CN103952317B

CN103952317B - 酯化红曲菌种及其生产工艺

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Publication number: CN103952317B
Application number: CN201310124521.3A
Authority: CN
Inventors: 姚继成
Original assignee: Wuhan Jiacheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhan Jiacheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2033-04-11
Also published as: CN103952317A

Abstract

本发明公开了一种酯化红曲菌种，该菌种已于2011年2月23日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M2011048。通过真空冷冻管、试管斜面菌种、三角摇瓶种子、种子罐种子、拌种、打堆、摊堆、发酵培养、烘干等方法制备而成。酯化红曲在白酒生产中的应用可有效提高大曲的酯化力，促进有机酸转化成相应的酯，且其对己酸和乙酸转化成己酸乙酯和乙酸乙酯具有很强的选择性，使有机酸转化成相应的酯，解除了酸对细胞的毒害作用；其产生的蛋白酶也可丰富酒的香味成分。在白酒生产应用中加快有机酸与醇的酯化反应，促进生成各种酯类，缩短白酒发酵周期，增加己酸乙酯等呈香类物质的合成能力，显著提高白酒的优质品率。

Description

酯化红曲菌种及其生产工艺

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域，特别是一种高酯化力的红曲菌种。

背景技术

酯化红曲是高酯化力曲霉为主的生物酶和活菌体的生态复合菌制剂。它是以从传统红心大曲中分离得到的红色红曲霉等为出发菌株，利用现代生物工程技术对其进行分离筛选、诱变选育、繁殖复壮、菌体组合等得到多个酯化活性很强的酯化红曲霉菌种，再运用液态纯种生物发酵和固态培养技术，生产出高酯化力的酯化红曲(酶)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高酯化力的红曲菌种制造方法。

为解决上述技术问题，本发明是按如下方式实现的：

一种酯化红曲菌种，该菌种已于2011年2月23日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2011048。分类命名：红色红曲霉JCZM-1，Monascus rubber JCZM-1。

一种酯化红曲菌种生产工艺，包括以下步骤：

步骤一、真空冷冻管在4℃下，常温冰箱保藏；

步骤二、试管斜面菌种制备：

一、调制培养基：蛋白胨2％、可溶性淀粉2％、麦芽浸粉2％、(NH₄)₂SO₄0.1％、MgSO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、琼脂2％、自然pH；以18×180(mm)试管，每管装培养基7～10ml(培养基应充分热熔)，以棉塞封，10支试管包一捆，竖直放于铁丝框中，0.11MPa灭菌30min，冷却至50～60℃，倾制斜面(要求斜面培养基长度为试管的3/4)，冷凝后包扎成捆；30℃培养48hr，经检查无杂菌，方可使用；

二、接种培养：

1、真空冷冻安瓿管转试管斜面菌种：以无菌毛细吸管将一管无菌生理盐水加入安瓿管中，搅动均匀，将菌液吸入毛细吸管，接入斜面试管中；30℃培养3～5天，转接活化2到3代，30℃培养8～10天，置冰箱4℃保存备用；

2、斜面试管菌种转接：取一斜面试管种，以75％酒精溶液擦试干净，于超净台内、在酒精灯火焰上以无菌竹签接入20～30支试管斜面；培养与保存方法与所述真空冷冻安瓿管转试管斜面菌种相同；

步骤三、液体三角摇瓶菌种制备：

一、培养基：葡萄糖4％、NaNO₃0.2％、MgSO₄0.1％、牛肉膏0.3％、蛋白胨0.8％、酵母膏0.5％、pH5.0；以500ml容量三角瓶装量为100ml，将米粉分别称量装，无机盐则统一配制溶解，再分装于各三角瓶，塞棉塞、以牛皮纸包裹。0.11MPa，灭菌30min，冷却备用；

二、接种、培养：取一试管斜面菌种，以无菌竹签，接入3～5个液体三角摇瓶培养基中，于30℃、200rpm摇床振荡培养约48h，交车间验收备用；

步骤四、种子罐液体种子制备：

1、培养液配方：大米粉7.5％、NaNO₃0.4％、MgSO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、豆油0.1％；用75％酒精清洗待打开的视镜口，在保证种子罐正压的情况下，松开种子罐视镜，在取下视镜同时用酒精火焰圈封住视镜口，然后在火焰圈内打开三角瓶口，迅速将三角瓶内种子倒入种子罐，移开火焰圈同时，盖上视镜，封严；

