CN102732440B - 一株降低烤烟烟叶亚硝胺的恶臭假单胞菌t2-2及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株降低烟草特有亚硝胺(TSNA)的菌株筛选及其应用。本发明分离的细菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)T2-2，其保藏号为CCTCC NO：M2011074。本发明的主要特征是，从大量烤烟烟叶表面细菌中筛选出一株能够明显降低烟草特有亚硝胺含量的菌株——恶臭假单胞菌T2-2，通过液体发酵扩大培养后，T2-2菌悬液喷施于上部烤烟烟叶表面处理，烟叶中TSNA中的关键组分NNN和NNK，分别下降NNN 28.33％和NNK 57.83％。

Description

一株降低烤烟烟叶亚硝胺的恶臭假单胞菌T2-2及用途

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域和烟草陈化技术领域，具体地说，本发明涉及利用一种人工分离的微生物菌株，该菌株是一种降低烟草特有亚硝胺的反硝化细菌。所述的菌株为恶臭假单胞菌T2-2。本发明还涉及到该菌株在烤烟上部烟叶人工陈化中的应用。

背景技术

随着社会的发展，吸烟与健康问题已得到广泛的关注，烟草及其烟草制品和烟气中的有害物质，特别是有致癌性的烟草特有亚硝胺(TSNA)对人体的危害更加引起世界各国的重视，如今人们最关心的就是如何最大限度降低烟草中TSNA的含量问题。

烟草特有亚硝胺(Tobacco-Specific Nitrosamines，简称TSNA)是一组仅发现于烟草及其烟草制品和烟气的致癌物质，主要包括N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)，4-(N-甲基-亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)等四种成分。其中NNN和NNK有显著的致癌作用，而NAB和NAT则无明显的致癌作用。

烟叶中的TSNA几乎都产生于调制期间，但其自身性状对TSNA形成的影响也是非常明显的。因此，降低烟叶中的TSNA需要从工业和农业两方面着手。

农业上，从栽培和育种的角度来降低TSNA，不属于本发明的研究范畴；工业上，在调制过程中降低TSNA，一般来说，常常需要使用化学试剂，而化学试剂的大量使用往往也带来一系列负面问题，如对环境的污染，还有对烟叶品质的影响等，目前，绝大多数研究都是通过物理吸附的方法，即在卷烟滤嘴中加入沸石等，此方法对烟气中TSNA降低率相当高，但其造价非常昂贵，不利于大规模生产。因此，利用生物降低烟草TSNA就具有重要的社会意义及经济价值。

TSNA为4种亚硝胺的混合物，不能直接筛选降解TSNA的菌株，只能通过降低其前体物质——烟碱和硝酸盐、亚硝酸盐的含量，达到最终降低TSNA的目的，其中，硝酸盐、亚硝酸盐含量微少，是限制性因素，因此，本发明通过降解硝酸盐、亚硝酸盐途径来降低TSNA。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)T2-2是华中农业大学农业微生物国家重点实验室微生物工程室筛选得到的一株可高效降低烟草特有亚硝胺的反硝化细菌。烤烟上部烟叶陈化试验结果显示该菌株具有较好的应用效果：它对降低烟草亚硝胺有显著效果(p＜0.05)，其中，NNN和NNK的降低率分别达到28.33％和57.83％。

国内外对烟草特有亚硝胺的研究工作，取得了一定进展，目前来说，大多数研究仍处于实验室阶段，有待进一步研究开发成产品加以应用，且研究多数集中在白肋烟，关于降低烤烟中TSNA的研究鲜少报道。祝明亮(公开号CN 1579260A，2005)等从大量烟草内生细菌中筛选出一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa KenLXP30)，处理调制后能降低78.23～98.72％白肋烟TSNA含量。但铜绿假单胞菌有致病性，不适于作用烟草这种生活消费品。

祝明亮(公开号CN 1580237A，2005)等从大量烟草内生细菌中筛选出一株放射根瘤菌KenLXR34(Rhizobium radiobacter KenLXR34)菌株，接种叶面喷雾处理调制后，能降低55.46％白肋烟TSNA含量。汪安云(2006)等研究表明从白肋烟TRM品种叶片中分离得到一株能还原硝酸盐和亚硝酸盐的菌株，该菌株为根瘤土壤杆菌属，定名为Agrobaterium tumefaciens，喷洒菌株处理的烟叶中TSNA含量有明显的降低，比同一时期对照烟叶中TSNA含量降低了81.3％。这两株菌的效果明显，但是发酵培养时间过长，不适合大规模生产，且作用对象都为白肋烟新鲜烟叶。

