CN107354109A - 一种用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂，由质量比为(0.001～1)∶(0.001～1)∶(0.001～1)的枯草芽孢杆菌Y1、枯草芽孢杆菌X7、枯草芽孢杆菌X8组成，三种枯草芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号分别为：CGMCC No.13602、CGMCC No.13603和CGMCC No.13604。同时，本发明还公开了该复合微生物制剂在烟叶原料发酵中的应用，将烟叶原料进行切片、回潮处理、切丝后，将赋香复合微生物制剂喷施于烟丝表面，恒温恒湿发酵后烘干。此赋香复合微生物制剂可明显改善的单等级原料烟叶和叶组的品质和感官质量。
Description
技术领域
本发明属于卷烟微生物技术领域，涉及一种用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂及其应用。
背景技术
烟叶醇化是烟草加工过程中的重要环节，其对烟叶吸食品质的形成具有重要影响。这一过程中伴随着复杂的物理、生理生化和化学反应，烟叶内大分子有机物质和化学成分在氧化反应、酶促反应的作用下不断分解、转化和消耗，小分子有机物不断形成，促进了烟叶香气质量的变化。
一般烟草工业企业烟叶发酵方法多采用自然发酵法，是指把调制（包括初、复烤）获得适当水分的烟叶经过包装后存放在仓库中，利用自然环境条件，在自然的温、湿度范围内，利用烟叶内酶的活动，缓慢地进行发酵，以达到改善烟叶品质的目的。但这种方法所用时间长，通常需要1～2年，且会占用大量仓库和资金。
成熟采摘后的烟叶本身便存在着大量的细菌、真菌、酵母菌放线菌等不同的微生物类群。陈福星等的研究表明，在烟叶自然醇化发酵的中后期，仍会有相当数量的微生物存活，数量最多的是细菌，其次是放线菌和真菌。与烟叶有关的微生物数量与整个醇化发酵的进程有较大的关联性，烟叶自然醇化过程中，烟叶叶面微生物数量随发酵过程的延长总体呈下降趋势。
利用微生物发酵技术诱发烟叶内大分子有机物质的转化，促进烟叶香味物质的形成积累，对提高烟叶内在香味物质含量，改善醇化烟叶香气味质量具有重要意义。现有研究发现向烤烟烟叶接种羧状芽孢杆菌后，随着微生物的生长，烟叶中的总碳水化合物和还原糖降低，能产生一种使人愉快的香气。Dawson研究表明，当嗜热性放线菌属在非常低湿度的醇化烟叶中生长缓慢时，可使醇化烟叶中产生一种令人感兴趣的香气，尤其是水果香气和酿香等。谢和等利用从烤烟上分离得到一株微生物菌株可使烤烟烟叶青杂气基本消除，刺激性有所降低，香味略有增加，余味舒适，显著提高烟叶质量。赵铭钦等发现在人工喷施微生物后，烤烟烟叶中的POD、淀粉酶和蛋白酶活性均大幅提高，这些酶活性的增高可加速烟叶发酵过程中物质的分解与转化，提高烟叶品质。
国内外烟草工作者在烟草微生物分离和利用微生物发酵改善烟草品质、改进烟叶发酵进程、缩短烟叶发酵周期等方面做了较多工作，特别是通过施加微生物制剂于烟叶中增加烟草吃味、提高烟草质量等研究。然而，目前研究多采用单一菌种发酵或微生物制剂只能针对作用于单一种类烟叶（如烤烟），适用范围窄，而且还存在增香效果不明显，发酵时间较长，技术应用复杂，难以培养等问题。因此，寻求一种既可显著改善各类烟叶品质，并能实现快速醇化发酵烟叶的复合微生物制剂具有广泛而现实的意义。
发明内容
本发明是针对卷烟工业发展的需求，克服现有技术的缺陷，其目的在于提供可用于卷烟生产环节中的一种用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂，采用该赋香复合微生物制剂进行发酵烟草原料后，其吸食品质改善明显。
一种用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂，由质量比为(0.001～1)∶(0.001～1)∶(0.001～1)的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Y1、芽孢杆菌(Bacillus sp.)X7和芽孢杆菌(Bacillus sp.)X8组成。芽孢杆菌(Bacillus sp.)Y1、芽孢杆菌(Bacillus sp.)X7、芽孢杆菌(Bacillus sp.)X8于2017年1月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所）进行了菌种保藏，保藏编号分别为：CGMCC No.13602 、CGMCC No.13603 和CGMCC No.13604。
优选的，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1的16S rRNA基因序列如SEQID No.1所示，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7的其16S rRNA基因序列如SEQ IDNo.2所示，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.3所示。
优选地，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8均由醇化烟叶表面分离筛选获得。
优选地，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8均为湿菌体、粉剂或冻干粉。
将得到的赋香复合微生物制剂用于烟叶原料发酵的生产工艺中，具体的步骤为：将烟叶原料进行切片、松散回潮处理、切丝后，得到烟叶原料烟丝，采用上述制备的赋香复合微生物制剂喷施于烟叶原料烟丝表面，恒温恒湿发酵后烘干至烟丝水分达到12％～14％，即可。
优选地，所述的赋香复合微生物制剂的喷施量为烟丝的0.0001wt％～0.5wt％。
优选地，所述发酵的具体条件为：温度25℃～45℃，相对湿度30％～90％，发酵时间24h～60h。
优选地，所述的烟叶原料为单等级原料烟叶或卷烟叶组。
优选地，所述单等级原料烟叶为烤烟、白肋烟、香料烟或晒烟。
采用本发明提供的赋香复合微生物制剂应用于烟叶原料的发酵，不需要对烟叶进行长时间的醇化储存，经发酵24h～60h后（自然发酵需1-2年），即可提升烟叶的感官质量。而且本发明采用的用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂具有较好的通用性，该赋香复合微生物制剂可对烤烟、白肋烟、香料烟、晒烟等单等级原料烟叶、烟草原料和卷烟叶组均有较好的品质改善作用，感官质量有明显提高。
本发明技术方案的有益效果为：本发明提供的赋香复合微生物制剂，使用简单，用于发酵烟叶生产，能缩短烟叶醇化时间，提高了烟叶利用效率，降低了烟叶加工成本；采用该赋香复合微生物制剂应用于烟叶原料发酵，烟草原料的品质和感官质量明显提高，卷制成卷烟，卷烟的感官质量符合成品卷烟的质量要求。
