CN102217786B - 一种微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟草加工技术领域，涉及一种微生物固态发酵法制备烟草薄片基础物料-烟梗纤维素的方法。本发明选择高产蛋白酶、果胶酶、木质素酶、淀粉酶等酶的微生物，以烟梗、烟末和碎烟叶为原料，制备微生物种子，所制备的微生物种子接种到烟梗中，进行固态发酵，发酵后的烟梗在缓冲液中浸泡并进行酶解，酶解后的烟梗，蛋白质、木质素、果胶质等大分子物质被降解成小分子物质，与烟梗中的纤维素类物质易于分离，再经搅拌打浆、过滤、分离得到水溶性浸出物及水不溶性的烟梗纤维素。本发明方法具有工艺简单、节省能源、减少设备投资、提高烟草薄片的综合质量的优点，可大幅降低烟草薄片中蛋白质、果胶和淀粉等大分子的残留量。

Description

一种微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法

技术领域

本发明属于烟草加工技术领域，涉及一种微生物固态发酵法制备烟草薄片基础物料--烟梗纤维素的方法。

背景技术

目前烟草薄片的生产方法，有辊压法、稠浆法和造纸法。以造纸法最为流行，如图1所示的造纸法烟草薄片生产工艺流程。但是造纸法中的机械磨浆和浸提工艺的能耗较高；有的浸提技术需要耗用有机溶剂。不仅增加成本，且污染环境。烟草薄片中蛋白质含量过高，香气不足，杂气较大。而残留在烟草薄片中的高含量蛋白质使得烟气有烧焦的蛋白味，使烟气带有不良气味。造成这一问题的主要原因是：在造纸法生产烟草薄片的过程中，采用的是物理-化学方法，蛋白质、果胶、淀粉等物质无法被有效降解成水溶性物质，这些大分子物质在机械磨浆过程中，仍与纤维素类物质紧密结合，从而残留于烟草薄片中。

发明内容

本发明的目的是提供一种以烟梗为原料，通过微生物固态发酵法处理烟梗，并采用生物降解烟梗制备烟草薄片基础物料——烟梗纤维素的新方法。该新方法比现有的烟草薄片的造纸法更加节能，工艺相对简单、设备投资较小，且与其它技术相配合可提高烟草薄片的综合质量。

本发明选择高产蛋白酶、果胶酶、木质素酶、淀粉酶等复合酶的微生物，以烟梗、烟末和碎烟叶为原料，制备微生物种子，所制备的微生物种子接种到烟梗中，进行固态发酵，发酵后的烟梗，富含复合酶，发酵后的烟梗在缓冲液中浸泡并进行更为彻底的酶解，进一步酶解后的烟梗，蛋白质、木质素、果胶质等大分子物质被降解成小分子物质，与烟梗中的纤维素类物质易于分离，再经搅拌打浆，并经过过滤、离心，可得到水溶性浸出物及水不溶性的烟草纤维类物质。

本发明的微生物固态发酵法制备烟草薄片基础物料——烟梗纤维素的方法，依次经微生物种子培养步骤(如图2所示)、微生物发酵烟梗步骤和烟梗纤维素的分离步骤(如图3所示)，获得所述烟梗纤维素；所述微生物种子培养步骤以黑曲霉为发酵微生物，采用液态种子逐级培养或固态种子逐级培养获得一级、二级或三级微生物种子，所述微生物发酵烟梗步骤包括烟梗的固态发酵步骤和烟梗的浸泡酶解步骤。

本发明所述微生物种子培养步骤，具体包括如下步骤：

(1)选择黑曲霉为发酵微生物。

所述微生物黑曲霉(Aspergillus niger)是食品和饲料工业常用菌种，如，中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection)保藏并提供的CICC40431-黑曲霉。

(2)将黑曲霉经PDA斜面培养基活化培养成熟后，制备孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中孢子的浓度不低于107个/ml。

所述PDA斜面培养基活化培养为：采用PDA斜面培养基，划线接种后在30℃-32℃培养5天，获得成熟的黑曲霉孢子。

所述孢子悬浮液采用包括如下步骤的方法制得：在培养成熟的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水，用接种铲或接种针将孢子刮下；将孢子悬浮液移到一个含玻璃珠的无菌三角瓶中；打散后获得孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中的孢子浓度不得低于10⁷个/mL。

如在8×24cm的茄子瓶斜面菌种中加入无菌水的量为60mL。

(3)将孢子悬浮液采用液态逐级扩大培养或固态逐级扩大培养，依次获得黑曲霉一级种子液、二级种子液和三级种子液，或者依次获得黑曲霉一级种子液、二级固态种子和三级固态种子。