与上述菌株相比，本发明的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)T2-2是一种降低烤烟烟草特有亚硝胺的反硝化细菌，可应用于好氧与微氧环境，发酵工艺操作简单，发酵时间短，生长条件适宜，在普通培养基中即可生长良好，方便大规模生产。该菌株具有较强的环境适应能力，应用领域更广，包括栽培，陈化，复烤前后和烟丝等方面。本发明涉及的该菌株在烤烟上部烟叶人工陈化中的应用，弥补了烤烟中降低TSNA研究报道稀少的遗憾。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的缺陷，提供一株可以在好氧条件下生长的能够降低烤烟烟叶特有亚硝胺(TSNA)的菌株，利用该菌株进行发酵培养生产菌剂，降低烤烟烟叶中特有亚硝胺的含量，为卷烟生产提供优质烟叶原料。

申请人从烤烟烟叶中分离得到一株好氧条件下生长的能够降低烟草特有亚硝胺的反硝化细菌，该菌株是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)T2-2，于2011年3月21日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2011074，经过16S rDNA序列测定，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)T2-2的微生物学特征：

短杆状，无芽孢，革兰氏阴性菌，V.P实验阳性，甲基红实验阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原阳性，亚硝酸盐还原阳性(具体特征见实施例1)。

本发明所提供的细菌为所筛选的一株好氧反硝化菌，系本发明人从大量烤烟烟叶表面细菌菌株中筛选出来的，具有显著降低烤烟TSNA的作用。

本发明所述的恶臭假单胞菌T2-2菌株的应用方法是：发酵培养→收集菌体→制备菌悬液→喷洒上部烤烟→人工陈化→卷烟。

恶臭假单胞菌T2-2菌株的发酵培养的条件为180rpm，28℃，12h。

恶臭假单胞菌T2-2菌株的发酵菌体的收集在发酵培养结束后，8000rpm，8min离心沉淀菌体。

恶臭假单胞菌T2-2菌株的发酵菌体通过麦云度法(见：赵斌和何绍江，2002)可制备成10⁸CFU/mL的菌悬液。

恶臭假单胞菌T2-2菌株10⁸CFU/mL的菌悬液在烤烟上部烟叶的喷洒用量为烟叶质量的10％，以烟叶喷洒后手捏不成团为宜。

恶臭假单胞菌T2-2菌株制备的10⁸CFU/mL菌悬液喷洒人工陈化烤烟上部烟叶的条件为处理温度28℃、相对湿度45％，处理时间21天。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

本发明的优点是

1.本发明属于生物领域，即利用微生物的方法，通过降解TSNA的前体物质——硝酸盐、亚硝酸盐，来降低TSNA含量，比传统的物理化学降低TSNA含量的方法更为方便、经济、环保。

2.本发明所获得的恶臭假单胞菌T2-2是一株好氧反硝化菌株，可应用于好氧与微氧环境，发酵工艺操作简单，发酵时间短，生长条件适宜，在普通培养基中即可生长良好，方便大规模生产。

3.本发明所获得的恶臭假单胞菌T2-2是从烤烟烟叶表面筛选出来的，比一般的外源细菌更容易在烤烟烟叶上生长。

4.本发明涉及的恶臭假单胞菌T2-2在烤烟上部烟叶人工陈化中的应用，完善了关于降低烤烟TSNA研究报道稀少的不足。

5.本发明所获得的恶臭假单胞菌T2-2，该菌株对TSNA的降低率较高，用无菌水配成菌悬液后，对烤烟上部烟叶叶面进行喷雾处理，与对照相比，烟叶中TSNA的关键组分NNN和NNK，分别下降NNN 28.33％和NNK 57.83％。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是恶臭假单胞菌T2-2菌株的16S rRNA的核苷酸序列。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是本发明恶臭假单胞菌T2-2在100×油镜下的菌体形态。

