CN103169153B - 一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，通过在低次烟叶中添加由复合酶液、烟草增质液和微生物种子菌悬液所组成的混合液体，在固态条件下对低次烟叶进行酶解和微生物发酵，以改善其内在品质。经复合酶液、增质液及微生物固态发酵处理后，低次烟叶主要化学成分含量趋于适宜、比例趋于协调，吸食品质有所改善；在合适的固态发酵条件下，使用本发明技术还可有效抑制低次烟叶中有害微生物的生长，杀灭有害微生物，并显著缩短烟叶固态发酵的时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，属于烟草加工技术领域。
背景技术
我国是烟草大国，在烟叶生产过程中，每年烤烟产量中有10%左右的烟叶属于下低等烟或低次烟叶。这些烟叶由于内在品质不佳，工业可用性较差，从而造成了一定程度上的库存积压。因此，如何改善低次烟叶的内在品质，已经成为了众多卷烟工业企业面临的共同技术难题。
低次烟叶的吸食品质特征通常表现为香气质较差，香气量不足，杂气较重（有的低次烟叶有较明显的“青杂气”或“地方性杂气”），刺激性较大，余味欠干净舒适。低次烟叶的化学成分特征通常表现为还原糖含量较低（淀粉含量较高，糖类物质转化不够充分）；有的低次烟叶的蛋白质含量较高。
烟叶发酵是改善烟叶品质的重要方法。氧化作用、微生物作用、酶作用的有机结合共同构成了烟叶发酵的全过程。烟叶发酵分为自然陈化和人工发酵。自然陈化是在烟叶水分含量较低的情况下（烟叶含水率通常为11～13%）进行长达2年左右的自然发酵。烟草行业所说的“人工发酵”通常指的是将烟叶堆放在一个发酵室内，通入湿热水汽，将发酵室内的温度控制在45℃～55℃之间并保持3～6周的时间，以改善烟叶内在品质的方法。发酵过程中一般不施用生物制剂。目前大多数卷烟工业企业采用的是自然陈化法。
烟叶中含有大量微生物，经检测，所含有的微生物菌落总数的数量级达到10×106cfu/g甚至更高。这些微生物的存在主要危害到本专利方法中所涉及的后续固态发酵。但在烟叶水分含量很低，温度较高的环境中，微生物的发酵作用是很微弱的。人工发酵，在采用固态发酵方式的同时，也可外加液态生物制剂，并进一步加大烟叶中的水分含量，通过温度的调控使烟叶的发酵周期缩短。但在较高物料水分及适宜的温度条件下，有害微生物也易在烟叶中滋生，尤其是霉菌的滋生，对烟叶的品质会产生破坏性作用。因此，人工控制的烟叶固态发酵，在创造条件使有益微生物及酶发挥正常作用的同时，应有效控制有害微生物(特别是霉菌)的生长，而提高发酵温度、人工接种微生物，缩短发酵时间是有效的控制措施。
本专利发明是采用在烟叶中加入复合酶液、烟草增质液、微生物种子菌悬液的方法，使低次烟叶在较高温度和较高水分含量的条件下进行有益微生物的固态发酵，在抑制有害微生物生长的同时，达到既可改善低次烟叶内在品质，又可缩短发酵时间的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，通过在低次烟叶中加入由复合酶液、微生物种子菌悬液、炒米汁或枣汁、水等组成的混合液体，使低次烟叶在含有酶制剂、微生物，并且含有较高水分的情况下进行酶解及微生物发酵，以改变低次烟叶化学成分，从而达到提高其内在品质的目的。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，具体包括以下步骤：
（1）配制复合酶液；
优选的，所述复合酶液的配方为：纤维素酶（7900PGNU/mL）4mL、淀粉酶（480KNU-B/g）6g、糖化酶（26.5万U/g）4g、水100mL。
