设计的分离培养基为烟叶样品沸水浸提液培养基和寡营养固体培养基；所述烟叶样品沸水浸提液培养基是将15g-25g烟叶样品加入300mL-500mL蒸馏水，煮沸提取25min-45min，冷却后，纱布过滤，收集滤液，即得烟叶沸水浸提液，将此浸提液分别按培养基量的5％-15％，25％-35％及45％-55％替换LB培养基的成分所获得的固体培养基，配方如下：5％-15％烟叶水浸提液固体培养基：50mL-150mL烟叶水浸提液；950mL-850mL蒸馏水；胰化蛋白胨9.5g-8.5g；酵母提取物4.75g-4.25g；NaCl 9.5g-8.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；25％-35％烟叶水浸提液固体培养基：250mL-350mL烟叶水浸提液；750mL-650mL蒸馏水；胰化蛋白胨7.5g-6.5g；酵母提取物3.75g-3.25g；NaCl 7.5g-6.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；45％-55％烟叶水浸提液固体培养基：450mL-550mL烟叶水浸提液；550mL-450mL蒸馏水；胰化蛋白胨5.5g-4.5g；酵母提取物2.75g-2.25g；NaCl 5.5g-4.5g；琼脂15g-20g，pH自然，灭菌；所述寡营养固体培养基是将LB培养基成分分别稀释成2倍，5倍及10倍所获得的固体培养基；
步骤六：对步骤四中所确定的没有分离出来的兼性厌氧微生物进行分离，随机抽取步骤一中采集到的烟叶样品，在无菌条件下获得烟叶表面菌株的原始菌悬液，原始菌悬液梯度稀释后，分别涂布于兼性厌氧微生物分离用培养基上培养，将培养得到的菌落进行纯化获得单菌落，重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，并对所有分离得到的细菌进行鉴定及保藏；所述兼性厌氧微生物分离用培养基为M17固体培养基，Eiller固体培养和MRS固体培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一所述烟叶样品是在烟叶自然醇化过程中随机取得的烟叶样品。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤三是随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL的无菌生理盐水中，在温度为28℃-38℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养30min-60min，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取100μL-200μL涂布于普通LB固体培养基上，于28℃-38℃倒置培养12h-36h，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五是随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL中无菌生理盐水中，在温度为28℃-38℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养30min-60min，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取100μL-200μL原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，并分别吸取100μL-200μL涂布于设计的分离培养基上，于28℃-38℃倒置培养12h-36h，培养得到的菌落采用平板划线法进行纯化，直至获得单菌落；重复上述步骤，至分离出可用所选培养基分离的细菌，将所选培养基分离的细菌，根据其在相同培养基上，培养相同时间所得菌落形态一致的原则，将其进行形态学相似的合并，最终得到在形态上不同的单菌落，并转入相应的液体培养基中培养；将液体培养基中培养得到的菌悬液，进行分子生物学鉴定及保藏。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤六是随机抽取烟叶样品2g-3g，在无菌条件下剪碎，浸泡于50mL-150mL中无菌生理盐水中，在温度为28℃-32℃，转速为150r/min-220r/min的条件下，振荡培养3h-4h，用无菌单层纱布过滤，取滤液，离心弃上清，并用1mL-10mL无菌水重悬，得原始菌悬液，取原始菌液分别稀释至100，10-1，10-2，10-3，并分别吸取100μL-200μL涂布于兼性厌氧微生物分离用培养基，放置于含有厌氧产气袋的培养袋中，于25℃-32℃倒置培养36h-72h。
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