CN106480213A - 陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法 - Google Patents

陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法 Download PDF

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Abstract

基于微生物的种类和数量与烤烟品种、产地、时间、等级及发酵条件有关，利用高通量基因测序技术，对不同烤烟品种、产地、时间、等级的微生物菌群结构进行分析，绘制优质烟叶表面微生物菌群结构图。本专利发明了利用宏基因组测序技术鉴定烟叶表面微生物的方法，对宣威地区3种代表性烟叶样品表面微生物进行OTU聚类分析、物种注释，获得微生物多样性信息。结果显示，芽孢杆菌属菌株在陈化烟叶中为主要优势菌，在提高陈化烟叶品质中具有一定利用价值；烟叶样品中另一较多的菌种是假单胞菌属，这一大类的细菌有生物防治、微生态调节等功能。利用本专利发明的方法获得的烟叶表面微生物多样性信息，有助于发挥微生物在烟叶陈化及提高品质方面的作用。

Description

陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法
技术领域
本发明专利属于烟叶表面微生物的鉴定技术领域。
背景技术
在卷烟工业中，根据不同卷烟叶组中的烟叶品种、烟叶产地、烟叶等级、烟叶年份和烟叶配比等，通过加料加香，赋予卷烟产品特定产品风格，提供给消费者特定的感官体验。通过加料，可以改善卷烟的吸食品质、改善烟丝的物理性状、改善烟丝的燃烧性和防止烟丝霉变等；通过加香，在不损害原有香气的情况下，存托烟香，同时掩盖杂气，达到增香赋香、改善吃味和协调香味的作用，进而最终形成卷烟产品风格。按照来源不同，烟草香料包括天然香料和合成香料2大类。然而，世界卫生组织(WHO)在烟草控制框架公约中建议各国限制或禁止在烟草中使用香料等添加剂，包括葡萄糖、蜂蜜、香草醛和中草药等天然或合成烟香香料都在范围内。我国已于2005年正式批准烟草控制框架公约，减少和限制天然和合成香料的使用是大势所趋。
烟叶是卷烟工业的基础,其品质的好坏对卷烟的品质起着举足轻重的作用，实际上微生物发酵已被证明可改善烟叶可用性，如烟叶陈化和发酵是改进和完善烟叶品质的重要环节。自19世纪至今，利用微生物资源缩短发酵时间、改善烟叶品质为目的用于烟叶发酵已有多年的研究历史。研究人员在烟叶发酵期间，对烟叶叶面微生物进行了一系列分离、鉴定工作，同时也进行了大量的向烟草中加入微生物来提高烟叶质量的尝试性研究，而提出烟叶陈化的机理之一就是叶面微生物作用的结果。现阶段微生物应用于烟叶制品中主要包括缩短发酵时间、调控烟叶有害成分(如烟碱、蛋白质、TSNA等)、增进烟叶香气。目前从陈化烟叶中分离的微生物菌群主要包括细菌、霉菌和放线菌，另有少量酵母菌。烟叶表面微生物中细菌占绝对优势，达到90％-99％，以芽孢杆菌为主，其中芽孢杆菌和芽孢梭菌占烟叶表面微生物种类数量的90％左右。微生物改善烟叶质量机理复杂，微生物在其自身代谢过程中，产生许多次生代谢物质，对烟叶成分(主要是蛋白质和糖)起催化作用，促进香气物质的产生。增香菌的开发利用，将对烟草工业的技术进步和经济效益产生重大影响。
发明内容
本发明的目的是利用宏基因组测序技术鉴定烟叶表面微生物的方法，通过对烟叶预处理方法、宏基因组DNA提取方法、测序文库构建及测序数据处理方法、功能微生物注释方法、烟叶表面微生物分离纯化方法的优化，为获得在烟叶陈化过程中具有提升烟叶品质的功能微生物提供解决方案。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法，包括如下步骤：
(1)烟叶样品预处理；
(2)宏基因组的DNA扩增；
(3)文库构建；
(4)测序与鉴定；
(5)表面微生物分离纯化。
进一步地，其步骤(1)具体包括如下步骤：称取40g烟叶，等分成4份后分别置于已灭菌的加有200mL双蒸水的500mL锥形瓶中，在摇床上以200r/min的转速摇2小时以上以至均匀，将上述锥形瓶放在水浴超声波清洗器中震荡20分钟；然后用双层纱布过滤去除烟叶渣，用100mL离心管收集滤液，所得的滤液再用8000r/min的转速离心15分钟，离心后倒掉上清液保留沉淀；烟叶表面微生物包含在沉淀当中，收集好沉淀后待进行基因组提取实验。
进一步地，其步骤(2)具体包括如下步骤：分别采用细菌16S rDNA引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增获得特征DNA序列片段；PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；72℃延伸5min，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR反应体系为20μL，组成如表1：
