CN1278635C - 降低烟草特有亚硝胺含量的生物制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及降低烟草特有亚硝胺含量的生物制剂及其制备方法，属生物技术领域。本发明的生产菌株铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa KenLXP30已于2003年7月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CCTCC NO.0985。本发明从大量烟草内生细菌中筛选出一株能够显著降低烟草特有亚硝胺含量的菌株KenLXP30，通过液体发酵制备成烟草降害生物制剂。本制剂可显著降低白肋烟烟草特有亚硝胺含量，在烟草工业上具有较好的应用价值。
Description
技术领域：
本发明涉及降低烟草特有亚硝胺含量的生物制剂及制备方法和应用，属生物技术领域。
背景技术：
烟草特有亚硝胺(Tobacco-specific nitrosamines，简称TSNA)是一组仅发现于烟草及其制品的致癌物质，主要包括N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)，4-(N-甲基-亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)等4种成分。其中NNN和NNK具有显著的致癌作用，而NAB和NAT则无明显的致癌作用。TSNA在不同烟草类型中的含量以白肋烟最高，香料烟和烤烟含量都较低。研究证明，TSNA的主要前体物质是生物碱和硝酸盐、亚硝酸盐，在收获前的绿色烟叶中没有TSNA存在，它们产生于收获后的调制和发酵过程中。过去20年以来，TSNA成为烟草科学研究中最受关注的领域之一。
随着人们对吸烟与健康问题的广泛关注及全世界戒烟和控烟等反吸烟运动的兴起，烟草业如何在既能满足消费者的需求，又能减少吸烟给消费者带来危害上面临严重挑战。TSNA是烟草及其制品中的主要有害物质之一，减少或消除TSNA含量是生产低危害、安全型卷烟的基础。TSNA的控制途径目前主要有良种选育、降低施氮水平、改革调制工艺、硝酸盐清除剂及抗生素的使用等。由于这些方法存在一定的局限性，目前尚未得到普遍推广应用。因此，研究开发具有实际应用价值的降低TSNA含量的新技术具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
发明内容：
本发明的主要目的是克服现有技术之不足，研究开发降低烟草特有亚硝胺含量的生物制剂，为生产低危害、安全型卷烟提供优质原料。
本发明采用的细菌是铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa KenLXP30菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2003年7月28日；保藏登记入册的编号CGMCC NO.0985。
KenLXP30菌株属于烟草内生细菌，系本发明人从大量烟草内生细菌菌株中筛选出来的，具有显著降低TSNA含量的能力，经中国农业科学院土壤肥料研究所中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)进行鉴定，确定是铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa KenLXP30菌株。
本发明Pseudomonas aeruginosa KenLXP30菌株主要特征为：杆状，无芽孢，革兰氏染色阴性，葡萄糖发酵阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阴性，VP试验阴性，硝酸盐还原阳性，亚硝酸盐还原阳性，抗100μg/ml的利福平和链霉素。
本发明是这样实现的：KenLXP30菌株的试管种培养，摇床扩大培养制备为生物制剂，将制剂应用于烟草上，测定降低TSNA的功能。
本发明细菌KenLXP30菌株的培养方法(以下为重量百分比)：
1、试管种培养
试管斜面培养基配方为：酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.5-1％，氯化钠0.3-0.8％，琼脂1.5-2％，pH7-8。
将KenLXP30菌株接种到试管斜面培养基上，28～35℃恒温培养1-2天，获得试管种。
2、液体发酵培养
液体发酵培养基配方为：酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.3-0.8％，氯化钠0.2-0.7％，磷酸氢二钾0.2-0.4％，葡萄糖0.2-0.6％，pH7-8。
将试管种接种到500ml三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml，于28～35℃摇床培养，培养时间2～3天，转速为150～200rpm，培养液下摇床后用稀释平板计数法测定菌悬液浓度，菌浓度为：每ml活菌数≥108。即得具有降低TSNA功能的生物制剂。
本发明生物制剂降低TSNA的功能试验
1、制备生物制剂：按前述KenLXP30菌株的培养方法制备试验用制剂；以未接种KenLXP30菌株的液体培养基处理作为对照。
2、生物制剂对烟草处理方法
(1)烟叶粉碎处理
采集生长成熟的白肋烟新鲜烟叶，用粉碎机粉碎，充分混匀，按1∶100比例将供试菌剂和粉碎烟叶充分混匀，置于30-35℃恒温培养7天后，于烘箱50℃烘干粉碎。
(2)叶面喷雾处理
采集生长成熟的白肋烟新鲜烟叶，将供试菌剂均匀喷雾接种于烟叶表面，然后在室温下自然调制3周，于烘箱50℃烘干粉碎。
(3)叶柄浸泡处理
将采集的新鲜烟叶叶柄基部浸泡于供试菌剂中48小时，然后在室温下自然调制3周，于烘箱50℃烘干粉碎。