所述纤维素酶、淀粉酶、糖化酶均来源于诺维信生物技术有限公司，酶活单位PGNU、KNU-B等为该公司自定义单位；其特点是比酶活较高，故酶用量较少，可降低酶制剂可能带入的异杂味。复合酶液的配方，可根据低次烟叶中有关成份的含量进行适当调整。
（2）制备微生物种子菌悬液；
优选的，所述微生物选自耐50℃高温生长、符合食品安全，具有大量分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力，并具有较强生香作用的微生物；特别优选为热噬淀粉芽孢杆菌【Bacillus thermoamylovorans，10143，中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Centerof Industrial Culture Collection）】。
优选的，所述微生物种子菌悬液的制备方法为：取微生物菌种保藏斜面，加无菌水制成种子菌悬液，取种子菌悬液接种于干物质（干物质是指培养基去除水分后所剩余物质的质量）质量浓度为6%～8%的液体培养基中，在45℃，180r/min培养12～18h，制备得到菌体浓度为107～109个/mL的微生物种子菌悬液；所述液态培养基的配制方法是：将100g低次烟叶末和100g麦芽粉混合后，加水1500mL，在60℃浸渍2h，过滤，然后在过滤后获得的液体中加水配成干物质浓度为6%～8%的液态培养基。
进一步优选的，取微生物菌种保藏斜面，加无菌水制成种子菌悬液，取种子菌悬液接种于由低次烟叶末浸取液和麦芽汁组成的干物质质量浓度为6%～8%的液体培养基中，45℃，180r/min培养14～16h，制备得到菌体浓度为108个/mL的微生物种子菌悬液。
（3）制备烟草增质液；
优选的，所述烟草增质液为炒米汁或枣汁，其作用为：可以抑制霉菌等有害微生物的生长，提高低次烟叶的吸食品质。
优选的，所述炒米汁的制作方法为：取1000g大米，放到铁锅中炒，炒至大米变黄、膨胀成黑色团状直至粘成一团，然后加水煮沸10min，过滤取汁，定容到2500mL。
所述铁锅中的炒米过程可以为：取1000g大米，放到铁锅中炒，先中火炒到大米变黄，再大火炒，当大米膨胀成黑色团状时再用中火炒，直到炒到大米粘成一团，此过程大约14min。
优选的，所述枣汁的制备方法为：取干重为300g的红枣，加水煮沸2h，过滤取汁，定容到1500mL。
（4）在低次烟叶中加入复合酶液、微生物种子菌悬液、烟草增质液和水，混匀，制成低次烟叶固态发酵物料；
优选的，每千克低次烟叶中加入复合酶液15～35mL，每千克低次烟叶中加入微生物种子菌悬液100～300mL，每千克低次烟叶中加入烟草增质液100～200mL。
进一步优选的，每千克低次烟叶中加入复合水解酶溶液20～30mL，每千克低次烟叶中加入微生物种子菌悬液150～250mL，每千克低次烟叶中加入烟草增质液130～180mL。
优选的，所述低次烟叶固态发酵物料中水分质量百分含量保持在30～60%。
进一步优选的，所述低次烟叶固态发酵物料中水分质量百分含量保持在40～55%。
（5）将制成的低次烟叶固态发酵物料装入烟叶框中，压紧；
优选的，所述烟叶框为塑料框，内部尺寸大小为：长×宽×高=40×40×40cm；采用塑料框装烟叶，主要是考虑其便于实现机械化操作，若改为烟叶的堆积式发酵，人工消耗较大，且较难控制烟叶内的温度和水分含量。
优选的，所述烟叶框中烟叶堆积的容积密度（低次烟叶固态发酵物料总重/物料总体积）为0.2～0.7g/cm3。
进一步优选的，所述烟叶框中烟叶堆积的容积密度（低次烟叶固态发酵物料总重/物料总体积）为0.3～0.5g/cm3。
（6）将烟叶框置于发酵室，对低次烟叶进行酶解和固态发酵；