表1 PCR反应体系
进一步地，其步骤(3)具体包括如下步骤：用步骤(2)中检测合格的样品构建文库，回收目的扩增片段，用T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3'端加碱基“A”，使得DNA片段能与3'端带有“T”碱基的特殊接头连接，或者设计合成含有测序接头的双Index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的扩增片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序。
进一步地，其步骤(4)具体包括如下步骤：下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
进一步地，其步骤(5)具体包括如下步骤：①LB培养基制备：取胰蛋白栋10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，1L水，2％琼脂糖，分别将上述原料灭菌后制作培养基平板；②收集烟叶表面微生物：称量10g烟草叶于烧杯中剪碎，倒入已灭菌的含有200mL无菌水的500mL三角瓶中，置于200rpm的摇床中摇晃2h之后，取出三角瓶并超声波震荡30min，将超声振荡后的样品用双层纱布过滤，收集过滤后的滤液于100mL离心管中，所得滤液用8000rpm离心15min，离心后的沉淀加1mL无菌水于离心管中混匀后吸出置于2mL离心管中，记为原样品；然后，按照上述方法分别制备稀释10、102、103、104、105倍的样品；③取100μL原样，涂布于培养基平板中，置于培养箱中培养；培养12h后取出观看菌落的形态，选取清晰的单个菌落用牙签挑出并置于液体培养基上，37℃摇床中培养12h；④用接种环在液体培养基中沾取少量菌液于LB固体平板上划线，分离单菌落，并进行革兰氏染色鉴定。
本发明的有益效果是：利用本发明的技术方案，可以有效的获得烟叶表面微生物的宏基因组DNA，进行高通量测序后，通过测序数据分析和功能注释，可以高效获得烟叶表面微生物的物种信息，为获得在烟叶陈化过程中具有提升烟叶品质的功能微生物提供支持。
附图说明
图1烟叶样品表面微生物16S rDNA的PCR扩增结果
图2各样品细菌OTU韦恩图分析
图3各样品细菌种间分类水平物种注释柱状图及热图
图4宣威B3F烟叶样品表面微生物鉴定分析
图5宣威把选C3F烟叶样品表面微生物鉴定分析
图6宣威X2F烟叶样品表面微生物鉴定分析
具体实施方式
陈化烟叶样品预处理方法，包括如下步骤：
(1)称取40g烟叶，等分成4份后分别置于已灭菌的加有200mL双蒸水的500mL锥形瓶中，在摇床上以200r/min的转速摇匀2小时以上，将锥形瓶放在水浴超声波清洗器中震荡20分钟。
(2)用双层纱布过滤掉烟叶渣之后，用100mL离心管收集滤液，在用8000r/min离心15分钟，倒掉上清保留沉淀。烟叶表面微生物便包含在沉淀当中，收集好沉淀后待进行基因组提取实验。
陈化烟叶样品宏基因组16S rDNA片段的PCR扩增方法，包括如下步骤：
(1)分别采用细菌16S rDNA引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增获得特征DNA序列片段。
(2)PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；72℃延伸5min。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
(3)PCR反应体系为20μL，组成如表1。
宏基因组测序文库构建方法，包括如下步骤：
检测合格的样品构建文库，回收目的扩增子片段，用T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3'端加碱基“A”，使得DNA片段能与3'端带有“T”碱基的特殊接头连接；或者设计合成含有测序接头的双Index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的扩增子片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序。
测序数据分析方法，包括如下步骤：
下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
烟叶表面微生物分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)LB培养基：胰蛋白栋10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，1L水，2％琼脂糖。灭菌后制作培养基平板。