2、培养条件及控制：转速：240rpm、温度：30～32℃、罐压：0.05～0.07MPa、

空气流量：8～10m³/hr、培养时间：约48小时；

步骤五、发酵培养：

原料配方：麸皮∶玉米粉∶谷壳6∶3∶1，玉米使用前应先进行粉碎；

将润水后的原料在125℃的温度下蒸30min；

步骤六、接种：将菌种打入已消毒的盛装菌种的容器，接原料量20％的菌种；在菌种中加入原料量0.1％的食品级冰醋酸或食品级乳酸混匀后开始接种。保证20％的接种量与接种后物料的均匀性；接种后水分要求控制在40～45％；

步骤七、打堆：用布料车将接好种的物料堆于曲池中部，扒成方堆，厚度为35～40cm，将四周的物料收拢，当环境温度低于25℃要注意物料的保温，将温度探头插入曲堆中部，注意校对仪表显示温度与标准温度计的差值；室温尽量控制在20～30℃；正常情况下，堆料温度在15～24小时升至48℃；

步骤八、摊堆养花：当曲池物料中心部位品温升至48℃时将全池物料彻底翻拌一遍，再次打堆，堆厚20～30cm，当物料的中心部位品温再次升至45℃时，再将全池物料彻底翻拌一遍后，摊满全池堆，保持品温控制在35～38℃直至加一水。养花期间尽量少用鼓风机鼓风，可通过翻曲来保证物料温度。养花期间要求每间隔3～4小时彻底翻料一次；

步骤九、加水：保持物料水分约35％～48％，室温在20～25℃，培养3天；

步骤十、出池烘干：烘干过程要严格控制物料的烘干温度，要求不超过60℃。

本发明的积极效果是：酯化红曲在白酒生产中的应用可有效提高大曲的酯化力，促进有机酸转化成相应的酯，且其对己酸和乙酸转化成己酸乙酯和乙酸乙酯具有很强的选择性，同时，因其耐酸性较强，使有机酸转化成相应的酯，解除了酸对细胞的毒害作用；其产生的蛋白酶也可丰富酒的香味成分。酯转化率在95％以上，酯化力≥35mg/g，在白酒生产应用中能加快有机酸与醇的酯化反应，促进生成各种酯类，缩短白酒发酵周期，增加己酸乙酯等呈香类物质的合成能力，显著提高白酒的优质品率。

附图说明

图1是本发明的一个实施方式示意图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

一种酯化红曲菌种，该菌种已于2011年2月23日保藏于湖北武汉武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2011048。

如图1所示，本发明一个实施例所提供的一种高酯化力的红曲菌种制造方法，包括以下步骤：

S1、真空冷冻管。-18℃，常温冰箱保藏。

S2、试管斜面茵种制备。

一、培养基：蛋白胨2％、可溶性淀粉2％、麦芽浸粉2％、(NH₄)₂SO₄0.1％、MgSO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、琼脂2％、自然pH。

方法：以18×180(mm)试管，每管装培养基7～10ml(培养基应充分热熔)，以棉塞封，10支试管包一捆，竖直放于铁丝框中，0.11MPa灭菌30min，冷却至50～60℃，倾制斜面(要求斜面培养基长度为试管的3/4)，冷凝后包扎成捆；30℃培养48hr，经检查无杂菌，方可使用。

二、接种培养：

1、真空冷冻安瓿管转试管斜面菌种。

将安瓿管领出，于超净台内以75％酒精棉球擦试干净，在安瓿管偏顶部以砂轮划一圈轮痕，以灭菌报纸或牛皮纸包裹其两端，于酒精灯火焰上，将其折断。若折断较困难，可采取以下措施：

A、于酒精灯火焰上方用无菌镊子将其顶部敲碎；

B、以酒精灯火焰灼烧安瓿管顶部，以无菌毛细吸管滴一滴无菌水于灼烧处，使其炸裂。

接着以无菌毛细吸管将一管无菌生理盐水加入安瓿管中，搅动均匀，将菌液吸入毛细吸管，接入斜面试管中。一般一支安瓿管菌种可接试管斜面3～5支。30℃培养3～5天，转接活化2到3代，30℃培养8～10天，置冰箱4℃保存备用。