优选的，所述发酵室的温度为40℃～60℃，湿度为60%～95%，通风条件下酶解和固态发酵5～20d；发酵过程中，可根据烟叶内部的温度，适时调节烟叶框的位置。
进一步优选的，所述发酵室的温度为45℃～55℃，湿度为70%～90%，通风条件下酶解和固态发酵10～15d。
（7）发酵后低次烟叶的杀菌及干燥处理；
优选的，采用微波加热法对发酵后的低次烟叶进行杀菌，微波中火处理3～8min。
优选的，所述干燥为热风干燥，干燥后烟叶中水分质量百分含量为11%～13%。
本发明的技术效果及优点在于：
1.经复合酶液、增质液及微生物酶解和固态发酵处理后，低次烟叶主要化学成分含量趋于适宜、比例趋于协调，吸食品质有所改善。
2.在创造条件使有益微生物及酶发挥正常作用的同时，可有效抑制有害微生物霉菌的生长。
3.可明显缩短烟叶固态发酵的时间。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：复合酶液、炒米汁和热噬淀粉芽胞杆菌协同酶解和发酵低次烟叶
1实验方法
1.1配制复合酶液
制备复合酶液：纤维素酶（7900PGNU/mL）4mL、淀粉酶（480KNU-B/g）6g、糖化酶（26.5万U/g）4g、水100mL。所述酶均由诺维信生物技术有限公司生产。
1.2热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液的制备
1）斜面培养
热噬淀粉芽胞杆菌（Bacillus thermoamylovorans，中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）提供的10143-热噬淀粉芽孢杆菌）划线接种于肉汤培养基斜面，45℃培养24h，4℃冰箱保存。
2）制备热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液
取热噬淀粉芽孢杆菌菌种保藏斜面，加无菌水制成菌悬液。取种子菌悬液接种于干物质（干物质是指培养基去除水分后所剩余物质的质量）质量浓度为6%的液体培养基中，在45℃，180r/min培养12h，制备得到菌体浓度为107个/mL的微生物种子菌悬液；所述液态培养基的配制方法是：将100g低次烟叶末和100g麦芽粉混合后、加水在60℃浸渍2h，总加水量1500mL，过滤后获得的液体，再加适量水配成干物质浓度为6%的液态培养基。
1.3制备炒米汁作为烟草增质液
取1000g大米，放到铁锅中炒，先中火炒到大米变黄，再大火炒，当大米膨胀成黑色团状时再用中火炒，直到炒到大米粘在一团，此过程大约14min。加适量自来水，煮沸10min，过滤取汁，定容到2500mL。
1.4配制低次烟叶固态发酵物料
取低次烟叶（干基）30g，加入复合酶液0.45mL、炒米汁6mL和微生物种子菌悬液6mL，补充水分至物料水分重量百分含量为40%。
1.5将上述处理好的低次烟叶装入250mL的三角瓶中，烟叶填充均匀，容积密度为0.2g/cm3。
1.6将盛装有上述低次烟叶的三角瓶放于温度为45℃，湿度为65%，并控制一定通风量的发酵室内，发酵5d。发酵后的低次烟叶用热风烘干至水分含量为12wt%。
1.7检测方法
(1)水分的测定：红外快速水分测定仪测定
(2)糖分的测定：糖分的测定方法参见文献:尹建雄,卢红,谢强,等.3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨[J].云南农业大学学报，2007，22(6)：829-838.
(3)粗蛋白及总氮的测定：粗蛋白及总氮的测定参见相关文献GB5099.5-2010.食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.