(2)收集烟叶表面微生物：称量10g烟草叶于烧杯中剪碎，倒入灭菌后的含有200mL无菌水的三角瓶中，置于200rpm的摇床中摇晃2h，之后取出超声波震荡30min，双层纱布过滤烟叶渣收集于100mL离心管中，将滤液进行离心，8000rpm离心15min，弃上清液，沉淀加1mL无菌水于离心管中反复抽打混匀后吸出置于2mL离心管中，记为原样品。然后，制备稀释10、102、103、104、105倍的样品。
(3)取100μL原样，涂布于培养基平板中，置于培养箱中培养。培养12h后取出观看菌落的形态，选取清晰的单个菌落用牙签挑出于液体培养基上，37℃摇床中培养12h。
(4)用接种环沾取少量菌液于LB固体平板上划线，分离单菌落，并进行革兰氏染色鉴定。
实施例1
通过以上步骤，本发明对三种宣威地区烟叶样品的表面微生物，利用宏基因组测序进行注释、鉴定。
(1)来源于宣威地区的烟叶样品，如表2。
表2烟叶样品信息
(2)烟叶样品微生物16S rDNA的PCR扩增结果
电泳结果表明(图1)，各个样品均能扩出细菌16S rDNA的目的条带，质量满足宏基因组测序建库要求。
(3)OTU聚类分析及韦恩图分析
将拼接的Tags经过优化后，在97％相似度下将其聚类为用于物种分类的OTU(operational taxonomic unit)。表3的聚类分析表明，各样品中细菌的Tag数量丰富，说明细菌种类丰富。
表3各样品细菌Tag及OTU聚类分析结果
利用Venn图可以看出多样品共有和各自特有OTU数目，直观展示样品间OTU的重叠情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的核心微生物。图2表明同样来自宣威地区的烟叶共有的细菌OTU数目占比达到48.60％，说明同一产地，即使不同烟叶品种，其表面细菌群落的亲缘性更加接近。
(4)烟叶样品细菌注释分析
通过与数据库进行比对，对OTU进行物种分类，并在种间水平对各个样品作物种柱状图和热图分析。
图3表明，各样品中所占比例最高的都是未分类的细菌，其中绝大部分应都是不可培养微生物，也由此证实用传统的分离培养方法是无法完全鉴定出烟叶表面微生物的种类的。之前研究发现烟叶样品中较多的Bacillus cereus(蜡样芽孢杆菌)在烟叶发酵过程中可明显降低含氮化合物含量。李宁、汪长国等以烟水液体培养基对烤烟、雪茄烟表面的喜温微生物进行富集培养，筛选到一株在45℃蛋白酶活力最高的菌X-2，在雪茄烟叶堆积发酵过程中添加x-2可明显降低烟叶含氮化合物含量，发酵结束时烟叶总氮、蛋白、碱性物质降低明显；感官表现为烟叶劲头、刺激性改善明显，同时杂气减轻、香气增加，对其进行物种鉴定确定其为蜡样芽孢杆菌。另有其他研究称蜡样芽孢杆菌产生纤维素酶，降解和糖化木质纤维素，并且抑制多种其他致病菌的生长。吴海武、张保国等人报道称Bacillus clausii(克劳氏芽孢杆菌)和Bacillus flexus(弯曲芽孢杆菌)也能产一些酶类，具有一定脱氮作用。由此可看出芽孢杆菌属在陈化烟叶中为主要优势菌，其具有一定利用价值，值得进一步研究其功能并开发利用，从而提高烟叶品质。
表4的结果表明，烟叶样品中另一较多的是假单胞菌属，这一大类的细菌有生物防治、微生态调节等较多的生物功能，用途广泛。鉴定的Pseudomonas veronii(维罗纳假单胞菌)就具有代谢降解α-蒎烯的功能。不过，样品中也存在像Pantoeaagglomerans(成团泛菌)这样的条件致病菌，这有可能是烟叶生长时感染的，所以需要经过烟叶发酵将其杀死，这也体现了陈化过程对于烟叶生产的重要性。
表4细菌柱状图中各物种所占比例
实施例2
通过以上步骤，本发明对宣威B3F烟叶样品表面微生物进行分离纯化，结合宏基因组注释信息，对所分离物种进行鉴定。
挑取分离平板上特征明显的5个菌落，进行革兰氏染色并镜检，2个为革兰氏阴性，3个为革兰氏阳性。结合宏基因组测序结果，初步判断宣威B3F烟叶表面微生物主要包括革兰氏阳性菌(芽孢杆菌、乳球菌)、革兰氏阴性菌(香味菌、成团泛菌和假单胞菌)。其中，香味菌的特征为革兰氏阴性；菌体短杆状、未见产芽孢；菌落呈乳白色略带黄色，不透明，边缘圆整，表面光滑，有光泽，隆起(图4)。
实施例3
通过以上步骤，本发明对宣威把选C3F烟叶样品表面微生物进行分离纯化，结合宏基因组注释信息，对所分离物种进行鉴定。
挑取分离平板上特征明显的5个菌落，进行革兰氏染色并镜检，全为革兰氏阳性。结合宏基因组测序结果，初步判断宣威把选C3F烟叶表面微生物主要为革兰氏阳性芽孢杆菌(图5)。
实施例4
通过以上步骤，本发明对宣威X2F烟叶样品表面微生物进行分离纯化，结合宏基因组注释信息，对所分离物种进行鉴定。
挑取分离平板上特征明显的5个菌落，进行革兰氏染色并镜检，4个为革兰氏阴性，1个为革兰氏阳性。结合宏基因组测序结果，初步判断宣威X2F烟叶表面微生物主要包括假单胞菌、芽孢杆菌、成团泛菌(图6)。