较佳的，步骤(3)中，所述黑曲霉一级种子液、二级种子液和三级种子液采用包括如下步骤的方法制得：

a)在烟梗粉末和碎烟叶末中加水配成一级种子培养基，灭菌并冷却后，再将孢子悬浮液接入所述一级种子培养基中，然后经30-32℃摇瓶培养2-3天获得黑曲霉一级种子液；

优选的，步骤a)中，所述一级种子培养基为含水量为85-95％(重量百分含量)的烟梗粉末和碎烟叶末培养基；进一步的，所述一级种子培养基为含水量为90-92％(重量百分含量)的烟梗粉末和碎烟叶末培养基。

优选的，步骤a)中，所述灭菌的温度如为121℃，灭菌时间如为20-30min；冷却至如30℃。

b)将黑曲霉一级种子液依次扩级培养获得黑曲霉二级种子液和黑曲霉三级种子液，其中，培养黑曲霉二级种子液的培养基和培养黑曲霉三级种子液的培养基均为烟梗粉末和碎烟叶末中加水配成的培养基。所述黑曲霉一级种子液扩级培养黑曲霉二级种子液和黑曲霉三级种子液采用三角瓶或种子罐培养。其中，所述一级种子液和二级种子液接入到下一级种子液的培养基中的接种量为10-30％(以培养基重量为基准)；进一步的，所述一级种子液和二级种子液接入到下一级种子液的培养基中的接种量为20-30％(以培养基重量为基准)。

优选的，步骤b)中，所述黑曲霉二级和三级种子液的培养基为含水量为85-95％(重量百分含量)的烟梗粉末和碎烟叶末。进一步的，所述二级和三级种子液培养基的含水量为90-92％(重量百分含量)。

较佳的，步骤(3)中，所述黑曲霉一级种子液、二级固态种子和三级固态种子采用包括如下步骤的方法制得：

A)在烟梗粉末和碎烟叶末中加水配成一级种子培养基，灭菌并冷却后，再将孢子悬浮液接入所述一级种子培养基，然后经30-32℃摇瓶培养2-3天获得黑曲霉一级种子液；

优选的，步骤A)中，所述一级种子培养基为含水量为85-95％(重量百分含量)的烟梗粉末和碎烟叶末。进一步的，所述一级种子培养基的含水量为90-92％(重量百分含量)。

优选的，步骤A)中，所述灭菌的温度如为121℃，灭菌时间如为20-30min；冷却至如30℃。

B)将黑曲霉一级种子液接入到含水量为20-40％(重量百分含量)的烟梗粉末培养基中，接种量为培养基重量的20-40％，搅匀，经三角瓶培养获得黑曲霉二级固态种子，其中三角瓶培养的温度为30℃-32℃，培养时间为4-6天。进一步的，所述黑曲霉二级固态种子的获得时，接入的黑曲霉一级种子液的接种量占发酵培养基重量的20-30％。

C)在黑曲霉二级固态种子中加入0.5-1.5倍重量的无菌水，搅匀，接入到含水量为20-40％(重量百分含量)的烟梗粉末中，接种量为培养基重量的20-40％，搅匀，在恒温恒湿培养箱中经浅盘培养获得黑曲霉三级固态种子，其中浅盘培养的温度为30℃-35℃，培养时间为4-6天。进一步的，所述在黑曲霉二级固态种子中加入1-1.5倍重量的无菌水。进一步的，所述黑曲霉三级固态种子的获得时，接入的黑曲霉二级种子液的接种量占发酵培养基重量的20-30％。

本发明所述烟梗的固态发酵步骤，具体包括如下步骤：

(1)取烟梗，加水浸泡至少4h后，去除自由水得到湿基烟梗作为发酵培养基，其中，湿基烟梗中水和烟梗的质量比为0.5-1.2∶1，接种黑曲霉二级种子液或三级种子液，或者接种黑曲霉二级固态种子或三级固态种子，采用固态发酵法在30-35℃的发酵温度下发酵4-5天，其中发酵时通风量为1-2vvm。较佳的，所述湿基烟梗中水和烟梗的质量比为0.6-1.0∶1。

其中，黑曲霉二级种子液或三级种子液的接种量占发酵培养基重量的10-30％；或者黑曲霉二级固态种子或三级固态种子的接种量占发酵培养基重量的10-30％。所述接种的种子的级数则根据发酵生产的规模而定。

进一步的，所述黑曲霉二级种子液或三级种子液的接种量占发酵培养基重量的15-25％；或者黑曲霉二级固态种子或三级固态种子的接种量占发酵培养基重量的15-25％。

较佳的，所述固态发酵时，可采用各种规格的强制通风，如采用间歇搅拌式的厚层通风发酵类型的反应器，在通风发酵池中，通风量为1-2vvm。

(2)发酵结束后，分离除去孢子，获得发酵后的烟梗。

较佳的，发酵结束后，为除去烟梗上含有的大量的微生物孢子，通过分离装置分离收集孢子；其中，小规模的分离收集孢子时可采用真空抽吸，大规模的分离收集孢子时可采用袋式除尘装置。