2结果分析
复合酶液、炒米汁和热噬淀粉芽胞杆菌协同酶解和发酵低次烟叶前后化学成分变化如表1所示，发酵结束后淀粉含量明显降低，降解率达20%，蛋白质降解3.5%，烟碱降解2.5%。
表1复合酶与微生物协同发酵上部低次烟叶前后化学成分变化
| 类型 | 淀粉（%） | 蛋白质（%） | 烟碱（%） |
| 原烟叶 | 8.20 | 8.54 | 2.40 |
| 实验组 | 6.56 | 8.24 | 2.34 |
经复合酶液、炒米汁和热噬淀粉芽胞杆菌协同酶解和发酵的低次烟叶，吸食品质得到改善，主要表现为杂气减轻，香气量有所增加。
对照组（只加水）发酵5d后开始长霉，致使发酵无法继续，而实验组能发酵15d而不长霉，这充分说明了复合酶液、炒米汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶还具有很好的抑制霉菌生长的效果。
实施例2：复合酶液、炒米汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶以及微波杀菌1实验方法
1.1配制复合酶液
复合酶液：纤维素酶（900PGNU/mL）4mL、淀粉酶（480KNU-B/g）6g、糖化酶（6.5万U/g）4g、水100mL。所述酶均由诺维信生物技术有限公司生产。
1.2热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液的制备。
1）斜面培养
热噬淀粉芽胞杆菌（Bacillus thermoamylovorans，中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）提供的10143-热噬淀粉芽孢杆菌）划线接种于肉汤培养基斜面，45℃培养24h，4℃冰箱保存。
2）制备热噬淀粉芽胞杆菌种子液
取热噬淀粉芽孢杆菌菌种保藏斜面，加无菌水制成菌悬液。取热噬淀粉芽孢杆菌菌种保藏斜面，加无菌水制成菌悬液。取种子菌悬液接种于干物质（干物质是指培养基去除水分后所剩余物质的质量）质量浓度为7%的液体培养基中，在45℃，180r/min培养14h，制备得到菌体浓度为1.4×108个/mL的微生物种子菌悬液；所述液态培养基的配制方法同实施例1。
1.3炒米汁的制备同实施例1
1.4配制低次烟叶固态发酵物料
取低次烟叶（干基）60g，加入复合酶液1.2mL和微生物种子菌悬液液12mL，炒米汁12mL，补充水分至物料含水量为45wt%。
1.4将上述处理好的低次烟叶装入250mL的三角瓶中，烟叶填充均匀，容积密度为0.5g/cm3。
1.5将盛装有上述低次烟叶的三角瓶放于温度为50℃，湿度为80%，并控制一定通风量的发酵室内，发酵10d；
1.6将发酵结束的烟叶于微波炉中，中火处理3min，微波处理后的低次烟叶用热风烘干至水分质量百分含量为12%。
1.6检测方法:
(1)水分的测定:红外快速水分测定仪测定
(2)糖分的测定：糖分的测定方法参见文献:尹建雄,卢红,谢强,等.3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨[J].云南农业大学学报,2007,22(6):829-838.
(3)粗蛋白及总氮的测定：粗蛋白及总氮的测定参见相关文献GB5099.5-2010.食品中蛋白质的测定[S].北京:中国标准出版社,2010.
2结果与分析
复合酶液、炒米汁与热湿淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶前后化学成分变化如表2所示，发酵结束后淀粉含量明显降低，降解率达26.1%，蛋白质降解5.85%，烟碱降解2.9%。
表2复合酶与微生物协同发酵上部低次烟叶前后化学成分变化
| 类型 | 淀粉（%） | 蛋白质（%） | 烟碱（%） |
| 原烟叶 | 8.20 | 8.54 | 2.40 |
| 实验组 | 6.06 | 8.04 | 2.33 |
经复合酶液、炒米汁与热湿淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵的上部低次烟叶，吸食品质得到改善，主要表现为杂气减轻，香气量有所增加。
对照组（只加水）发酵5d后开始长霉，致使发酵无法继续，而实验组能发酵15d而不长霉，这充分说明了复合酶液、炒米汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶还具有很好的抑制霉菌生长的效果。
微波处理发酵结束的低次烟叶，菌落数量变化如表3所示，
表3发酵及微波处理前后菌落数量的变化
| 实验编号 | 类别 | 菌落数量 |
| 1 | 原烟叶 | 5×107/g |
| 2 | 发酵结束 | 3×108/g |
| 3 | 发酵结束微波处理 | 7×104/g |
实验结果表明，微波处理使菌落数量降低了3个数量级，效果很明显。
实施例3：复合酶液、枣汁与热湿淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶以及微波处理
1实验方法
1.1配制复合酶液
纤维素酶（7900PGNU/mL）4mL、淀粉酶（480KNU-B/g）6g、糖化酶（26.5万U/g）4g、水100mL；所述酶均由诺维信生物技术有限公司生产。
1.2热噬淀粉芽胞杆菌种子制备
1）斜面培养
