CN107760618B - 利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法。所用菌株分类命名为洞穴芽球菌(Blastococcus cavernae sp),于2016年12月9日保存于国家典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号M2016739。经过微生物学特性分析和16S rDNA基因序列分析表明，该菌株是一种新的细菌。烟叶喷施SYSUZL‑2菌剂再经醇化发酵后，可以使烟叶香气品质、还原糖含量增加，使蛋白质、纤维素、总氮、烟碱含量下降，糖氮比、糖碱比和氮碱比的比值趋于上升，使烟叶内在化学成分更为协调，感官品质也明显提升。

Description

利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法
技术领域
本发明属于烟草醇化发酵技术领域，具体是涉及一种利用新发现的细菌 (洞穴芽球菌)提升烟叶品质的方法。
背景技术
烟草是我国财政的重要支柱之一，对我国的社会和经济发展作出了巨大 贡献。要推进我国烟草进程，实现卷烟工业可持续发展，就必须走烟草科技 创新之路。烟叶的品质直接影响着卷烟的内在吸味。国家烟草专卖局明确指 出，要“攻克影响烟叶香气质、香气量的关键技术”，缩小与国外烟叶质量差 距，以提高国内外市场竞争力。
烟叶发酵是烟草加工过程中的主要工艺环节。在醇化发酵过程中,烟叶 主要化学成分会发生相应的变化,青杂气和刺激性逐渐降低,香气显露,吃 味醇和,色泽均匀并加深，故而烟叶醇化发酵对烟叶质量的改变起着非常重 要的作用。改进烟叶发酵技术，增进烟叶的香吃味质量，已成为卷烟工业提 高加工工艺技术水平的重要手段。
微生物种类丰富，长期以来，人们利用纯培养技术对环境中的微生物进 行调查研究和开发利用。随着科学技术的发展，微生物资源在科技研究及生 物产业中的重要性日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资 源，其不断丰富将为我国生物技术的发展奠定坚实的物质基础。国内外烟草 工作者在烟草微生物分离和利用微生物发酵改善烟草品质、改进烟叶发酵进 程、缩短烟叶发酵周期等方面做了很多工作,特别是通过施加选育的微生物 及制剂于烟草中,通过微生物的代谢活动降低烟碱等有害成分,增加烟草香吃味,提高烟草质量等。但所涉及的微生物多限于产香酵母。
本发明首次从自然界分离得到一种洞穴芽球菌，经鉴定为微生物新种， 目前未有任何关于所述洞穴芽球菌及其用途的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用洞穴芽球菌提升 烟叶品质的方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。
一种利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法，其特征在于：将洞穴芽球菌 制成菌剂后与烟叶共同发酵；所述的洞穴芽球菌分类命名为洞穴芽球菌 SYSUZL-2(Blastococcuscavernae sp.SYSUZL-2)，该菌株于2016年12月 9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016739。
所述的共同发酵具体为：将洞穴芽球菌扩大发酵培养后制成菌剂，称取 预先平衡水分至13％的烟丝，喷施洞穴芽球菌菌剂，以烟丝重量计，每1000 克烟丝喷施菌剂量为10～30mL，然后将处理后的烟丝置于22℃，湿度60％ 的恒温恒湿环境中发酵48h，120℃烘干烟丝。
本发明的洞穴芽球菌(Blastococcus cavernae sp).SYSUZL-2，由下述 方法筛选得到：
从云南省石林县印象烟庄烟田土壤中分离得到，固体培养过程中，发现 绝大部分的微生物具有产生挥发性物质的能力，经液体发酵后产生的气息明 显不同。在获得的纯培养分离菌株中，筛选得到可在含有简单碳氮源的培养 基上产生挥发性、且为特殊香味气息的菌株SYSUZL-2。GC-MS鉴定结果显 示，菌株SYSUZL-2产生几类主要挥发性化合物，香茅醇、香叶醇以及莰醇、 萜品醇、芳樟醇。莰醇临床上有抗炎止痛的功效，芳樟醇具有清甜气息可用 于卷烟加香除杂，香茅醇具有抗真菌、抗氧化活性，集中应用在医药方面。 萜品醇可用作食物香精和化妆品底物，运用广泛。
