发明内容:
本发明的主要目的是克服现有技术之不足,研究开发一株具有降低烟草特有亚硝胺含量的放射根瘤菌,达到降低TSNA含量,为卷烟生产提供优质原料。
本发明采用的细菌是放射根瘤菌Rhizobium radiobacter KenLXR34,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;地址:中国.北京.中关村;保藏日期:2003年7月28日;保藏登记入册的编号CGMCC NO:0986。
KenLXR34菌株属于烟草内生细菌,系本发明人从大量烟草内生细菌中筛选出来的,具有降低TSNA含量的功能。委托中国农业科学院土壤肥料研究所中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)进行鉴定,确定是放射根瘤菌Rhizobium radiobacterKenLXR34菌株。
本发明Rhizobium radiobacter KenLXR34菌株主要特征为:杆状,无芽孢,革兰氏染色阳性,葡萄糖发酵阴性,接触酶阳性,氧化酶阳性,甲基红试验阴性,VP试验阴性,硝酸盐还原阳性,亚硝酸盐还原阳性,抗100μg/ml的利福平和链霉素。
本发明是这样实现的:KenLXR34菌株的试管种培养,液体发酵培养,将菌剂应用于烟草上,测定降低TSNA的功能。
本发明KenLXR34菌株的培养方法(以下为重量百分比):
1、试管种培养
试管斜面培养基配方为:酪蛋白1-2%,大豆蛋白胨0.5-1%,氯化钠0.3-0.8%,琼脂1.5-2%,pH7-8。
将KenLXR34菌株接种到试管斜面培养基上,28~35℃恒温培养1-2天,获得试管种。
2、液体发酵培养
液体发酵培养基配方为:酪蛋白1-2%,大豆蛋白胨0.3-0.8%,氯化钠0.2-0.7%,磷酸氢二钾0.2-0.4%,葡萄糖0.2-0.6%,pH7-8。
将试管种接种到500ml三角瓶液体培养基中,每瓶装200ml,于28~35℃下摇床培养,培养时间2~3天,转速为150~200rpm,培养液下摇床后用稀释平板计数法测定菌悬液浓度,菌浓度为:每ml活菌数≥108个。
本发明KenLXR34菌株降低TSNA的功能试验
1、制备供试菌剂:按前述KenLXR34菌株的培养方法制备供试菌剂;以未接种KenLXR34菌株的液体培养基处理作为对照。
2、菌剂对烟草处理方法
(1)烟叶粉碎处理
采集生长成熟的白肋烟新鲜烟叶,用粉碎机粉碎,充分混匀,按1∶100比例将供试菌剂和粉碎烟叶充分混匀,置于30-35℃恒温培养7天后,于烘箱50℃烘干粉碎。
(2)叶面喷雾处理
采集生长成熟的白肋烟新鲜烟叶,将供试菌剂均匀喷雾接种于烟叶表面,然后在室温下自然调制3周,于烘箱50℃烘干粉碎。
(3)叶柄浸泡处理
将采集的新鲜烟叶叶柄基部浸泡于供试菌剂中48小时,然后在室温下自然调制3周,于烘箱50℃烘干粉碎。
(4)灌根接种处理
将供试菌剂灌根接种于正常生长的白肋烟烟株,按常规栽培调制方法调制后于烘箱50℃烘干粉碎。
3、TSNA测定方法
按国际通用的热能分析仪(TEA)和气相色谱仪(GC)联用方法测定各处理样品的TSNA含量。所用仪器为:GC Autosystem XL型气相色谱仪(美国PE公司)、Tubrochrom色谱工作站(美国PE公司)和TEA 543热能检测器(美国Chelmsford公司)。降低TSNA百分率的计算方法为:
降低百分率%=(对照处理TSNA含量-菌株处理TSNA含量)/对照处理TSNA含量×100
4、试验结果
(1)烟叶粉碎处理结果
表1 KenLXR34菌株处理粉碎烟叶后TSNA含量测定结果
处理 |
TSNA含量(单位:μg/g) | 降低百分率 |
NNN |
NAT |
NAB |
NNK |
TSNA |
KenLXR34菌株对照 |
6.0813.27 |