(4)灌根接种处理
将供试菌剂灌根接种于正常生长的白肋烟烟株，按常规栽培调制方法调制后于烘箱50℃烘干粉碎。
3、TSNA测定方法
按国际通用的热能分析仪(TEA)和气相色谱仪(GC)联用方法测定各处理样品的TSNA含量。所用仪器为GC Autosystem XL型气相色谱仪(美国PE公司)、Tubroehrom色谱工作站(美国PE公司)和TEA 543热能检测器(美国Chelmsford公司)。降低TSNA百分率的计算方法为：
降低百分率％＝(对照处理TSNA含量-制剂处理TSNA含量)/对照处理TSNA含量×100
4、试验结果
(1)烟叶粉碎处理结果
表1 生物制剂处理粉碎烟叶后TSNA含量测定结果
| 处理 | TSNA含量(单位：μg/g) | 降低百分率 | ||||
| NNN | NAT | NAB | NNK | TSNA | ||
| KenLXP30菌株对照 | 0.2613.27 | 0.9360.52 | 0.011.55 | 1.48135.38 | 2.69210.62 | 98.72％- |
结果表明，生物制剂处理粉碎烟叶后白肋烟TSNA含量减少98.72％，表明本发明生物制剂能够显著降低白肋烟TSNA含量。
(2)叶面喷雾处理结果
表2 生物制剂叶面喷雾处理后TSNA含量测定结果
| 处理 | TSNA含量(单位：μg/g) | 降低百分率 | ||||
| NNN | NAT | NAB | NNK | TSNA | ||
| KenLXP30菌株对照 | 1.025.21 | 1.2410.62 | 0.020.17 | 0.262.18 | 2.5418.18 | 86.03％- |
结果表明，生物制剂叶面喷雾处理后白肋烟TSNA含量减少86.03％，表明本发明生物制剂能够显著降低白肋烟TSNA含量。
(3)叶柄浸泡处理结果
表3 生物制剂叶柄浸泡处理后TSNA含量测定结果
| 处理 | TSNA含量(单位：μg/g) | 降低百分率 | ||||
| NNN | NAT | NAB | NNK | TSNA | ||
| KenLXP30菌株对照 | 0.9326.59 | 1.3924.65 | 0.030.44 | 0.4912.15 | 2.8563.83 | 95.53％- |
结果表明，生物制剂叶柄浸泡处理后，TSNA含量减少95.53％。表明本发明制剂通过叶柄浸泡处理仍然具备显著降低白肋烟TSNA含量的功能。
(4)灌根接种处理结果
表4 生物制剂灌根接种处理后TSNA含量测定结果
| 处理 | TSNA含量(单位：μg/g) | 降低百分率 | ||||
| NNN | NAT | NAB | NNK | TSNA | ||
| KenLXP30菌株对照 | 1.647.57 | 1.436.93 | 0.070.22 | 0.512.10 | 3.6616.81 | 78.23％- |
结果表明，生物制剂灌根接种处理白肋烟后，TSNA含量减少78.23％，表明本发明制剂够降低白肋烟TSNA含量，但效果明显低于烟叶粉碎处理和叶柄浸泡处理。
总体结果表明，本发明制剂通过4种不同方式接种处理后均可有效降低白肋烟TSNA含量，其降低百分率为78.23％～98.72％，可大部分减少或基本消除TSNA在白肋烟中的含量，为生产低危害、安全型卷烟提供优质原料。该制剂4种处理方式降低TSNA含量的能力表现为：烟叶粉碎处理＞叶柄浸泡处理＞叶面喷雾处理＞灌根接种处理。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：
将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KenLXP30菌株接种到试管琼脂斜面上，培养基配方为：酪蛋白1.2％，大豆蛋白胨0.8％，氯化钠0.5％，琼脂1.7％，pH7.5。30℃恒温培养1天，获得试管种。
将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为：酪蛋白1.5％，大豆蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.025％，葡萄糖0.3％，pH7.5。将接好种的三角瓶于30℃下摇床(转速为180rpm)培养，培养时间2天，待菌浓度为达到每ml活菌数≥108时，即得具有降低TSNA功能的生物制剂。
实施例二：
基本同实施例一，不同之处在于液体培养基配方，其配方为：酪蛋白1％，大豆蛋白胨0.8％，氯化钠0.2％，磷酸氢二钾0.2％，葡萄糖0.6％，pH7。
实施例三：
基本同实施例一，不同之处在于液体培养基配方，其配方为：酪蛋白2％，大豆蛋白胨0.3％，氯化钠0.7％，磷酸氢二钾0.4％，葡萄糖0.2％，pH7.2。
Claims (2)
1、降低烟草特有亚硝胺含量的生物制剂，其特征在于该制剂的生产菌株为：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KenLXP30菌株。
2、降低烟草特有亚硝胺含量生物制剂的制备方法，由常规液体发酵方法生产，其特征在于：
2.1试管斜面培养基配方为：酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.5-1％，氯化钠0.3-0.8％，琼脂1.5-2％，琼脂1.5-2％，余下为水，pH 7-8；
2.2液体发酵培养基配方为：酪蛋白1-2％，大豆蛋白胨0.3-0.8％，氯化钠0.2-0.7％，磷酸氢二钾0.2-0.4％，葡萄糖0.2-0.6％，余下为水，pH 7-8；
2.3本发明生物制剂为含菌悬浮液，菌浓度为：每ml活菌数≥108。
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