所述的洞穴芽球菌SYSUZL-2在大多数培养基上生长良好，基内菌丝灰 色至黄褐色。明胶液化、淀粉水解、硝酸还原呈阳性，牛奶凝固、胨化呈阴 性，不产生硫化氢，不产生黑色素。能利用葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、 肌醇、甘露醇、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸。细胞壁含有meso-DAP，全细 胞水解物含有半乳糖和阿拉伯糖。
经过微生物学特性分析和16S rRNA基因序列分析表明，所述的洞穴芽 球菌SYSUZL-2是一种新的细菌，其16S rRNA基因核苷酸序列如序列表所 示。
本发明的有益效果是：
1.微生物学特性分析和16S rDNA基因序列分析表明，所述的洞穴芽球 菌SYSUZL-2一种新的细菌，实验证明该菌株能有效提高烤烟内在品质、增 加烟叶香气。本发明成功地将生物技术引入烟草生产中，是烟草生产技术的 一个重要突破。
2.通过改善烟叶品质，大大提高烟叶可用性。加速烟叶发酵，提高烟叶 等级质量，使烟叶可溶性还原糖含量增加，而蛋白质、纤维素、总氮、烟碱 含量下降，内在化学成分更为协调，烟叶抽吸品质得到明显提升。
3.工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，对促进卷烟工业健康 发展具有积极意义。
保藏生物材料的说明
本发明的菌株，已于2016年12月9日，保藏于中国典型培养物保藏中 心(CCTCC)，该中心地址：中国.武汉.武汉大学，该菌株分类命名为洞穴芽 球菌SYSUZL-2(Blastococcus cavernae sp.SYSUZL-2)，保藏编号CCTCC NO：M 2016739。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例 对本发明作进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发 明，并不是对本发明技术方案的限定。
实施例1
——洞穴芽球菌SYSUZL-2在提升烟叶品质中的应用，具体步骤如下：
(1)斜面培养：培养基：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸 水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫 酸镁0.05g；琼脂15g；蒸馏水1000ml，pH7.2；培养温度为28℃，培养时 间为48h。
(2)种子培养：从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养。种 子培养基：糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g； 硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，pH7.2，培养温度为28℃，培养 时间36小时。
(3)发酵培养：按10％的接种量接到种子培养基中，摇瓶培养。培养 基：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水 1000ml，pH7.2，在全温振荡器中振荡(121r/min)发酵48h，培养温度为28℃。
(4)取发酵培养液1L，以3500r/min离心10min，去上清，用无菌水 洗涤沉淀、离心，去上清，重复2次，最后用100mL无菌水振荡均匀，使 用时稀释10倍即为菌剂。
(5)烟叶发酵
本研究采用昆明K326B2F和昆明红大C2F烟叶为处理对象。处理浓度为 每1000克烟丝喷施菌剂量10mL，对照组喷施等量无菌水，三次重复。将处 理后的烟叶样品放入22℃，湿度60％的恒温恒湿箱内发酵48h，取样品测其 主要化学成分，测得数据取平均值进行分析。
——样品处理及烟叶主要化学成分分析
1)样品处理：取烟叶样品，先用旋风磨粉碎，烟末样品在40℃下干燥 约3h(含水率6％-8％)，过40目筛，装入样品瓶，盖紧瓶盖，常温下避光 贮存。
2)烟叶主要化学成分分析：Nicolet Antaris型傅立叶变换近红外光谱仪, 配备TQ analyst 6.2定量分析软件(美国Thermo Nicolet公司)。
——化学成分测定结果
烟叶的化学成分检测结果如下(详见表1，2)，实验结果表明，从单一 化合物看，经菌剂处理的烟叶内在化学成分发生了明显变化。总糖、还原糖 含量比对照增加较大，总氮、纤维素、蛋白质、烟碱含量与对照相比均有所 下降。糖氮比、糖碱比、氮碱比均有所改善。系统的试验数据说明，经菌剂 处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善 烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表1 菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表2 菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