20.6860.52 |
0.461.55 |
54.34135.38 |
81.56210.62 |
61.28%- |
结果表明,本发明菌株对降低白肋烟TSNA有一定作用,处理粉碎烟叶后TSNA含量减少61.28%。
(2)叶面喷雾处理结果
表2 KenLXR34菌株叶面喷雾处理后TSNA含量测定结果
处理 |
TSNA含量(单位:μg/g) | 降低百分率 |
NNN |
NAT |
NAB |
NNK |
TSNA |
KenLXR34菌株对照 |
2.525.21 |
4.4910.62 |
0.060.17 |
1.212.18 |
8.2818.18 |
54.46%- |
结果表明,本发明菌株对降低白肋烟TSNA有一定作用,叶面喷雾处理烟叶后TSNA含量减少54.46%。
(3)叶柄浸泡处理结果
表3 KenLXR34菌株叶柄浸泡处理后TSNA含量测定结果
处理 |
TSNA含量(单位:μg/g) | 降低百分率 |
NNN |
NAT |
NAB |
NNK |
TSNA |
KenLXR34菌株对照 |
0.4226.59 |
0.6324.65 |
0.020.44 |
0.0412.15 |
1.1063.83 |
98.28%- |
结果表明,本发明菌株处理烟叶叶柄后,白肋烟TSNA含量有显著下降,其下降率为98.28%,表明本菌株具有降低白肋烟TSNA含量的功能,在烟草工业上具有潜在的应用价值。
(4)灌根接种处理结果
表4 KenLXR34菌株灌根接种处理后TSNA含量测定结果
处理 |
TSNA含量(单位:μg/g) | 降低百分率 |
NNN |
NAT |
NAB |
NNK |
TSNA |
KenLXR34菌株对照 |
2.727.57 |
1.286.93 |
0.030.22 |
0.472.10 |
4.5016.81 |
73.23%- |
结果表明,本发明菌株灌根接种处理后,白肋烟TSNA含量减少73.23%,表明本发明菌株具有低白肋烟TSNA含量功能,但效果明显低于叶柄浸泡处理。
总体结果表明,本发明菌株通过不同方式接种处理后均可有效降低白肋烟TSNA含量,其中叶柄浸泡处理效果最好,降低TSNA含量达到98.28%,而4种处理方式降低TSNA含量的能力表现为:叶柄浸泡处理>灌根接种处理>烟叶粉碎处理>叶面喷雾处理。因此,KenLXR34菌株可大部分减少或基本消除TSNA在白肋烟中的含量,为生产低危害、安全型卷烟提供优质原料,具有极大的实际应用潜力。
具体实施方式:
下面用实施例来进一步详述本发明,但本发明的内容并不局限于此。
实施例一:
将放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)KenLXR34菌株接种到试管斜面上,培养基配方为:酪蛋白1.2%,大豆蛋白胨0.8%,氯化钠0.5%,琼脂1.7%,pH7.5。30℃恒温培养1天,获得试管种。
将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中,培养基配方为:酪蛋白1.5%,大豆蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%,磷酸氢二钾0.025%,葡萄糖0.3%,pH7.5。将接好种的三角瓶于30℃下摇床(转速为180rpm)培养,培养时间2天,待菌浓度达到每ml活菌数≥108时,即可应用于烟草上,能够降低白肋烟TSNA含量。
实施例二:
基本同实施例一,不同之处在于液体培养基配方,其配方为:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.2%,氯化钠0.5%,pH7.0。
实施例三:
基本同实施例一,不同之处在于液体培养基配方,其配方为:营养琼脂粉4.5%,pH自然。