2、斜面试管菌种转接

取一斜面试管种，以75％酒精溶液擦试干净，于超净台内、在酒精灯火焰上以无菌竹签接入20～30支试管斜面。培养与保存方法同真空冷冻安瓿管转试管斜面菌种。

S3、液体三角摇瓶菌种制备。

一、培养基：葡萄糖4％、NaNO₃0.2％、MgSO₄0.1％、牛肉膏0.3％、蛋白胨0.8％、酵母膏0.5％、pH5.0。

方法：以500ml容量三角瓶装量为100ml，将米粉分别称量装，无机盐则统一配制溶解，再分装于各三角瓶，塞棉塞、以牛皮纸包裹。0.11MPa，灭菌30min，冷却备用。

二、接种、培养。

取一试管斜面菌种，以无菌竹签，接入3～5个液体三角摇瓶培养基中(瓶数视所需种子量而定，一般以接种量0.1％计，200L种子罐需种子量为200mL)，于30℃、200rpm摇床振荡培养约48h(培养时间因试管斜面菌种的保藏时间而有所差异，一般新鲜保藏菌种所需时间短，而保藏时间较长菌种，培养时间也相应延长)，交车间验收备用。

S4、种子罐液体种子制备。

一、投料实消。

1、培养液配方：大米粉7.5％、NaNO₃0.4％、MgSO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、消泡剂(豆油)0.1％。

2、投料方法：确认准备工作无误后，开罐盖，加水至底层搅拌叶以上，开搅拌投料，完后继续加水到定容体积，盖好罐盖，空气升压，检查罐盖是否渗漏，视镜是否完好。计算打浆时间不少于10min。

3、预消：当总蒸汽达到0.2MPa以上方可进行消毒。先缓慢开启总蒸汽阀，开压出蒸汽阀，微开下水道阀及1号、2号罐的压出阀考克，关两路移种阀；开取样蒸汽阀，关取样入罐阀，微开取样下方阀；关分过程滤器进出汽阀及空气进气一、二阀，开上冲下蒸汽阀，微开空气入罐阀考克；进行管道预消。

4、预热：开夹层蒸汽阀预热，开后压力不超过0.2Mpa，开接种阀及考克，开罐排气阀，关空气转子流量计排气阀，当罐温升到80℃时，关夹层蒸汽。

5、进汽：关闭预消时各路排汽阀门，开压出阀，空气入罐阀、取样入罐阀。要求均匀，防止短路，罐内翻动良好，罐排气适量，控制总蒸汽。

6、保温：缓慢升温到120～125℃、罐压0.1～0.4MPa时，计算保温时间30min。结束时，关闭各路进汽阀和蒸汽阀，缩小排汽。

7、冷却：关却水器，开自来水回水，降温、待罐压降至0.08MPa停搅拌，开空气入罐保压，冷却至接种温度：35～40℃接种。

8、接种环境尘降菌清除：在冷却过程中，在20L喷雾器中灌适量自来水，将种子罐周围环境用水喷洒，以除去空气中灰尘等尘降菌。

二、接种。

1、接种量：0.1％

2、接种方法：用75％酒精清洗待打开的视镜口，在保证种子罐正压的情况下，松开种子罐视镜，在取下视镜同时用酒精火焰圈封住视镜口，然后在火焰圈内打开三角瓶口，迅速将三角瓶内种子倒入种子罐，移开火焰圈同时，盖上视镜，封严。

3、培养条件及控制：转速：240rpm、温度：30～32℃、罐压：0.05～0.07MPa、

空气流量：8～10m³/hr、培养时间：约48小时。

S5、发酵培养。

一、原料配方：麸皮∶玉米粉∶谷壳6∶3∶1，玉米使用前应先进行粉碎。

二、润水、蒸米：将润水后的原料在125℃的温度下蒸30min。

三、接种：将菌种打入已消毒的盛装菌种的容器，接原料量20％的菌种(注意准确计量)。在菌种中加入原料量0.1％的食品级冰醋酸或食品级乳酸混匀后开始接种。保证20％的接种量与接种后物料的均匀性。接种后水分要求控制在40～45％。

四、打堆、摊堆养花：

1、打堆：用布料车将接好种的物料堆于曲池中部，扒成方堆，厚度为35～40cm，将四周的物料收拢，当环境温度低于25℃要注意物料的保温，将温度探头插入曲堆中部，注意校对仪表显示温度与标准温度计的差值。室温尽量控制在20～30℃。正常情况下，堆料温度在15～24小时升至48℃。