本发明所述烟梗的浸泡酶解步骤，具体包括如下步骤：

将发酵后的烟梗浸泡于柠檬酸与水配成的缓冲液中进行酶解，获得酶解后的烟梗浆液；其中柠檬酸缓冲液与发酵后的烟梗湿基的重量比为1-1.5∶1，柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为0.05-0.2mol/L，pH为3.5-5.5。

所述发酵后的烟梗湿基与水的配比以能顺利进行机械搅拌为度。

较佳的，所述浸泡酶解在20～50r/min.低速搅拌情况下，在30-55℃的保温条件下，浸泡并酶解12-36h。

本发明所述烟梗纤维素的分离步骤，具体包括如下步骤：

将酶解后的烟梗浆液加水进一步打浆、过滤或压滤分离出烟梗纤维素，然后依次经水洗、40-60℃条件下烘干后，获得所述烟草薄片基础物料——烟梗纤维素。

所述酶解后的烟梗浆液进一步打浆，可根据搅拌的需要加入适量的水，在罐内用搅拌器或搅拌桨进一步打成含纤维渣的浆液。

优选的，所述过滤或压滤采用孔径为2-3mm的过滤器。

所述过滤或压滤分离出烟梗纤维素和滤液，如可采用如下的步骤方法：

在一罐内安置一带孔筛网容器，其筛网的孔径为2-3mm，顶部空，自流或机械输送含烟梗纤维素的浆液进入带孔筛网容器内，在搅拌下，使浆液从筛孔中流下，保留烟梗纤维素在筛网容器内。必要时用清水洗涤过滤或压滤后的烟梗纤维素；所得到的烟梗纤维素粗品可进一步采用适量水清洗，沥干，最后在40-60℃下烘干。

本发明的有益效果如下：

在传统的造纸法烟草薄片工艺中，机械磨浆和浸提工艺的能耗较高；有的浸提技术需要耗用有机溶剂。不仅增加成本，且污染环境。烟草薄片中蛋白质、果胶、淀粉等大分子物质含量过高，香气不足，杂气较大。

本发明利用微生物发酵法来处理烟草原料，主要是基于生物酶解作用，在较温和的条件下，对烟草原料(包括烟梗、烟末、碎烟和低次烟叶)中的蛋白质、果胶、木质素等物质进行有针对性的生物转化。具有工艺相对简单，节省能源、减少设备投资、提高烟草薄片综合质量的优点。本发明通过选择合适的微生物黑曲霉，黑曲霉产生的复合酶及各种霉的配比以及各级培养基及其配比能使烟草中的纤维类物质不分解或少量分解。而且发酵条件相对温和，对纤维类物质的破坏作用很小，不会使纤维帚化或变短。通过选择合适的发酵用微生物，有针对性地水解烟草中的果胶、蛋白质和淀粉等大分子物质。烟草中的蛋白质、果胶和淀粉被酶解后所产生的氨基酸、还原糖等小分子物质，被转移到水溶液中，故可大幅降低烟草薄片中蛋白质、果胶和淀粉等大分子的残留量。

附图说明

图1传统的造纸法生产烟草薄片的工艺流程

图2微生物种子培养步骤的工艺流程

图3微生物发酵烟梗步骤和烟梗纤维素的分离步骤的工艺流程

图4黑曲霉固态发酵烟梗实验

图5黑曲霉固态发酵烟梗经清洗后所得的烟梗纤维素(不同时间)

图6固态发酵时间对果胶降解的影响

图7黑曲霉固态发酵后分离水洗后得到的烟梗纤维素

图8孔径对过滤的影响

图9固态发酵试验装置

图10烟梗残渣浸泡和过滤操作

图11黑曲霉固态发酵烟梗，分离并水洗后得到的烟梗纤维素

图12实施例2中烟梗纤维素的固态发酵、浸泡酶解和烟梗纤维素的分离实验流程

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

发酵时间对烟梗收率及残余果胶含量的影响

固态发酵方法：在灭菌过的1000ml三角瓶中，加50g烟梗，加水30mL，接种黑曲霉二级种子液20mL，置于30℃固态培养箱中分别培养32h、38h、44h、50h、56h、62h，发酵结束后用0.1mol/L，pH为4.4的柠檬酸缓冲水溶液浸泡24h，将发酵烟梗搓烂，用清水清洗，筛网过滤去除菌体以及杂物，剩余烟梗残渣置于40℃环境中烘干，测其重量，计算得率。