图3：是本发明恶臭假单胞菌T2-2在Giltay培养基中的颜色、产气变化。

图4：是用无菌水处理烤烟上部烟叶后，陈化过程中Ck的硝酸盐和亚硝酸盐的含量变化曲线。

图中：CK为对照实验，即用无菌水处理烤烟上部烟叶。

图5：是恶臭假单胞菌T2-2对烤烟上部烟叶处理后，陈化过程中硝酸盐和亚硝酸盐的含量变化。

图6：是不同浓度恶臭假单胞菌T2-2处理烤烟上部烟叶后，在14d时硝酸盐含量和21d时亚硝酸盐含量。

具体实施方式：

下面结合实例来进一步阐述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1恶臭假单胞菌T2-2的分离、筛选及微生物学分类鉴定

(1)本发明所获得的恶臭假单胞菌T2-2是这样筛选分离的：

a、选取20g烤烟烟叶进行驯化；驯化初始，将来自于武汉卷烟厂仓库的不同烟叶产地(湖北省、云南省)自然存放2年的烟叶，未经过人工陈化处理的烤烟烟叶用已灭菌的剪刀剪碎，选取20g置入300mL反硝化液体培养基中，于恒温培养箱中，28℃下培养2～5d；10倍稀释涂分离培养基平板，得到单菌落，多次经LB平板划线纯化后，转入斜面保藏。

b、从斜面中挑取少许菌接到装有8mL LB培养液的PA瓶中活化，12h后，按V/V计1～2％接种量接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，放入摇床，在温度为30℃，转速为180rpm的条件下培养10h。取1mL发酵液接入装有反硝化培养基的三角瓶中，得到对总氮去除率达到50％以上的菌株。

c、将总氮去除率达到50％以上的菌株进行发酵培养，取1mL发酵液接到装有Giltay培养基的试管中，放入28℃恒温箱中培养10～14d。期间观察试管的变色、产气情况，如图3。Giltay管中最先变色并最先产气的，其反硝化的能力最强。该Giltay培养基试管是这样实现的：将制备好的Giltay液体培养基，加入大试管(20mm×200mm)中，把缠有细线的小试管(12mm×75mm)倒立放入大试管中，将小试管的气体排尽，塞住大试管，留部分细线在大试管外，便于小试管的提升和降落，灭菌备用。

上述筛选分离中所需的培养基配方为：

反硝化培养基(或称富集培养基)：KNO₃2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、K₂HPO₄0.5g/L和酒石酸钾钠20.0g/L；加蒸馏水至1L；灭菌前将pH调至7.2；在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

分离培养基：KNO₃2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、K₂HPO₄0.5g/L和酒石酸钾钠20.0g/L，琼脂15～20g/L；加蒸馏水至1L；灭菌前调pH至7.2；在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

LB培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L和氯化钠10.0g/L，琼脂15～20g/L；加蒸馏水至1L；灭菌前调pH至7.2～7.4；在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

Giltay培养基：A溶液：1.0g KNO₃，1.0g天冬酰胺和5mL 1％BTB酒精溶液；加蒸馏水至500mL；B溶液：8.5g柠檬酸钠，1.0g MgSO₄·7H₂O，0.05g FeCl₃·6H₂O，1.0g KH₂PO₄，0.2g CaCl₂·2H₂O；加蒸馏水至500mL。将A溶液和B溶液这两种溶液混合；灭菌前调pH至7.0；在115℃高压蒸汽下灭菌30min。

(2)传统微生物学分类鉴定

1.形态特征：

菌落呈白色，光滑，边缘整齐，菌体呈短杆状，革兰氏染色呈阴性。

2.16S rDNA鉴定方法：

a.本发明的恶臭假单胞菌T2-2基因片段长度为1420bp，该菌的Genebank登录号：JF699758

b.16S rDNA引物设计与PCR过程：

其具体步骤如下：将恶臭假单胞菌T2-2(保藏号为CCTCC NO：M2011074)菌株接种于LB培养基，180rpm，28℃震荡培养12小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶，采用CTAB法和SDS法破壁(张瑞福，2003)，采用苯酚-氯仿-异戊醇提取基因组DNA(颜子颖和王海林，1998)，用16S rRNA通用引物正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，对其16S rRNA基因进行PCR扩增，将扩增的产物交由北京奥科生物技术有限责任公司进行测序。PCR条件为：94℃，5min；95℃，40s，55(-1℃/循环)℃，30s，72℃，25s，6循环；95℃，40s，55℃，45s，72℃，1.5min，30循环；72℃，5min，10℃，5min。PCR产物长度为1420bp，其核苷酸序列表如序列表SEQ ID NO：1所示。