2、摊堆养花：当曲池物料中心部位品温升至48℃时将全池物料彻底翻拌一遍，再次打堆，堆厚20～30cm，当物料的中心部位品温再次升至45℃时，再将全池物料彻底翻拌一遍后，摊满全池堆，保持品温控制在35～38℃直至加一水。养花期间尽量少用鼓风机鼓风，可通过翻曲来保证物料温度。养花期间要求每间隔3～4小时彻底翻料一次。

五、加水。

1、加1水：养花整齐，物料水分低于35％后加一水，一般在摊堆后24小时左右，此阶段红曲霉处于高速生长阶段，发热量较大，因此，要少量多次加一水，并且要保证加水后物料的均匀性，加水后水分要求保持在40～45％

加水方法：加水管上加喷头，边加水，边翻料，视曲料松散、干湿情况，重复上述步骤，直至加水后物料含水均匀，水分在40％～45％之间。要求加水完毕后物料湿润、捏之不结团，松开后物料疏松散开。

品温控制：加1水后控制品温32℃-34℃。

2、加2水：视物料的生长情况确定加二水的时间，物料水分低于40％后加二水，约在加一水后10小时左右，加水方法同前。加水后水分控制在40％～45％之，品温控制在32℃左右，并注意此阶段低温不得低于30℃，高温不得超过34℃。

加水一定要保持物料水分的均匀性，加水后一定要勤巡视，勤翻料，以免物料干湿不匀造成品温的不均匀，导致局部烧曲。

3、出池烘干前一天加水：出池前一天是否加水要根据当天水分检测结果，若水分在40％以上，则不用加水，否则适当补水，补水后水分要求不超过45％，品温控制同前。

S6、出池烘干。

酯化红曲功效成份是酯化酶，温度对酶的活性影响很大。烘干过程要严格控制物料的烘干温度，要求不超过60℃。

S7、粉碎。

S8、包装。

S9、检验。

S10、成品入库。

本发明的积极效果是：本发明首次发现一种高酯化力的红曲菌种及其制造方法，包含以下优点：

1.酯化红曲有较强的酯化作用，代谢产物与白酒酒体风味物质和相关的酯类物质一致，酯化红曲所产生的酸转化为相应的酯，根据生产的实际和测定结果，酯化红曲确有“增已降乳”的作用。

2、成熟老窖使用酯化红曲与不加酯化红曲相比出酒率下降0.8％-1.27％，成熟窖度夏压排优级品率上升3.6％，度夏压排后第二排加酯化红曲优级品率上升4.16％.

3、酯化红曲应根据季节糟醅的理化指标，窖池的微生物群落和酯化红曲的协同作用采取隔排使用，特别是对度夏压排后第三排双轮底使用效果明显，酯化红曲在高温、高酸条件下调节窖池微生物的生存环境延缓微生物群体的老化，达到整个微生物的平衡.如酯化红曲对下排有一定的协同作用，度夏压排杂醇物质生成较多，而成熟窖加酯化红曲；正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、乙缩醛明显下降，酯化红曲的代谢产物就是一些与白酒质量密切相关的有机酸和醇类物质合成较多的酯类物质和形成较多的风味物质，提高酒的品质.新窖加酯化红曲；正丙醇、正丁醇、异戊醇明显高于对照，到下排正丙醇、异戊醇、仲丁醇、异丁醇明显下降。

4、酯化红曲对新窖窖泥起到一定的调节作用.在窖泥微生物功能菌的共同作用下协调酸类、醛类、醇类、酯类物质的平衡，加速新窖的驯化老熟，提高优级品率。

5.酯化红曲在生产运用中受到窖泥功能微生物、操作工艺、环境条件等诸多因素的影响，特别是酯化红曲霉的专一性等方面的进一步研究，利用现代生物技术与传统工艺相结合，形成商品化。

Claims

1.一种以保藏号为：CCTCC NO：M2011048的酯化红曲菌种制备酯化红曲的工艺，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、含有保藏号为：CCTCC NO：M2011048的酯化红曲菌种的真空冷冻管在4℃下冰箱保藏；

步骤二、试管斜面菌种制备：

一、调制培养基：蛋白胨2％、可溶性淀粉2％、麦芽浸粉2％、(NH4)₂SO₄0.1％、MgSO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、琼脂2％、自然pH；以18×180毫米试管，每管装培养基7～10ml，以棉塞封，10支试管包一捆，竖直放于铁丝框中，0.11MPa灭菌30min，冷却至50～60℃，倾制斜面，冷凝后包扎成捆；30℃培养48hr，经检查无杂菌，方可使用；