不同发酵时间对烟梗残渣收率的影响如表1所示，发酵中的烟梗如图4所示。发酵不同时间的烟梗残渣由图5所示。由表1可以看出，随着发酵时间的增加，烟梗残渣得率总体趋势是下降的(排除洗涤程度以及其他因素)。从图5可看出，随着发酵时间的增加，烟梗残渣的颜色逐渐变浅，当用水清洗后，可见丝状纤维素。

表1 烟梗固态发酵时间对得率的影响

再次进行黑曲霉固态发酵烟梗实验，取培养好的种子液于烟梗培养基中，30℃恒温培养，每隔1d取样测定烟梗残渣及其果胶含量，结果如图6所示。

由图6可知，果胶含量随着发酵时间呈下降趋势，到第4天时，烟梗残渣的果胶含量降至6.43％，之后不再下降，基本稳定在6.40％左右。烟梗残渣的收率约12％(以发酵前烟梗干重为基准)。由于烟梗经固态发酵之后结构发生变化，烟梗的骨架被破坏，由棒状变成丝状，果胶含量也基本不变，因此4d的固态发酵时间基本上可达到目的。发酵后的烟梗残渣经水洗后，可得到杂质较少的烟梗纤维素，如图7所示。

实施例2

烟梗的黑曲霉固态发酵综合实验：进行小型固态发酵罐通风发酵烟梗实验，菌种采用黑曲霉。

(1)孢子悬浮液的制备：

选择黑曲霉为发酵微生物，采用PDA斜面培养基，划线接种后在30℃培养5天，获得成熟的黑曲霉孢子。在培养成熟的茄子瓶(8×24cm)斜面菌种中加入无菌水60mL，用接种铲将孢子刮下；将孢子悬浮液移到一个含玻璃珠的无菌三角瓶中；打散后获得孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中的孢子浓度不低于10⁷个/mL。

(2)黑曲霉一级、二级、三级种子液的制备：

在121℃灭菌30min的1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，加入烟梗粉末8g，碎烟叶末10g，加70℃的水200mL，保温30min；然后冷却至30℃备用；接入斜面种子孢子悬浮液40mL，摇瓶150r/min，30℃培养2天，获得黑曲霉一级种子液。

将黑曲霉一级种子液依次经种子罐扩级培养获得黑曲霉二级种子液和黑曲霉三级种子液。以黑曲霉一级种子液为种子，在灭菌后的种子培养容器内，加入适量65℃的水、烟梗粉末(含量为40g/L)、碎烟叶末(含量为50g/L)；保温30min后，冷却至30℃备用；接入占培养基重量20％的黑曲霉一级种子液，通风量控制为1-2vvm，搅拌转速为150r/m，在30℃下培养2天，获得黑曲霉二级种子液。以黑曲霉二级种子液为种子，按照黑曲霉二级种子液的制备步骤制备黑曲霉三级种子液。

(3)烟梗的固态发酵：

烟梗的固态发酵接种方法可采用液体种子，也可采用固态种子。种子的级数二级或三级根据发酵规模而定。

取500g烟梗，加水300mL浸泡4h后，接种黑曲霉三级种子液120mL。采用固态发酵法在30℃的发酵温度下发酵5天，其中采用间歇搅拌式的厚层通风发酵类型的反应器，在通风发酵罐中，发酵时通风量控制为1-2vvm；其中，黑曲霉种子液的接种量占发酵培养基重量的15％。发酵结束后，采用现有常规的分离装置分离收集孢子，并除去孢子，获得发酵后的烟梗。其中固态发酵装置如图9所示。

(4)烟梗的浸泡酶解：

将发酵后的烟梗浸泡于柠檬酸缓冲液中进行酶解，获得酶解后的烟梗浆液；其中柠檬酸缓冲液与发酵后的烟梗湿基的重量比为1∶1，柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为0.1mol/L，pH为4.4。且浸泡酶解在30r/min.的低速搅拌情况下，在45℃的保温条件下，浸泡并酶解24h。

(5)烟梗纤维素的分离：

将酶解后的烟梗浆液加水打浆，采用孔径为2mm的筛网过滤去除菌体以及杂物，分离出烟梗纤维素，然后依次采用2倍的清水对烟梗纤维素的粗品进行水洗，在40℃条件下烘干后，获得所述烟草薄片基础物料——烟梗纤维素，74g，收率为14.8％。其中烟梗残渣的浸泡、过滤操作如图10所示。