热噬淀粉芽胞杆菌Bacillus thermoamylovorans，中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）提供的10143-热噬淀粉芽孢杆菌）划线接种于肉汤培养基斜面，45℃培养24h，4℃冰箱保存。
2）热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液的制备
取热噬淀粉芽孢杆菌菌种保藏斜面，加无菌水制成菌悬液。取种子菌悬液接种于干物质（干物质是指培养基去除水分后所剩余物质的质量）质量浓度为7%的液体培养基中，在45℃，180r/min培养16h，制备得到菌体浓度为1.5×108个/mL的微生物种子菌悬液。液体培养基制备方法同实施例1。
1.3制备枣汁
取红枣(干重)300g，加水煮沸2h，过滤取汁，定容到1500mL。
1.4取低次烟叶（干基）1.92kg，加入复合酶液38.4mL和微生物种子菌悬液288mL，枣汁192mL，补充水分至物料含水量为60wt%。
1.5将上述处理好的低次烟叶装入塑料框中（框内部尺寸：长×宽×高=40×40×40cm），压紧，容积密度为0.7g/cm3。
1.5将盛装有上述低次烟叶的框置放于温度为55℃，湿度为95%，并控制一定通风量的发酵室内，发酵8d，将发酵结束的烟叶于微波炉中，中火处理5min，微波处理后的低次烟叶用热风烘干至水分含量为12wt%。
1.6检测方法:
(1)水分的测定:红外快速水分测定仪测定
(2)糖分的测定：糖分的测定方法参见文献:尹建雄,卢红,谢强,等.3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨[J].云南农业大学学报,2007,22(6):829-838.
(3)粗蛋白及总氮的测定：粗蛋白及总氮的测定参见相关文献GB5099.5-2010.食品中蛋白质的测定[S].北京:中国标准出版社,2010.
2结果与分析
复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶前后化学成分变化如表4所示，发酵结束后淀粉含量明显降低，降解率达22.6%，蛋白质降解5.74%，烟碱降解3.75%。
表4复合酶与微生物协同发酵上部低次烟叶前后化学成分变化
| 类型 | 淀粉（%） | 蛋白质（%） | 烟碱（%） |
| 对照组 | 8.20 | 8.54 | 2.40 |
| 实验组 | 6.35 | 8.05 | 2.31 |
复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵上部低次烟叶，吸食品质得到改善，主要表现为杂气减轻，香气量有所增加。
对照组（只加水）发酵5d后开始长霉，致使发酵无法继续，而实验组能发酵15d而不长霉，这充分说明了复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶还具有很好的抑制霉菌生长的效果。
微波处理发酵结束的低次烟叶，菌落数量变化如表5所示，
表5发酵及微波处理前后菌落数量的变化
| 实验编号 | 类别 | 菌落数量 |
| 1 | 原烟叶 | 5×107/g |
| 2 | 发酵结束 | 3×108/g |
| 3 | 发酵结束微波处理 | 3×104/g |
结果表明，微波处理使菌落数量降低了4个数量级，效果很明显。
实施例4：复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶
1实验方法
1.1配制复合酶液。
纤维素酶（7900PGNU/mL）4mL、淀粉酶（480KNU-B/g）6g、糖化酶（26.5万U/g）4g、水100mL；所述酶均由诺维信生物技术有限公司生产。
1.2热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液的制备。
1）斜面培养
热噬淀粉芽胞杆菌（Bacillus thermoamylovorans，中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）提供的10143-热噬淀粉芽孢杆菌）划线接种于肉汤培养基斜面，45℃培养24h，4℃冰箱保存。
2）热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液的制备
取热噬淀粉芽孢杆菌菌种保藏斜面，加无菌水制成菌悬液。取种子菌悬液接种于干物质（干物质是指培养基去除水分后所剩余物质的质量）质量浓度为7%的液体培养基中，在45℃，180r/min培养18h，制备得到菌体浓度为2.3×108个/mL的微生物种子菌悬液。液体培养基制备方法同实施例1。
1.3枣汁制备同实施例3
1.4取低次烟叶（干基）1.2kg，加入复合酶液36mL和微生物种子菌悬液360mL，枣汁180mL，补充水分至物料含水量为50wt%。
1.4将上述处理好的低次烟叶装入塑料框中（塑料框内部尺寸：长×宽×高=40×40×40cm），压紧，容积密度为0.4g/cm3。
1.5将盛装有上述低次烟叶的框置放于温度为48℃，湿度为90%，并控制一定通风量的发酵室内，发酵12d。发酵后的低次烟叶用热风烘干至水分重量百分含量为12%。
1.6检测方法:
(1)水分的测定:红外快速水分测定仪测定
(2)糖分的测定：糖分的测定方法参见文献:尹建雄,卢红,谢强,等.3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨[J].云南农业大学学报,2007,22(6):829-838.