菌种保藏信息
保藏日期：2017年01月11日；
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏编号：CGMCC No.13602；CGMCC No.13603 ；CGMCC No.13604 。
具体实施方式
实施例1
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8的分离与筛选：
1、从自然醇化的烟叶表面分离烟草赋香菌菌株，其步骤为：先用90mL无菌水与10g醇化烟叶混合后（即10-1悬液），用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL无菌水中制成10-2悬液，然后逐级稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度的悬液0.2mL涂布到改良LB培养基上，37℃恒温培养24h，挑取长势良好，菌落饱满均匀，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检。
镜检若为纯培养单一菌株，则接种于改良LB斜面固体培养基，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。
镜检若为混合菌株，则再次在改良LB培养基平板上进行稀释涂布分离，直至单菌落形态和镜检均为菌株纯培养物后，接种入改良LB斜面试管，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。
改良LB培养基的成分为：胰化蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl0.25％；pH自然，酵母提取物(yeast extract)，也称酵母膏，市售。
改良LB斜面固体培养基的成分：胰化蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.25％，琼脂1%；pH自然，酵母提取物(yeast extract)，也称酵母膏，市售；改良LB培养基平板与改良LB斜面固体培养基成分相同。
对筛选所得的所有纯培养菌株进行烟叶发酵初步试验，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定烟草赋香菌株。
2、将所得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8进行培养，其方法是：
将保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8从斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中，于27℃～37℃，100rpm～180rpm恒温摇床振荡培养12h～36h，得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8的新鲜培养液；将所得的各菌株新鲜培养液在4℃条件下，以8500r/min～11000r/min离心5min～15min，弃上清液得到湿菌体，进一步可制得粉剂或冻干粉，保藏于4℃冰箱备用。
改良LB液体培养基的成分与改良LB培养基的成分相同。
若无特别说明，本发明中所有百分比均指质量百分比。
实施例2
将实施例1得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8按照质量比1:1:1的比例进行复配，得到赋香复合微生物制剂，称为制剂1；
将实施例1得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8按照质量比0.001:1:0.001的比例进行复配，得到赋香复合微生物制剂，称为制剂2；
将实施例1得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8按照质量比1:0.001:1的比例进行复配，得到赋香复合微生物制剂，称为制剂3；
将实施例1得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8按照质量比0.005:0.003:0.008的比例进行复配，得到赋香复合微生物制剂，称为制剂4；
也可以采用粉剂或冻干粉可直接进行复配。
在具体实施时，将实施例1得到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Y1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X7、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X8按照质量比(0.001～1)∶(0.001～1)∶(0.001～1)复配，即可得到本发明所述的赋香复合微生物制剂。
实施例3
将实施例2制备得到的赋香复合微生物制剂用于烟叶原料的快速发酵，将烟叶原料进行切片、松散回潮处理后进行切丝，得到烟叶原料烟丝，按烟叶原料烟丝的0.0001wt％～0.5wt％称取实施例2制备得到的赋香复合微生物制剂，喷洒在切后烟丝表面，在温度25℃～45℃，相对湿度30％～90％的条件下，恒温恒湿发酵24h～60h，发酵后烟丝经烘干处理，含水率在12％～14％之间，即获得用赋香复合微生物制剂发酵的烟叶原料烟丝。
实施例4
将实施例2制备得到的制剂1用于烟叶原料的快速发酵，将烟叶原料进行切片、松散回潮处理后进行切丝，得到烟叶原料烟丝，按烟叶原料烟丝的0.01wt％称取实施例2制备得到制剂1，用制剂1喷洒在切后烟丝表面，在温度35℃，相对湿度50％的条件下，恒温恒湿发酵40h，发酵后烟丝经烘干处理，烘干至烟叶原料烟丝的含水率为12％，即获得赋香复合微生物制剂发酵的烟叶原料烟丝。
实施例5
将实施例2制备得到的制剂2用于烟叶原料的快速发酵，将烟叶原料进行切片、松散回潮处理后进行切丝，得到烟叶原料烟丝，按烟叶原料烟丝的0.5wt％称取实施例2制备得到制剂2，用制剂2喷洒在切后烟丝表面，在温度45℃，相对湿度30％的条件下，恒温恒湿发酵24h，发酵后烟丝经烘干处理，烘干至烟叶原料烟丝的含水率为14％，即获得赋香复合微生物制剂发酵的烟叶原料烟丝。
实施例6
将实施例2制备得到的制剂3用于烟叶原料的快速发酵，将烟叶原料进行切片、松散回潮处理后进行切丝，得到烟叶原料烟丝，按烟叶原料烟丝的0.0001wt％称取实施例2制备得到制剂3，用制剂3喷洒在切后烟丝表面，在温度25℃，相对湿度90％的条件下，恒温恒湿发酵60h，发酵后烟丝经烘干处理，烘干至烟叶原料烟丝的含水率为13％，即获得赋香复合微生物制剂发酵的烟叶原料烟丝。
实施例7