上述烟梗纤维素的固态发酵、浸泡酶解和烟梗纤维素的分离实验流程如图12所示。

发酵并酶解后的烟梗纤维素与液体的分离：烟梗纤维素与发酵液液体的分离属于固液分离，固液分离一般有两种方式即离心与过滤。由于烟梗中果胶被降解后，发酵液变得粘稠，本实施例选择过滤法进行烟梗纤维素与发酵液的分离。而使用过滤的方法，过滤介质的孔径就显得尤为重要，因为发酵液较为粘稠，孔径过小会造成过滤非常困难，而过大则会造成部分烟梗进入滤液，造成烟梗纤维素回收率的下降。分别选取孔径为0.5mm、1mm、2mm、3mm的不锈钢丝网作过滤介质，进行过滤实验，以回收率与滤液体积为指标，结果如图8。

由图8可知，孔径越大，过滤效果越好。但是用孔径为3mm的过滤介质时，会在滤液中发现部分梗丝，说明3mm的孔径对于烟梗丝来说有点大。而孔径小于2mm时，烟梗纤维素会将小孔堵塞，造成过滤困难，滤渣中还有部分液体附着在烟梗纤维素上。采用孔径2mm的过滤介质，在自然压力下，烟梗纤维素与液体可以得到较好的分离，因此选择2mm作为过滤介质所用孔径。

烟梗纤维素的纯化：经过初步固液分离后，可以得到烟梗纤维素与液体基本分离，但是烟梗纤维素表面还附着少许粘稠状的液体，这些液体中包含果胶降解物、纤维素降解物、微生物及其代谢产物等，所以要得到纯净的烟梗纤维素，首先要去除这些粘稠状的液体，本实施例分别采用加热法与加水稀释法来去除附着在烟梗纤维素表面的粘稠状液体。研究结果显示，加热法并不能使液体粘度下降，从而有利于烟梗丝的纯化。这可能是由于加热法是通过高温增加物质溶解度的原理来降解液体粘度的，而在本实施例中造成液体粘稠的物质不溶于水，加热并不能使这些物质溶于水中，因此加热法不适合本实施例。

加水稀释法可以显著改变液体的粘度，从而有利于去除烟梗纤维素表面的粘稠状液体，实验结果表明，过滤后的烟梗纤维素用2倍的清水洗涤，即可将表面粘稠状物质去除，得到纯净的烟梗丝，因此本实施例选用加水稀释法来实现烟梗纤维素的纯化。水洗并烘干后的烟草纤维素见图11。

经检测，本实施例所得的烟梗残渣的果胶含量为6.2％，由于发酵条件相对温和，对纤维类物质的破坏作用很小，不会使烟梗纤维帚化或变短；发酵后的烟梗骨架被破坏，由棒状变成丝状；烟梗中的蛋白质、果胶和淀粉被发酵、酶解后产生的氨基酸、还原糖等小分子物质转移到水溶液中，发酵后的烟梗残渣再经过滤、水洗后可得到蛋白质、果胶和淀粉等大分子杂质更少的烟梗纤维素。

实施例3

烟梗的黑曲霉固态发酵综合实验：进行了小型固态发酵罐通风发酵烟梗实验，菌种采用黑曲霉。

(1)孢子悬浮液的制备：

选择黑曲霉为发酵微生物，采用PDA斜面培养基，划线接种后在32℃培养5天，获得成熟的黑曲霉孢子。在培养成熟的茄子瓶(8×24cm)斜面菌种中加入无菌水60mL，用接种铲将孢子刮下；将孢子悬浮液移到一个含玻璃珠的无菌三角瓶中；打散后获得孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中的孢子浓度为10⁷个/mL。

(2)黑曲霉一级、二级、三级种子液的制备：

在121℃灭菌30min的1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，加入烟梗粉末8g，碎烟叶末10g，加70℃的水200mL，保温30min；然后冷却至30℃备用；接入斜面种子孢子悬浮液40mL，摇瓶150r/min，32℃培养2天，获得黑曲霉一级种子液。

将黑曲霉一级种子液依次经种子罐扩级培养获得黑曲霉二级种子液和黑曲霉三级种子液。以黑曲霉一级种子液为种子，在空罐灭菌后的种子罐内，加入适量65℃的水、烟梗粉末(含量为40g/L)、碎烟叶末(含量为50g/L)；保温30min后，冷却至30℃备用；接入占培养基重量30％的黑曲霉一级种子液，通风量控制为1-2vvm，搅拌转速为150r/m，在32℃下培养2天，获得黑曲霉二级种子液。以黑曲霉二级种子液为种子，按照黑曲霉二级种子液的制备步骤制备黑曲霉三级种子液。

(3)烟梗的固态发酵：

烟梗的固态发酵接种方法可采用液体种子，也可采用固态种子。种子的级数二级或三级根据发酵规模而定。

取500g烟梗，加水300mL浸泡4h后，接种黑曲霉三级种子液200mL采用固态发酵法在33℃的发酵温度下发酵4天，其中采用间歇搅拌式的厚层通风发酵类型的反应器，在通风发酵池罐中，发酵时通风量控制为1-2vvm；其中，控制黑曲霉种子液的接种量占发酵培养基重量的25％。发酵结束后，采用现有常规的分离装置分离收集孢子，并除去孢子，获得发酵后的烟梗。

