CN113073062B - 一种复合微生物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合微生物制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其制备方法和应用。所述复合微生物制剂采用市售酿酒酵母和中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的保藏编号为CGMCC NO.13905的嗜麦芽寡养单胞菌，经菌种活化、制备发酵液、离心、复配等步骤制备而成。烟叶经过所述复合微生物制剂发酵后，烟叶化学成分协调性改善，巨豆三烯酮等6种致香成分含量明显增加，新生成了1‑己烯‑3‑醇等6种致香物质成分，烟叶品质明显提升。

Description

一种复合微生物制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
烟叶发酵是提高烟叶可用性和卷烟感官质量的一种加工方法，经发酵后的烟叶，可以弥补烟叶本身不同程度的品质缺陷，如减轻烟叶本身的青杂气、降低刺激性，提升卷烟香气质和香气量，改善抽吸时的余味和吸味等。合适的发酵工艺可以极大改善烟叶的品质，提高卷烟质量，是卷烟加工中极为重要的步骤。
烟叶中含有上千种各种各样的化合物，包括非挥发性的大分子物质比如纤维素、淀粉、蛋白质以及果胶等；也含有大量的半挥发性和挥发性的小分子物质，比如各种酸类、醇类、醛类以及酯类等化合物。这些化合物的种类和含量比例决定了烟叶的品质。其中，淀粉是一类对烟叶品质影响比较大的多糖。烟叶淀粉含量过高，在烟支燃烧时会影响燃烧速度和燃烧的完全性，而且会产生焦糊味和杂气，降低卷烟的感官质量。而小分子的醇类、醛类、酯类、酮类、吡啶类以及吡嗪类等物质则对烟叶的香气品质有重要影响。
烟叶发酵过程与其表面存在大量并且种类繁多的微生物密切相关。在烟叶发酵过程中，这些微生物可以将烟叶中的一些大分子物质如蛋白质、淀粉降解为单糖和氨基酸等一些小分子，然后这些小分子物质在经过一系列反应可以生成醇、醛、酸、酯、酮等香味成分。筛选合适的微生物用于发酵烟叶，将烟叶中的淀粉转化为还原糖，可以减少卷烟的杂气，改善口感。利用微生物在烟叶发酵过程中代谢生成各种与烟气相谐调的香味物质，使烟叶化学成分间趋于协调，则可以提高烟叶的香气品质。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提高烟叶的香气品质，从而提供一种复合微生物制剂、制备复合微生物制剂的方法、复合微生物制剂在烟叶发酵和/或提高烟叶的香气品质中的应用。
第一方面：本发明提供一种复合微生物制剂，包含酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌；酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌的活菌数比为1：2至2：1。
可选的，酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌的活菌数比为1：1。
可选的，所述酿酒酵母为购自安琪酵母股份有限公司的耐高温酿酒高活性干酵母。
可选的，所述嗜麦芽寡养单胞菌为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的保藏编号为CGMCC NO.13905的菌株。
第二方面：一种制备复合微生物制剂的方法，所述复合微生物制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)制备发酵液，将活化后的酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌分别接种到发酵培养基中发酵制备得到发酵液；
(2)将两株菌的发酵液复配。
可选的，所述步骤(2)具体包括如下步骤：将发酵液离心，除去上清液，收集湿菌体，重悬菌体得菌液，按比例将两株菌的菌液进行复配；
可选的，所述方法还包括菌种活化培养的步骤：分别挑取酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌菌株，接种到活化培养基中进行活化，即得活化后的酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌；
所述活化培养基为PDA培养基；活化培养时间为12h至72h；活化培养的温度为28-30℃；
可选的，制备发酵液的步骤中还包括制备种子液的步骤，包括将活化后的酿酒酵母接种到M1培养基中，25℃至35℃、150-200rpm培养12至36小时，制备得到酿酒酵母种子液；
可选的，将所述酿酒酵母种子液按1％-2％(v/v)的接种量接种到发酵M1培养基中，25℃至35℃、150-200rpm培养12至36小时，制备得到酿酒酵母发酵液；
可选的，将活化后的嗜麦芽寡养单胞菌接种到M2培养基中，25℃至35℃、150-200rpm培养12至36小时，制备得到嗜麦芽寡养单胞菌种子液；