(3)粗蛋白及总氮的测定：粗蛋白及总氮的测定参见相关文献GB5099.5-2010.食品中蛋白质的测定[S].北京:中国标准出版社,2010.
2结果分析
复合酶液、枣汁与热湿淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶前后化学成分变化如表6所示，发酵结束后淀粉含量明显降低，降解率高达27.2%，蛋白质降解7%，烟碱降解4.2%。
表6复合酶与微生物协同发酵上部低次烟叶前后化学成分变化
| 类型 | 淀粉（%） | 蛋白质（%） | 烟碱（%） |
| 对照组 | 8.20 | 8.54 | 2.4 |
| 实验组 | 5.97 | 7.94 | 2.30 |
经复合酶液、枣汁与热湿淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵的上部低次烟叶，吸食品质得到改善，主要表现为杂气减轻，香气量有所增加。
对照组（只加水）发酵5d后开始长霉，致使发酵无法继续，而实验组能发酵15d而不长霉，这充分说明了复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶还具有很好的抑制霉菌生长的效果。
实施例5：复合酶液、枣汁与热湿淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶以及微波杀菌
1实验方法
1.1配制复合酶液。
纤维素酶（7900PGNU/mL）4mL、淀粉酶（480KNU-B/g）6g、糖化酶（26.5万U/g）4g、水100mL。所述酶均由诺维信生物技术有限公司生产。
1.2热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液的制备。
1）斜面培养
热噬淀粉芽胞杆菌（Bacillus thermoamylovorans，中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）提供的10143-热噬淀粉芽孢杆菌）划线接种于肉汤培养基斜面，45℃培养24h，4℃冰箱保存。
2）制备热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液
取热噬淀粉芽孢杆菌菌种保藏斜面，加无菌水制成菌悬液，取菌悬液接种于干物质（干物质是指培养基去除水分后所剩余物质的质量）质量浓度为8%的液体培养基中，在45℃，180r/min培养16h，制备得到菌体浓度为109个/mL的微生物种子菌悬液。液体培养基制备方法同实施例1。
1.3取低次烟叶（干基）10.08kg，加入复合酶液282mL和微生物种子菌悬液2520mL，枣汁（同实施例3）2016mL，补充水分至物料含水量为50wt%。
1.4将上述处理好的低次烟叶装入塑料框中（塑料框内部尺寸：长×宽×高=40×40×40cm），压紧，容积密度为0.6g/cm3。
1.5将盛装有上述低次烟叶的框置放于温度为60℃，湿度为85%，并控制一定通风量的发酵室内，发酵20d，将发酵结束的烟叶于微波炉中，中火处理10min，微波处理后的低次烟叶用热风烘干至水分含量为12wt%。
1.6检测方法:
(1)水分的测定:红外快速水分测定仪测定
(2)糖分的测定：糖分的测定方法参见文献:尹建雄,卢红,谢强,等.3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨[J].云南农业大学学报,2007,22(6):829-838.