(4)烟梗的浸泡酶解：

将发酵后的烟梗浸泡于柠檬酸缓冲液中进行酶解，获得酶解后的烟梗浆液；其中柠檬酸缓冲液与发酵后的烟梗湿基的重量比为1.5∶1，柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为0.2mol/L，pH为3.5。且浸泡酶解在50r/min.的低速搅拌情况下，在30℃的保温条件下，浸泡并酶解36h。

(5)烟梗纤维素的分离：

将酶解后的烟梗浆液加水打浆，采用孔径为2-3mm的筛网过滤去除菌体以及杂物，分离出烟梗纤维素，然后依次采用2倍的清水对烟梗纤维素的粗品进行水洗，在60℃条件下烘干后，获得所述烟草薄片基础物料——烟梗纤维素，71g，收率为14.2％。随着水洗程度的加大，纤维纯度越高，纤维中所含杂质含量越低。

经检测，本实施例所得的烟梗残渣的果胶含量为6.2％，由于发酵条件相对温和，对纤维类物质的破坏作用很小，不会使烟梗纤维帚化或变短；发酵后的烟梗骨架被破坏，由棒状变成丝状；烟梗中的蛋白质、果胶和淀粉被发酵、酶解后产生的氨基酸、还原糖等小分子物质转移到水溶液中，发酵后的烟梗残渣再经过滤、水洗后可得到蛋白质、果胶和淀粉等大分子杂质更少的烟梗纤维素。

实施例4

烟梗的黑曲霉固态发酵综合实验：进行小型固态发酵罐通风发酵烟梗实验，菌种采用黑曲霉。

(1)孢子悬浮液的制备：

选择黑曲霉为发酵微生物，采用PDA斜面培养基，划线接种后在32℃培养5天，获得成熟的黑曲霉孢子。在培养成熟的茄子瓶(8×24cm)斜面菌种中加入无菌水60mL，用接种铲将孢子刮下；将孢子悬浮液移到一个含玻璃珠的无菌三角瓶中；打散后获得孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中的孢子浓度为10⁷个/mL。

(2)黑曲霉一级种子液、二级固态种子、三级固态种子的制备：

一级种子液的制备：

在121℃灭菌30min的1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，加入烟梗粉末10g，碎烟叶12g，加70℃的水200mL，保温30min；然后冷却至30℃备用；接入斜面种子孢子悬浮液40mL，摇瓶150r/min，30℃培养2天，获得黑曲霉一级种子液。

烟梗用粉碎机粉碎，用30目筛过滤后，加无菌水进行调配，得到烟梗粉末培养基；

将黑曲霉一级固态种子接入到含水量为30％的烟梗粉末培养基中，接入的种子量为培养基重量的20％，搅匀，经三角瓶培养获得黑曲霉二级种子，其中三角瓶培养的温度为30℃℃，培养时间为6天。

在黑曲霉二级固态种子中加入1倍重量的无菌水，接入到含水量为20％的烟梗粉末中，接入的种子量为培养基重量的30％，搅匀，在恒温恒湿培养箱中经浅盘培养获得黑曲霉三级种子，其中浅盘培养的温度为30℃，培养时间为6天。

(3)烟梗的固态发酵：

烟梗的固态发酵接种方法可采用液体种子，也可采用固态种子。种子的级数二级或三级根据发酵规模而定。

取500g烟梗，加水500mL浸泡4h后，接种黑曲霉三级固态种子其中，黑曲霉三级固态种子的接种量占发酵培养基重量的15％。采用固态发酵法在35℃的发酵温度下发酵4天，其中采用间歇搅拌式的厚层通风发酵类型的反应器，在通风发酵池罐中，发酵时通风量控制为1-2vvm。发酵结束后，采用现有常规的分离装置分离收集孢子，并除去孢子，获得发酵后的烟梗。其中固态发酵装置如图9所示。

(4)烟梗的浸泡酶解：

将发酵后的烟梗浸泡于柠檬酸缓冲液中进行酶解，获得酶解后的烟梗浆液；其中柠檬酸缓冲液与发酵后的烟梗湿基的重量比为1.3∶1，柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为0.05mol/L，pH为5.5。且浸泡酶解在20r/min.的低速搅拌情况下，在55℃的保温条件下，浸泡并酶解12h。

(5)烟梗纤维素的分离：

将酶解后的烟梗浆液加水打浆，采用孔径为2-3mm的筛网过滤去除菌体以及杂物，分离出烟梗纤维素，然后依次采用2倍的清水对烟梗纤维素的粗品进行水洗，在60℃条件下烘干后，获得所述烟草薄片基础物料——烟梗纤维素，74g，收率为14.8％。