将实施例4得到的用赋香复合微生物制剂发酵的烟叶原料烟丝为实验样品，相同生产工艺下，切丝后烟丝不经过赋香复合微生物制剂发酵而直接以相同量无菌水同等条件处理为对照样品。采用实施例4的工艺，处理的烟叶原料为不同等级的烟叶原料（烤烟：2015年，陕西汉中，秦烟96，B2F；白肋烟：2015年，四川达州；香料烟：2014年，湖北十堰，K2；晒黄烟：2014年，湖南长沙，中二。），由11名感官评吸人员进行感官质量检验，取平均结果，结果如表1～4所示。
表1烤烟赋香复合微生物制剂发酵感官质量
注：单项分值为10分，打分单位为0.5分
据表1，经本发明赋香复合微生物制剂处理后的烤烟 B2F的香气质、香气量和甜感均有明显提升，杂气和刺激性减轻，余味舒适性和浸润感有改善，总的感官变化趋势是较好。
表2白肋烟赋香复合微生物制剂发酵感官质量
据表2，经本发明赋香复合微生物制剂处理后的白肋烟的烟气较细腻，香气透发性好，劲头、苦涩感、喉部刺激、余味残留等较对照样减轻，感官品质变好。
表3香料烟赋香复合微生物制剂发酵感官质量
据表3，经本发明赋香复合微生物制剂处理后的香料烟的烟气浓度适中、细腻、饱满，刺激减轻，舌面苦感、余味残留等较对照样减轻，感官品质变好。
表4晒黄烟赋香复合微生物制剂发酵感官质量
据表4，经本发明赋香复合微生物制剂处理后的晒黄烟的烟气浓度适中，香气透发性、细腻感较对照样有提升，舌面苦涩感、喉部刺激、余味残留较对照减轻，感官品质变好。
将卷烟叶组按照实施例4的实施方式经赋香复合微生物制剂发酵，设对照样品（不经过复合微生物制剂发酵）和实验样品，卷制成84mm（25+59）卷烟，由11名感官评吸人员参照国标《卷烟》GB5606.4-2005进行卷烟感官质量检验，结果如表5所示。
表5卷烟感官质量
由表5可知，卷烟叶组经过本发明提供的赋香复合微生物制剂发酵，卷烟的感官质量品质变好。
SEQUENCE LISTING
<110> 陕西中烟工业有限责任公司
<120> 一种用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂及其应用
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Y1
<400> 1
ggcgctgcag actgcagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg 60
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gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca taaaaggtgg cttcggctac 180
cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca 240
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ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac 360
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ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg 480
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ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 1140
gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200
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agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga gc 1422
<210> 2
<211> 1377
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）X7
<400> 2
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tttcgctgcc ctttgttctg tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat 240
gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc 300
ccaactgaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca 360
tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actctccccc cgaaggggac 420
gtcctatctc taggattgtc agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc 480
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gttcgctccc cacgctttcg ctcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc 720
actggtgttc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc 780
ttctgcactc aagttcccca gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac 840
atcagactta agaaaccgcc tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc 900
cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg gttaggtacc 960
gtcaaggtac cgccctattc gaacggtact tgttcttccc taacaacaga gctttacgat 1020
ccgaaaacct tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga 1080
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accctctcag gtcggctacg catcgttgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta 1200
atgcgccgcg ggtccatctg taagtggtag ccgaagccac cttttatgtt tgaaccatgc 1260