可选的，将所述嗜麦芽寡养单胞菌种子液按1％-2％(v/v)的接种量接种到M2培养基中，25℃至35℃、150-200rpm培养12至36小时，制备得到嗜麦芽寡养单胞菌发酵液；
步骤(1)中，所述酿酒酵母发酵培养基(M1)含有：K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，NaNO3 3g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，蔗糖30g/L；所述嗜麦芽寡养单胞菌发酵培养基(M2)含有：KNO3 1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，麦芽糖1g/L；所述的发酵条件为：在25℃至35℃、150-200rpm发酵12至36小时。
可选的，步骤(2)中，离心条件为：8000rpm-12000rpm；离心时间为5至15min。
可选的，步骤(2)中菌液复配的具体步骤为：调节两菌株菌液中的菌体浓度一致，然后将两种菌液按体积比为1：2至2：1的比例进行复配，即得复合微生物制剂；
可选的，调节后两菌株的菌液OD600均为0.8或调节后两菌株菌液中菌体浓度为106cfu/ml。
第三方面：本发明提供复合微生物制剂，或上述方法制备得到的复合微生物制剂在烟叶发酵中的应用。
可选的，按烟叶(干基)与复合微生物制剂的比为20g：1ml至5g：1ml，将复合微生物制剂均匀喷洒至烟叶表面；所述烟叶为复烤后烟叶；所述烟叶等级为如下任一一种：
1)上部烟叶；
2)中部烟叶；
3)下部烟叶；
4)包含上述1)-3)中任意2种或2种以上的混合等级烟叶；
可选的，上部烟叶具体为上桔一B1F、上桔二B2F、上桔三烟叶中的任意一种或几种的混合等级烟叶；
中部烟叶具体为中桔一C1F、中桔二C2F、中桔三C3F烟叶中的任意一种或几种的混合等级烟叶；
下部烟叶具体为下桔一X1F、下桔而成X2F、下桔三三X3F烟叶中的任意一种或几种的混合等级烟叶；
可选的，烟叶喷洒微生物制剂后，放置于25℃-35℃、相对湿度75％条件下发酵12小时-48小时；
可选的，烟叶喷洒微生物制剂后，放置于30℃、相对湿度75％条件下发酵24小时。
将发酵好的烟叶置于40℃烘箱中烘干至烟叶水分含量为12％即为成品烟叶。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供一种复合微生物制剂，包含酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌；酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌的活菌数比为1：2至2：1。烟叶经过上述复合微生物制剂发酵后，烟叶化学成分协调性改善，巨豆三烯酮等6种致香成分含量明显增加，新生成了1-己烯-3-醇、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4氢-吡喃-4-酮、3-脱氧-d-甘露糖酸内酯和葡萄糖酸内酯等六种香味物质，烟叶品质明显提升。
具体实施方式
PDA培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、去离子水1000ml、自然pH；
培养基M1：K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 0.5g/L，NaNO3 3g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，蔗糖30g/L。
培养基M2：KNO3 1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，麦芽糖1g/L。
2016年广西百色复烤后烟叶，等级：上桔三(B3F)烟叶，由广西中烟工业有限责任公司提供。
实验设备及检测方法：
(1)烟叶常规化学成分测定
使用AA3型连续流动分析仪(德国SEALAnalytical)对烟叶常规化学成分进行分析；方法采用：《YCT160-2002烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》、《YCT162-2011烟草及烟草制品氯的测定连续流动法》、《YCT 173-2003烟草及烟草制品中钾的测定法火焰光度法》、《YCT 159-2002烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》测定烟叶中的总植物碱、总糖、还原糖、烟碱、钾和氯的含量。
(2)烟叶致香成分分析
使用GC-MS对烟叶中的致香成分进行测定分析。GC-MS分析条件设定如下：
色谱条件：HP-5MS毛细管柱(60m×250μm×0.25μm)；进样口温度：240℃；载气：99.999％高纯度氦气，流速：1.0ml/min；分流模式为不分流进样，进样量为1.0μL。
升温程序：设置50℃(保持4min)后以3℃/min的升温速度到70℃(保持5min)，再以2℃/min的速度升温到100℃(保持17min)，然后以2℃/min的升温速度到120℃(保持10min)，最后以6℃/min的升温速度到280℃(保持0min)。