二、接种培养：

(1)、真空冷冻安瓿管转试管斜面菌种：以无菌毛细吸管将一管无菌生理盐水加入安瓿管中，搅动均匀，将菌液吸入毛细吸管，接入斜面试管中；30℃培养3～5天，转接活化2到3代，30℃培养8～10天，置冰箱4℃保存备用；

(2)、斜面试管菌种转接：取一斜面试管种，以75％酒精溶液擦试干净，于超净台内、在酒精灯火焰上以无菌竹签接入20～30支试管斜面；培养与保存方法与所述真空冷冻安瓿管转试管斜面菌种相同；

步骤三、液体三角摇瓶菌种制备：

一、培养基：米粉、葡萄糖4％、NaNO₃0.2％、MgSO₄0.1％、牛肉膏0.3％、蛋白胨0.8％、酵母膏0.5％、pH5.0；以500ml容量三角瓶装量为100ml，将米粉分别称量装，无机盐则统一配制溶解，再分装于各三角瓶，塞棉塞、以牛皮纸包裹；0.11MPa，灭菌30min，冷却备用；

二、接种、培养：取一试管斜面菌种，以无菌竹签，接入3～5个液体三角摇瓶培养基中，于30℃、200rpm摇床振荡培养48h，交车间验收备用；

步骤四、种子罐液体种子制备：

(1)、培养液配方：大米粉7.5％、NaNO₃0.4％、MgSO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、豆油0.1％；用75％酒精清洗待打开的视镜口，在保证种子罐正压的情况下，松开种子罐视镜，在取下视镜同时用酒精火焰圈封住视镜口，然后在火焰圈内打开三角瓶口，迅速将三角瓶内种子倒入种子罐，移开火焰圈同时，盖上视镜，封严；

(2)、培养条件及控制：转速：240rpm、温度：30～32℃、罐压：0.05～0.07MPa、空气流量：8～10m³/hr、培养时间：48小时；

步骤五、发酵培养：

原料配方：麸皮∶玉米粉∶谷壳6∶3∶1，玉米使用前应先进行粉碎；将润水后的原料在125℃的温度下蒸30min；

步骤六、接种：将菌种打入已消毒的盛装菌种的容器，接原料量20％的菌种；在菌种中加入原料量0.1％的食品级冰醋酸或食品级乳酸混匀后开始接种；保证20％的接种量与接种后物料的均匀性；接种后水分要求控制在40～45％；

步骤七、打堆：用布料车将接好种的物料堆于曲池中部，扒成方堆，厚度为35～40cm，将四周的物料收拢，当环境温度低于25℃要注意物料的保温，将温度探头插入曲堆中部，注意校对仪表显示温度与标准温度计的差值；室温控制在20～30℃；堆料温度在15～24小时内升至48℃；

步骤八、摊堆养花：当曲池物料中心部位品温升至48℃时将全池物料彻底翻拌一遍，再次打堆，堆厚20～30cm，当物料的中心部位品温再次升至45℃时，再将全池物料彻底翻拌一遍后，摊满全池堆，保持品温控制在35～38℃直至加一水；养花期间通过翻曲来保证物料温度；养花期间要求每间隔3～4小时彻底翻料一次；

步骤九、加水：保持物料水分40％～45％，室温在20～25℃，培养3天；

步骤十、出池烘干：烘干过程要严格控制物料的烘干温度，要求不超过60℃；

步骤九中的所述加水是指：

步骤一、加一水，养花整齐，物料水分低于35％后少量多次加一水，并且要保证加水后物料的均匀性，加水后水分要求保持在40～45％；加水方法：加水管上加喷头，边加水，边翻料，视曲料松散、干湿情况，重复上述步骤，直至加水后物料含水均匀，水分在40％～45％之间；要求加水完毕后物料湿润、捏之不结团，松开后物料疏松散开；品温控制：加一水后控制品温32℃-34℃；

步骤二、加二水：视物料的生长情况确定加二水的时间，在加一水后10小时，物料水分低于40％后加二水，加水方法同前；加水后水分控制在40％～45％，品温控制在32℃，并注意此阶段低温不得低于30℃，高温不得超过34℃；加水一定要保持物料水分的均匀性，以免物料干湿不匀造成品温的不均匀，导致局部烧曲；

步骤三、出池烘干前一天加水：出池前一天是否加水要根据当天水分检测结果，若水分在40％以上，则不用加水，否则适当补水，补水后水分要求不超过45％，品温控制32℃-34℃。