3.生理生化检测

对分离到的分离菌T2-2进行37项相关生理生化检测，发现其与George M.Garrity《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII，1974年版中提供的标准菌株(Pseudomonas putida biovar B)的生理生化结果完全一致，最终将本发明的分离菌T2-2鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，其生理生化特征如表1。

表1恶臭假单胞菌T2-2的生理生化实验

“+”阳性反应，“-”阴性反应

参照经典的微生物学分类手册：George M.Garrity，《Bergey’s Mannual of SystematicBacteriology》Vol.VIII，1974年版的内容。根据其形态特征和生理生化特征，以及16S rRNA基因序列比对结果，经多相分类鉴定本发明所分离的菌株是一株恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，申请人将其命名为恶臭假单胞菌(Pseudomona sputida)T2-2，于2011年3月21日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2011074。

实施例2恶臭假单胞菌T2-2(CCTCC NO：M 2011074)反硝化实验

本发明所述的恶臭假单胞菌T2-2的反硝化实验是这样实现的：从斜面中挑取少许恶臭假单胞菌T2-2菌接到装有8mL LB培养液的PA瓶中活化，12h后，按V/V计1～2％接种量接种到装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，放入摇床，在温度为30℃，转速为180rpm的条件下培养10h。取1mL发酵液加入已制好的Giltay试管中，28℃下恒温培养箱中培养10～14d，培养完成后，离心去除菌体，测定其培养基中硝酸盐和亚硝酸盐的含量。如表2。

试管培养基配方为：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L和氯化钠10.0g/L；琼脂15～20g/L；加蒸馏水至1L。灭菌前调pH至7.2～7.4；在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

LB液体培养基配方为：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L和氯化钠10.0g/L；加蒸馏水至1L；灭菌前调pH至7.2～7.4；在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

本发明所述的硝酸盐和亚硝酸盐含量测定方法是这样实现的：硝酸盐是根据水杨酸法测定，亚硝酸盐是根据α-萘胺/磺胺法测定。

水杨酸法：取0.1mL样品液，加入0.4mL 5％水杨酸(5g水杨酸溶入100mL浓硫酸)，室温下放置20min，后再加8％NaOH，定容至10mL，静置至室温，于波长410nm处用722可见光分光光度计(上海奥普勒有限公司产品)检测。

α-萘胺/磺胺法：取2mL样品液，加入4mL 1％磺胺(1g磺胺溶入25mL浓HCl，用水稀释至100mL)，再加入4mL 0.02％α-萘胺(0.02gα-萘胺溶入1mL浓HCl，稀释至100mL)，25℃反应30min，于540nm波长处检测。

表2恶臭假单胞菌T2-2的硝酸盐降低率、亚硝酸盐增加率和总氮的降低率

注：a，p＝0.002＜0.01；b，p＝0.0098＜0.01；c，p＝0.0014＜0.01，具有极显著性。

*，硝酸盐；**，亚硝酸盐；***，总氮量。

实施例3恶臭假单胞菌T2-2(CCTCC NO：M2011074)在烤烟上部烟叶的应用

本发明所获得的恶臭假单胞菌T2-2(CCTCC NO：M2011074)在烤烟上部烟叶中的应用是这样实现的：菌株的试管种培养，液体发酵培养，收集菌体制备菌悬液，喷洒上部烤烟进行人工陈化，陈化结束后，压片切丝制成卷烟。

本发明所获得的恶臭假单胞菌T2-2喷施烤烟上部烟叶的具体步骤是这样实现的：菌株发酵培养后收集菌体，通过麦云度法制备成10⁸CFU/mL的菌悬液。以烟叶质量10％的用量对上部烤烟叶面进行喷雾处理，于光照培养箱中陈化。陈化条件为28℃，45％相对湿度，陈化时间21d，以无菌水喷雾处理为对照实验。

本发明所述的陈化时间是这样选择的：陈化中，分别于0d，7d，14d，21d，28d取样，测得烟样中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，如图4，图5。

结果表明，经恶臭假单胞菌T2-2处理后的烤烟上部烟叶，陈化过程中，其硝酸盐含量先降低，14d时，其硝酸盐含量最低，21d时含量略微上升，后显著上升；亚硝酸盐含量先缓慢增加，后显著降低，21d时，其亚硝酸盐含量最低，后又逐渐上升。其硝酸盐和亚硝酸盐的降低率如表3。故恶臭假单胞菌T2-2陈化烟叶的时间选为21d。