质谱条件：传输线温度280℃；离子源温度280℃；四级杆温度150℃；电子倍增器电压2.28kV；电离方式为电子轰击(EI)，电子能量70eV；溶剂延迟10min；全扫描检测，扫描质量范围(m/z)35～500u。
(3)感官质量评价
采用单料烟评价方法对烟叶的感官质量评价。将烟叶感官质量评价指标香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、浓度和劲头分别打分，单项指标满分为10分，分值越高，品质越高。
实施例1
下述酿酒酵母为耐高温酿酒高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)。嗜麦芽寡养单胞菌由郑州轻工业大学食品与生物工程学院赠送，嗜麦芽寡养单胞菌已于2017年03月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.13905，该菌株在公开号为CN107523518B的专利中公开过。
复合微生物制剂的制备，包括如下步骤：
(1)从-80℃冰箱中取出保存酿酒酵母，转接PDA培养基，在28℃培养箱里培养24h。挑选较大的菌落，接入30mL的液体培养基M1中，在28℃，180rmp的条件下培养24h，获得种子液。以2％(v/v)接种量接种于300mL M1液体培养基中，在相同条件下培养24h。将菌液在8000rpm下离心10min，去除上清，将沉淀溶于30mL无菌水中，重复两次，用无菌水将菌体浓度调整为OD600＝0.8，备用。
(2)从-80℃冰箱中取出保存嗜麦芽寡养单胞菌S.maltophilia，转接PDA培养基，在30℃培养箱里培养12h。挑选较大的菌落，接入30mL的M2培养基中，在30℃，180rmp的条件下培养12h，获得种子液。以2％(v/v)接种量接种于300mL M2液体培养基中，在30℃，180rmp的条件下培养12h(可以为12h-16h)。将菌液在8000r下离心10min，去除上清，将沉淀分别溶于30mL无菌水中，重复两次，用无菌水将菌体浓度调整为OD600＝0.8，备用。
实施例2
取实施例1中制备的菌液，按照酿酒酵母：嗜麦芽寡养单胞菌的体积比＝1：1均匀混合，取出混合好的菌液20mL，均匀喷施于200g 2016年广西百色B3F烟叶(等级为B3F)上，在30℃，湿度75％条件下发酵24h。取20mL无菌水，均匀喷洒在200g 2016年广西百色复烤后烟叶(等级为B3F)上，在同样的温湿度下发酵24h，作为试验对照。分别取50g处理好的烟叶，置于烘箱中40℃条件下烘干至含水量12％，切丝，用于感官质量评价。剩余烟叶置于烘箱中40℃条件下继续烘4h，然后用植物粉碎机粉碎，用于烟叶常规化学成分和香味物质成分检测。以未处理烟叶作为空白对照。将上述实验重复三次，进行统计学分析，结果见下表。
(1)烟叶常规化学成分含量测定
表1烟叶常规化学成分含量
Figure BDA0003010503140000081
烟叶水溶性总糖含量与烟碱含量应保持适当的比例，简称糖碱比。糖碱比例协调能使烟气在醇和的同时又保持具有香气、吃味及适宜的浓度和劲头。一般烤烟的糖碱比以6-15为宜，糖碱比过低，卷烟烟气口感差，杂气多，刺激性大。由表1中数据可以看出，空白对照组和试验对照组烟叶的各项指标基本一致，而试验组烟叶的烟碱含量下降，总糖和还原糖的含量与空白相比上升，这是因为在发酵过程中烟叶内淀粉发生了分解。试验烟叶的糖碱比为7.60，显著高于空白对照烟叶(P<0.05)，说明烟叶经过发酵处理后，化学成分协调性有了明显的改善。
(2)烟叶致香成分检测
巨豆三烯酮、大马酮、茄酮、二氢大马酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯是烟叶中重要的6种香味物质，因此该6种香味物质含量的变化作为微生物处理后烟叶品质改变的重要指标。从表2中可知，空白组烟叶和对照组烟叶的6种致香物质含量基本一致，没有明显差别。烟叶经过发酵处理后，试验烟叶中巨豆三烯酮、茄酮、大马酮、二氢大马酮、香叶基丙酮和二氢猕猴桃内酯等6种致香物质含量明显高于空白和对照组烟叶，其中，试验烟叶中巨豆三烯酮含量比空白组烟叶高6.1％，试验组烟叶中大马酮含量比空白组烟叶高18.3％，试验组烟叶中茄酮含量比空白组烟叶高8.3％，试验组烟叶中二氢大马酮含量比空白组烟叶高24.92％，试验组烟叶中香叶基丙酮含量比空白组烟叶高36.0％，试验组烟叶中二氢猕猴桃内酯含量比空白组烟叶高5.9％，发酵试验烟叶中这6种致香物质含量总量达到55.92μg/g烟叶，显著高于空白组和对照组烟叶。另外，试验烟叶经过发酵后，新生成了1-己烯-3-醇、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4氢-吡喃-4-酮、十六酸3-羟基甲酯、2,4-二甲基-4-辛醇、3-脱氧-d-甘露糖酸内酯和葡萄糖酸内酯等六种香味物质。从表2可以看出，试验烟叶经过发酵处理后，巨豆三烯酮等12种致香成分含量达到了83.12μg/g烟叶，比空白组烟叶增加了63.91％，具有显著的增香效果。