经检测，本实施例所得的烟梗残渣的果胶含量为6.2％，由于发酵条件相对温和，对纤维类物质的破坏作用很小，不会使烟梗纤维帚化或变短；发酵后的烟梗骨架被破坏，由棒状变成丝状；烟梗中的蛋白质、果胶和淀粉被发酵、酶解后产生的氨基酸、还原糖等小分子物质转移到水溶液中，发酵后的烟梗残渣再经过滤、水洗后可得到蛋白质、果胶和淀粉等大分子杂质更少的烟梗纤维素。

实施例5

烟梗的黑曲霉固态发酵综合实验：进行小型固态发酵罐通风发酵烟梗实验，菌种采用黑曲霉。

(1)孢子悬浮液的制备：

选择黑曲霉为发酵微生物，采用PDA斜面培养基，划线接种后在32℃培养5天，获得成熟的黑曲霉孢子。在培养成熟的茄子瓶(8×24cm)斜面菌种中加入无菌水60mL，用接种铲将孢子刮下；将孢子悬浮液移到一个含玻璃珠的无菌三角瓶中；打散后获得孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中的孢子浓度为10⁷个/mL。

(2)黑曲霉一级种子液、二级固态种子、三级固态种子的制备：

一级种子液的制备：

在121℃灭菌30min的1L三角瓶中(棉塞同时灭菌)，加入烟梗粉末8g，碎烟叶末10g，加70℃的水200mL，保温30min；然后冷却至30℃备用；接入斜面种子孢子悬浮液40mL，摇瓶150r/min，32℃培养2天，获得黑曲霉一级种子液。

烟梗用粉碎机粉碎，用30目筛过滤后，加无菌水进行调配，得到烟梗粉末培养基；

将黑曲霉一级种子接入到含水量为30％的烟梗粉末培养基中，接入的种子量为培养基重量的30％，搅匀，经三角瓶培养获得黑曲霉二级固态种子，其中三角瓶培养的温度为30℃，培养时间为5天。

在黑曲霉二级固态种子中加入1.5倍重量的无菌水，接入到含水量为20％的烟梗粉末中，接入的种子量为培养基重量的20％，搅匀，在恒温恒湿培养箱中经浅盘培养获得黑曲霉三级固态种子，其中浅盘培养的温度为32℃，培养时间为5天。

(3)烟梗的固态发酵：

烟梗的固态发酵接种方法可采用液体种子，也可采用固态种子。种子的级数二级或三级根据发酵规模而定。

取500g烟梗，加水300mL浸泡4h后，接种黑曲霉三级固态种子其中，黑曲霉三级固态种子的接种量占发酵培养基重量的25％。采用固态发酵法在33℃的发酵温度下发酵4天，其中采用间歇搅拌式的厚层通风发酵类型的反应器，在通风发酵池中，发酵时通风量控制为1-2vvm。发酵结束后，采用现有常规的分离装置分离收集孢子，并除去孢子，获得发酵后的烟梗。其中固态发酵装置如图9所示。

(4)烟梗的浸泡酶解：

将发酵后的烟梗浸泡于柠檬酸缓冲液中进行酶解，获得酶解后的烟梗浆液；其中柠檬酸缓冲液与发酵后的烟梗湿基的重量比为1.2∶1，柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为0.1mol/L，pH为4.4。且浸泡酶解在30r/min.的低速搅拌情况下，在45℃的保温条件下，浸泡并酶解24h。

(5)烟梗纤维素的分离：

将酶解后的烟梗浆液加水打浆，采用孔径为2-3mm的筛网过滤去除菌体以及杂物，分离出烟梗纤维素，然后依次采用2倍的清水对烟梗纤维素的粗品进行水洗，在50℃条件下烘干后，获得所述烟草薄片基础物料——烟梗纤维素，74g，收率为14.8％。

经检测，本实施例所得的烟梗残渣的果胶含量为6.2％，由于发酵条件相对温和，对纤维类物质的破坏作用很小，不会使烟梗纤维帚化或变短；发酵后的烟梗骨架被破坏，由棒状变成丝状；烟梗中的蛋白质、果胶和淀粉被发酵、酶解后产生的氨基酸、还原糖等小分子物质转移到水溶液中，发酵后的烟梗残渣再经过滤、水洗后可得到蛋白质、果胶和淀粉等大分子杂质更少的烟梗纤维素。

Claims (9)

1.一种微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法，依次经微生物种子培养步骤、微生物发酵烟梗步骤和烟梗纤维素的分离步骤，获得所述烟梗纤维素；所述微生物种子培养步骤以黑曲霉为发酵微生物，采用液态种子培养或固态种子培养获得二级或三级微生物种子，所述微生物发酵烟梗步骤包括烟梗的固态发酵步骤和烟梗的浸泡酶解步骤； 