表3恶臭假单胞菌T2-2硝酸盐和亚硝酸盐的最大降低率

注：a，p＝0.03＜0.05；b，p＝0.0205＜0.05，具有显著性

本发明所述的菌悬液浓度选择是这样实现的：通过麦云度法制成10⁸CFU/mL菌悬液稀释成不同浓度梯度，即分别取出0mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，收集菌体，再分别加入1mL的无菌水混匀，制成浓度不等的菌悬液，以同等用量喷洒上部烤烟烟叶表面，在28℃，相对湿度45％的条件下光照培养箱中陈化21d。分别于0d，7d，14d，21d取样。结果表明，14d时，硝酸盐含量最低，21d时含量略有回升；21d时，亚硝酸盐含量最低。选取14d时的硝酸盐含量和21d时的亚硝酸盐含量为纵坐标，以菌悬液的体积梯度(即浓度梯度)为横坐标，如图6。

结果表明，菌悬液浓度为10⁸CFU/mL处理烤烟上部烟叶，得到硝酸盐和亚硝酸盐的含量最低。10⁸CFU/mL菌悬液以烟叶质量10％的用量喷洒烤烟上部烟叶表面，在28℃，相对湿度45％的条件下光照培养箱中陈化21d，检测该菌株降低TSNA的功能。

本发明菌株降低TSNA的功能检测

1、制备供试菌剂：按前述的菌株的培养方法制备供试菌剂；以无菌水处理作为对照。

2、菌剂对烟草处理方法

所试烟叶来自于武汉卷烟厂仓库的不同烟叶产地(湖北省、云南省)自然存放2年的烟叶，未经过人工陈化处理的烤烟上部烟叶，将供试菌剂(本发明)均匀喷雾烟叶表面，光照培养箱中陈化3周，培养条件为28℃，湿度45％，陈化完全后于50℃烘箱中烘干粉碎。

3、TSNA的测定方法

按国际通用的气相色谱仪(GC)和热能分析仪(TEA)联用的方法来测定各处理样品的TSNA的含量。所用仪器为：GC HP6890series型气相色谱仪和Orion TEA 610热能分析仪。

降低TSNA百分率的计算方法为：

降低百分率％＝(对照处理TSNA含量-菌株处理TSNA含量)×100/对照处理TSNA含量

4、实验结果

表4T2-2菌株叶面喷雾处理后TSNA的含量测定

表4注：NNN  即N-亚硝基去甲基烟碱

NNK  即4-(N-甲基-亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮

a，p＝0.01＜0.05，具有显著性；b，p＝0.002＜0.01，具有极显著性

*，NNN；**，NNK

结果表明，与对照相比，烟叶中TSNA的关键组分NNN和NNK，分别下降NNN 28.33％和NNK 57.83％。

本发明所述的恶臭假单胞菌T2-2(CCTCC NO：M2011074)处理调制后烟叶的评吸结果，如表5所示。

表5恶臭假单胞菌T2-2(CCTCC NO：M2011074)处理调制后烟叶的评吸结果

结果表明本发明所述的菌株能在微氧条件下高效降低烤烟中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，并最终降低烟叶中TSNA的含量，与对照相比，烟叶中TSNA的关键组分NNN和NNK，分别下降NNN 28.33％和NNK 57.83％。恶臭假单胞菌T2-2(CCTCC NO：M2011074)处理调制后烟叶的评吸结果表明，与对照相比，烟气中虽略带有刺激性，但通过综合评分可以得出该菌对烟叶品质几乎没有不良影响，为生产低危害、安全型卷烟提供优质原料，具有极大的应用潜力。

参考文献

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5.赵斌，何绍江.微生物学实验.科学出版社，2002，28；北京。

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9.颜子颖，王海林，译.精编分子生物学指南，科学出版社，北京，1998年版，39-40页。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一株降低烤烟烟叶亚硝胺的恶臭假单胞菌T2-2及用途

<130>

<141>2011-04-12

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1420

<212>DNA

<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1420)

<223>

<400>1

cctaacacat gcaagtcgag cggatgacgg gagcttgctc cttgattcag cggcggacgg   60

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Claims (1)

1.一株在好氧条件下生长能降低烤烟烟叶亚硝胺的反硝化细菌，其特征在于，该菌株是恶臭假单胞菌Pseudomonas putida)T2-2，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2011074，其16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示。 

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