表2烟叶部分重要致香物质含量
Figure BDA0003010503140000091
Figure BDA0003010503140000101
(3)感官质量评价
对空白烟叶和处理后的烟叶进行切丝、卷制，然后将各组卷烟样品(每支烟只总重0.80±0.01g)在温度(22±2)℃、相对湿度(60±5)％的恒温恒湿箱中平衡24h后，依据单料烟评价方法对卷烟进行质量评吸鉴定和评价。
表3烟叶感官质量评价
Figure BDA0003010503140000102
注：单项指标满分10分，分数越高，品质越好。
从烟叶感官质量评价结果可知，空白组烟叶和对照组烟叶的感官质量基本一致，没有明显差别。发酵处理后烟叶香气质有所改善，香气量和香气浓度增加，刺激性减少，杂气减少，余味干净舒适，烟叶的品质得到明显改善。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种复合微生物制剂，其特征在于，包含酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的活菌数比为1：2至2：1；
所述嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的保藏编号为CGMCC NO.13905的菌株。
2.根据权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌的活菌数比为1：1。
3.一种制备权利要求1-2任一所述的复合微生物制剂的方法，其特征在于，所述复合微生物制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)制备发酵液，将活化后的酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌分别接种到发酵培养基中发酵制备得到发酵液；
(2)将两株菌的发酵液复配。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：将发酵液离心，除去上清液，收集湿菌体，重悬菌体得菌液，按比例将两株菌的菌液进行复配。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括菌种活化培养的步骤：分别挑取酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌菌株，接种到活化培养基中进行活化，即得活化后的酿酒酵母和嗜麦芽寡养单胞菌；
所述活化培养基为PDA培养基；活化培养时间为12h至72h；
步骤(1)中，酿酒酵母发酵培养基含有：K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KCl 0.5g/L，NaNO3 3g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，蔗糖30g/L；嗜麦芽寡养单胞菌发酵培养基含有：KNO31.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，NaCl0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，麦芽糖1g/L；所述的发酵条件为：在25℃至35℃、150-200rpm发酵12至36小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，离心条件为：8000rpm-12000rpm；离心时间为5至15min。
7.根据权利要求4至6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中菌液复配的具体步骤为：调节两菌株菌液中的菌体浓度一致，然后将两种菌液按体积比为1：2至2：1的比例进行复配，即得复合微生物制剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，调节后两菌株的菌液OD600均为0.8或调节后两菌株菌液中菌体浓度为106cfu/ml。
9.权利要求1或2所述的复合微生物制剂，或权利要求3-8任一项所述方法制备得到的复合微生物制剂在烟叶发酵和/或提高烟叶的香气品质中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，按烟叶与复合微生物制剂的比为20g：1ml至5g：1ml，将复合微生物制剂均匀喷洒至烟叶表面；所述烟叶为复烤后烟叶；烟叶等级为如下任一一种：
1)上部烟叶；
2)中部烟叶；
3)下部烟叶；
4)包含上述1)-3)中任意2种或2种以上的混合等级烟叶。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，烟叶喷洒微生物制剂后，放置于25℃-35℃、发酵12小时-48小时。
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