所述烟梗的固态发酵步骤，具体包括如下步骤：（1）取烟梗，加水浸泡至少4h后，去除自由水得到湿基烟梗作为发酵培养基，接种黑曲霉二级种子液或三级种子液，或者接种黑曲霉二级固态种子或三级固态种子，采用固态发酵法在30-35℃的发酵温度下发酵4-5天，其中发酵时通风量为1-2vvm；（2）发酵结束后，分离除去孢子，获得发酵后的烟梗； 

所述烟梗的浸泡酶解步骤，具体包括如下步骤：将发酵后的烟梗浸泡于柠檬酸与水配成的缓冲液中进行酶解，获得酶解后的烟梗浆液；其中柠檬酸缓冲液与发酵后的烟梗湿基的重量比为1-1.5∶1，柠檬酸缓冲液的摩尔浓度为0.05-0.2mol/L，pH为3.5-5.5。 

2.如权利要求1所述的微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法，其特征在于，所述微生物种子培养步骤，具体包括如下步骤： 

（1）选择黑曲霉为发酵微生物； 

（2）将黑曲霉经PDA斜面培养基培养后，制备孢子悬浮液，其中孢子悬浮液中孢子的浓度不低于10⁷个/ml； 

（3）将孢子悬浮液采用液态逐级扩大培养或固态逐级扩大培养，依次获得黑曲霉一级种子液、二级种子液和三级种子液，或者依次获得黑曲霉一级种子液、二级固态种子和三级固态种子。 

3.如权利要求2所述的微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法，其特征在于， 

步骤（3）中，所述黑曲霉一级种子液、二级种子液和三级种子液采用包括如下步骤的方法制得： 

a）在烟梗粉末和碎烟叶末中加水配成一级种子培养基，灭菌并冷却后，再将孢子悬浮液接入所述一级种子培养基，然后经30-32℃摇瓶培养2-3天获得黑曲霉一级种子液；其中，所述一级种子培养基的含水量为85-95%（重量百分含量）； 

b）将黑曲霉一级种子液依次扩级培养获得黑曲霉二级种子液和黑曲霉三级种子液，其中，培养黑曲霉二级种子液的培养基和培养黑曲霉三级种子液的培养基均为烟梗粉末和碎烟叶末中加水配成的培养基，所述黑曲霉二级种子液和三级种子液的培养基的含水量均为 85-95%（重量百分含量）。 

4.如权利要求2所述的微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法，其特征在于， 

步骤（3）中，所述黑曲霉一级种子液、二级固态种子和三级固态种子采用包括如下步骤的方法制得： 

A）在烟梗粉末和碎烟叶末中加水配成一级种子培养基，灭菌并冷却后，再将孢子悬浮液接入所述一级种子培养基，然后经30-32℃摇瓶培养2-3天获得黑曲霉一级种子液；其中，所述一级种子培养基的含水量为85-95%（重量百分含量）； 

B）将黑曲霉一级种子液接入到含水量为20-40%的烟梗粉末培养基中，接种量为培养基总重的20-40%，搅匀，经三角瓶培养获得黑曲霉二级固态种子，其中三角瓶培养的温度为30℃-32℃，培养时间为4-6天； 

C）在黑曲霉二级固态种子中加入0.5-1.5倍重量的无菌水，搅匀，接入到含水量为20-40%的烟梗粉末中，接种量为培养基总重的20-40%，搅匀，在恒温恒湿培养箱中经浅盘培养获得黑曲霉三级固态种子，其中浅盘培养的温度为30℃-35℃，培养时间为4-6天。 

5.如权利要求1所述的微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述湿基烟梗中水和烟梗的质量比为0.5-1.2∶1；所述黑曲霉二级种子液或三级种子液占发酵培养基总重的10-30%；所述黑曲霉二级固态种子或三级固态种子的接种量占发酵培养基总重的10-30%。 

6.如权利要求1所述的微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法，其特征在于，所述浸泡酶解在20-50r/min的低速搅拌情况下，在30-55℃的保温条件下，浸泡并酶解12-36h。 

7.如权利要求1所述的微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法，其特征在于，所述烟梗纤维素的分离步骤，具体包括如下步骤：将酶解后的烟梗浆液加水进一步打浆、过滤或压滤分离出烟梗纤维素，然后依次经水洗、40-60℃条件下烘干后，获得所述烟梗纤维素。 

8.如权利要求7所述的微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法，其特征在于，所述过滤或压滤采用孔径为2-3mm的过滤器。 

9.如权利要求1-8任一所述的微生物固态发酵法制备烟梗纤维素的方法所制得的烟梗纤维素作为烟草薄片基础物料的应用。 

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