(3)粗蛋白及总氮的测定：粗蛋白及总氮的测定参见相关文献GB5099.5-2010.食品中蛋白质的测定[S].北京:中国标准出版社,2010.
2结果分析
复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶前后化学成分变化如表7所示，发酵结束后淀粉大幅度降低，降解率高达31.2%，蛋白质降解9.84%，烟碱降解5.42%。
表7复合酶与微生物协同发酵上部低次烟叶前后化学成分变化
| 类型 | 淀粉（%） | 蛋白质（%） | 烟碱（%） |
| 对照组 | 8.20 | 8.54 | 2.40 |
| 实验组 | 5.64 | 7.70 | 2.27 |
经复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵的低次烟叶，吸食品质得到改善，主要表现为杂气减轻，香气量有所增加。
对照组（只加水）发酵5d后开始长霉，致使发酵无法继续，而实验组能发酵20d而不长霉，这充分说明了复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶还具有很好的抑制霉菌生长的效果。
微波处理发酵结束的低次烟叶，菌落数量变化如表8所示，
表8发酵及微波处理前后菌落数量的变化
| 实验编号 | 类别 | 菌落数量 |
| 1 | 原烟叶 | 5×107/g |
| 2 | 发酵结束 | 3×108/g |
| 3 | 发酵结束微波处理 | 3×104/g |
结果表明微波处理使菌落数量降低了4个数量级，效果很明显。
实施例6：复合酶液、炒米汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶以及微波杀菌
1实验方法
1.1配制复合酶液
纤维素酶（7900PGNU/mL）4mL、淀粉酶（480KNU-B/g）6g、糖化酶（26.5万U/g）4g、水100mL。所述酶均由诺维信生物技术有限公司生产。
1.2热噬淀粉芽胞杆菌种子菌悬液的制备。
1）斜面培养
热噬淀粉芽胞杆菌（Bacillus thermoamylovorans，中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）提供的10143-热噬淀粉芽孢杆菌）划线接种于肉汤培养基斜面，45℃培养24h，4℃冰箱保存。
2）制备热噬淀粉芽胞杆菌种子液
取热噬淀粉芽孢杆菌菌种保藏斜面，加无菌水制成菌悬液，取种子菌悬液接种于干物质（干物质是指培养基去除水分后所剩余物质的质量）质量浓度为8%的液体培养基中，在45℃，180r/min培养14h，制备得到菌体浓度为8×108个/mL的微生物种子菌悬液。液体培养基制备方法同实施例1。
1.3取上部低次烟叶（干基）12.8kg，加入复合酶液320mL和微生物种子菌悬液2560mL，炒米汁（同实施例1）1920mL，补充水分至物料含水量为50wt%。
1.4将上述处理好的低次烟叶装入塑料框中（塑料框内部尺寸：长×宽×高=40×40×40cm），压紧，容积密度为0.5g/cm3。
1.5将盛装有上述低次烟叶的框置放于温度为50℃，湿度为80%，并控制一定通风量的发酵室内，发酵15d，将发酵结束的烟叶于微波炉中，中火处理10min，微波后的低次烟叶用热风烘干至水分含量为12wt%。
1.6检测方法:
(1)水分的测定:红外快速水分测定仪测定
(2)糖分的测定：糖分的测定方法参见文献:尹建雄,卢红,谢强,等.3,5-二硝基水杨酸比色法快速测定烟草水溶性总糖、还原糖及淀粉的探讨[J].云南农业大学学报,2007,22(6):829-838.
(3)粗蛋白及总氮的测定：粗蛋白及总氮的测定参见相关文献GB5099.5-2010.食品中蛋白质的测定[S].北京:中国标准出版社,2010.