——处理烟样感官评吸
将处理组和对照组的烟丝分别卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度 60％，温度22℃条件下平衡24h后，由12位卷烟专业评吸专家组成的评吸小 组进行评吸。专家评吸认为：利用洞穴芽球菌SYSUZL-2处理后的烟叶样品， 具有明显提调烟香、减少杂气、降低刺激的良好效果，结果见表3。
表3 菌剂对感官评吸的影响
实施例2
重复实施1，有以下不同点：处理浓度为每1000克烟丝喷施菌剂量20mL。
——化学成分测定结果
烟叶的化学成分检测结果如下(详见表4，5)，实验结果表明，从单一 化合物看，经菌剂处理的烟叶内在化学成分发生了明显变化。总糖、还原糖 含量比对照增加较大，总氮、纤维素、蛋白质、烟碱含量与对照相比均有所 下降。糖氮比、糖碱比、氮碱比均有所改善。系统的试验数据说明，经菌剂 处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善 烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表4 菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表5 菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
——处理烟样感官评吸
将处理组和对照组的烟丝分别卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度 60％，温度22℃条件下平衡24h后，由12位卷烟专业评吸专家组成的评吸小 组进行评吸。专家评吸认为：利用洞穴芽球菌SYSUZL-2处理后的烟叶样品， 具有明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激、提升津甜感的良好效果，结 果见表6。
表6 菌剂对感官评吸的影响
实施例3
重复实施1，有以下不同点：处理浓度为每1000克烟丝喷施菌剂量30mL。
——化学成分测定结果
烟叶的化学成分检测结果如下(详见表7，8)，实验结果表明，从单一 化合物看，经菌剂处理的烟叶内在化学成分发生了明显变化。总糖、还原糖 含量比对照增加较大，总氮、纤维素、蛋白质、烟碱含量与对照相比均有所 下降。糖氮比、糖碱比、氮碱比均有所改善。系统的试验数据说明，经菌剂 处理的各类烟丝各项指标均优于对照，烟丝内各成分趋于平衡。有利于改善 烟叶内在品质，提高烟叶香气。
表7 菌剂对烟叶主要化学成分含量的影响
表8 菌剂对烟叶的糖/氮、糖/烟碱、氮/烟碱比值的影响
——处理烟样感官评吸
将处理组和对照组的烟丝分别卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度 60％，温度22℃条件下平衡24h后，由12位卷烟专业评吸专家组成的评吸小 组进行评吸。专家评吸认为：利用洞穴芽球菌SYSUZL-2处理后的烟叶样品， 具有明显提升香气量、增加香气丰富性，降低刺激，提升津甜感的良好效果， 结果见表9。
表9 菌剂对感官评吸的影响
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> DNA
<213> 洞穴芽球菌(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1

Claims (2)

1.一种利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法，其特征在于：将洞穴芽球菌制成菌剂后与烟叶共同发酵；所述的洞穴芽球菌分类命名为(Blastococcus cavernae sp.).SYSUZL-2，该菌株于2016年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号M2016739。
2.根据权利要求1所述的利用洞穴芽球菌提升烟叶品质的方法，其特征在于：将所述的洞穴芽球菌.SYSUZL-2扩大发酵培养后制成菌剂，称取预先平衡水分至13％的烟丝，喷施洞穴芽球菌菌剂，以烟丝重量计，每1000克烟丝喷施菌剂量为10～30mL，然后将处理后的烟丝置于22℃，湿度60％的恒温恒湿环境中发酵48h，120℃烘干烟丝。
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