ggttcaaaca accatccggt attagccccg gtttcccgga gttatcccag tcttacaggc 1320
aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc cgctaacatc agggagcaag ctcccat 1377
<210> 3
<211> 1391
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）X8
<400> 3
ggctcctaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttaaaac tctcgtggtg tgacgggcgg 60
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ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact gagaacagat ttgtgggatt 180
ggcttaacct cgcggtttcg ctgccctttg ttctgtccat tgtagcacgt gtgtagccca 240
ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca 300
gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat caagggttgc gctcgttgcg 360
ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct 420
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agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat cgtttacggc gtggactacc 660
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agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg catttcaccg ctacacgtgg 780
aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc caatgaccct ccccggttga 840
gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcga gccctttacg cccaataatt 900
ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct 960
ttctggttag gtaccgtcaa ggtaccgccc tattcgaacg gtacttgttc ttccctaaca 1020
acagagcttt acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg cgttgctccg tcagactttc 1080
gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc 1140
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ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa gccacctttt 1260
atgtttgaac catgcggttc aaacaaccat ccggtattag ccccggtttc cggagttatc 1320
ccagtcttac aggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctaa catcagggag 1380
caagctccca t 1391
Claims (9)
1.一种用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂，其特征在于：所述复合微生物制剂由质量比为(0.001～1)∶(0.001～1)∶(0.001～1)的枯草芽孢杆菌Y1、枯草芽孢杆菌X7和枯草芽孢杆菌X8组成，所述枯草芽孢杆菌Y1、枯草芽孢杆菌X7、枯草芽孢杆菌X8在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号分别为：CGMCC No.13602 、CGMCC No.13603和CGMCC No.13604。
2.根据权利要求1所述的用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Y1的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示，所述枯草芽孢杆菌X7的16SrRNA基因序列如SEQ ID No.2所示，所述枯草芽孢杆菌X8的16S rRNA基因序列如SEQ IDNo.3所示。
3.根据权利要求1或2所述的用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Y1、枯草芽孢杆菌X7、枯草芽孢杆菌X8均由醇化烟叶表面分离筛选获得。
4.根据权利要求1所述的用于烟叶快速发酵的赋香复合微生物制剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌Y1、枯草芽孢杆菌X7、枯草芽孢杆菌X8均为湿菌体、粉剂或冻干粉。
5.权利要求1所述的赋香复合微生物制剂在烟叶原料中的应用，其特征在于：所述应用为：将烟叶原料进行切片、松散回潮处理、切丝后，得到烟叶原料烟丝，采用权利要求1所述的赋香复合微生物制剂喷施烟叶原料烟丝，恒温恒湿发酵后烘干至烟丝水分达到12％～14％，即可。
6.根据权利要求5所述的赋香复合微生物制剂在烟叶原料中的应用，其特征在于：所述赋香复合微生物制剂的喷施量为烟丝的0.0001wt％～0.5wt％。
7.根据权利要求5所述的赋香复合微生物制剂在烟叶原料中的应用，其特征在于：所述发酵的具体条件为：温度25℃～45℃，相对湿度30％～90％，发酵时间24h～60h。
8.根据权利要求5所述的赋香复合微生物制剂在烟叶原料中的应用，其特征在于：所述的烟叶原料为单等级原料烟叶或者卷烟叶组。
9.根据权利要求8所述的赋香复合微生物制剂在烟叶原料中的应用，其特征在于：所述的单等级原料烟叶为烤烟、白肋烟、香料烟或晒烟。
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