Claims (6)

1.陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)烟叶样品预处理；
(2)宏基因组的DNA扩增；
(3)文库构建；
(4)测序与鉴定；
(5)表面微生物分离纯化。
2.根据权利要求1所述的陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法，其特征在于，其步骤(1)具体包括如下步骤：称取40g烟叶，等分成4份后分别置于已灭菌的加有200mL双蒸水的500mL锥形瓶中，在摇床上以200r/min的转速摇2小时以上以至均匀，将上述锥形瓶放在水浴超声波清洗器中震荡20分钟；然后用双层纱布过滤去除烟叶渣，用100mL离心管收集滤液，所得的滤液再用8000r/min的转速离心15分钟，离心后倒掉上清液保留沉淀；烟叶表面微生物包含在沉淀当中，收集好沉淀后待进行基因组提取实验。
3.根据权利要求1所述的陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法，其特征在于，其步骤(2)具体包括如下步骤：分别采用细菌16S rDNA引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增获得特征DNA序列片段；PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；72℃延伸5min，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR反应体系为20μL，组成如下表：
PCR反应体系
4.根据权利要求1所述的陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法，其特征在于，其步骤(3)具体包括如下步骤：用步骤(2)中检测合格的样品构建文库，回收目的扩增片段，用T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3'端加碱基“A”，使得DNA片段能与3'端带有“T”碱基的特殊接头连接，或者设计合成含有测序接头的双Index融合引物，以基因组DNA为模板，进行融合引物PCR，磁珠筛选目的扩增片段，最后，用合格的文库进行cluster制备和测序。
5.根据权利要求1所述的陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法，其特征在于，其步骤(4)具体包括如下步骤：下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下将Tags聚成OTU，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
6.根据权利要求1所述的陈化烟叶表面微生物的宏基因组测序与鉴定方法，其特征在于，其步骤(5)具体包括如下步骤：①LB培养基制备：取胰蛋白栋10g，酵母提取物5g，NaCl10g，1L水，2％琼脂糖，分别将上述原料灭菌后制作培养基平板；②收集烟叶表面微生物：称量10g烟草叶于烧杯中剪碎，倒入已灭菌的含有200mL无菌水的500mL三角瓶中，置于200rpm的摇床中摇晃2h之后，取出三角瓶并超声波震荡30min，将超声振荡后的样品用双层纱布过滤，收集过滤后的滤液于100mL离心管中，所得滤液用8000rpm离心15min，离心后的沉淀加1mL无菌水于离心管中混匀后吸出置于2mL离心管中，记为原样品；然后，按照上述方法分别制备稀释10、102、103、104、105倍的样品；③取100μL原样，涂布于培养基平板中，置于培养箱中培养；培养12h后取出观看菌落的形态，选取清晰的单个菌落用牙签挑出并置于液体培养基上，37℃摇床中培养12h；④用接种环在液体培养基中沾取少量菌液于LB固体平板上划线，分离单菌落，并进行革兰氏染色鉴定。
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