2结果与分析
复合酶液、炒米汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶前后化学成分变化如表9所示，发酵结束后淀粉大幅度降低，降解率高达30.0%，蛋白质降解9.4%，烟碱降解5%。
表9复合酶与微生物协同发酵上部低次烟叶前后化学成分变化
| 类型 | 淀粉（%） | 蛋白质（%） | 烟碱（%） |
| 对照组 | 8.20 | 8.54 | 2.40 |
| 实验组 | 5.74 | 7.74 | 2.28 |
经复合酶液、炒米汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵的低次烟叶，吸食品质得到很大的改善，主要表现为杂气减轻，香气量有所增加。
对照组（只加水）发酵5d后开始长霉，致使发酵无法继续，而实验组能发酵15d而不长霉，这充分说明了复合酶液、枣汁与热噬淀粉芽孢杆菌协同酶解和发酵低次烟叶还具有很好的抑制霉菌生长的效果。
微波处理发酵结束的低次烟叶，菌落数量变化如表10所示，
表10发酵及微波处理前后菌落数量的变化
| 实验编号 | 类别 | 菌落数量 |
| 1 | 原烟叶 | 5×107/g |
| 2 | 发酵结束 | 3×108/g |
| 3 | 发酵结束微波处理 | 3×104/g |
结果表明，微波处理使菌落数量降低了4个数量级，效果很明显。
Claims (13)
1.一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，具体包括以下步骤：
(1)配制复合酶液；
(2)制备微生物种子菌悬液；
(3)制备烟草增质液；
(4)在低次烟叶中加入复合酶液、微生物种子菌悬液、烟草增质液和水，混匀，制成低次烟叶固态发酵物料；
(5)将制成的低次烟叶固态发酵物料装入烟叶框中，压紧；
(6)将烟叶框置于发酵室，对低次烟叶进行酶解和固态发酵；
(7)发酵后低次烟叶的杀菌及干燥处理。
2.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述复合酶液的配方为：纤维素酶，7900 PGNU/mL，4mL；淀粉酶，480KNU-B/g，6g；糖化酶，26.5万U/g，4g；水，100mL；所述纤维素酶、淀粉酶、糖化酶均来源于诺维信生物技术有限公司，酶活单位PGNU、KNU-B等为该公司自定义单位。
3.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述微生物选自热噬淀粉芽孢杆菌。
4.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述微生物种子菌悬液的制备方法为：取微生物菌种保藏斜面，加无菌水制成种子菌悬液，取种子菌悬液接种于干物质质量浓度为6％～8％的液体培养基中，在45℃，180r/min培养12～18h，制备得到菌体浓度为107～109个/mL的微生物种子菌悬液；所述液态培养基的配制方法是：将100g低次烟叶末和100g麦芽粉混合后，加水1500mL，在60℃浸渍2h，过滤，然后在过滤后获得的液体中加水配成干物质浓度为6％～8％的液态培养基。
5.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的烟草增质液为炒米汁或枣汁。
6.如权利要求5所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，所述炒米汁制作方法为：取1000g大米，放到铁锅中炒，炒至大米变黄、膨胀成黑色团状直至粘成一团，然后加水煮沸10min，过滤取汁，定容到2500mL。
7.如权利要求5所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，所述枣汁的制备方法为：取干重为300g的红枣，加水煮沸2h，过滤取汁，定容到1500mL。
8.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(4)中，每千克低次烟叶中加入复合酶液15～35mL，每千克低次烟叶中加入微生物种子菌悬液100～300mL，每千克低次烟叶中加入烟草增质液100～200mL。
9.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述制成的低次烟叶固态发酵物料中水分质量百分含量为30％～60％。
10.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述烟叶框中烟叶堆积的容积密度为0.2～0.7g/cm3。
11.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述发酵室的温度为40℃～60℃，湿度为60％～95％，通风条件下酶解和固态发酵5～20d。
12.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(7)中，采用微波加热法对发酵后的低次烟叶进行杀菌，微波中火处理3～8min。
13.如权利要求1所述的一种固态发酵改善低次烟叶内在品质的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述干燥为热风干燥，干燥后烟叶中水分质量百分含量为11％～13％。
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